冷雪芹 賈慧瓊 陳文霞 李慧娥 曹春莉 蘇秉忠

·論著·

C-myc、PTEN、p33/ING1和P-gp/MDR1在食管鱗狀細胞癌中的表達和意義

冷雪芹1賈慧瓊1陳文霞2李慧娥2曹春莉1蘇秉忠1

目的研究C-myc、PTEN、p33/ING1和P-gp/MDR1在食管鱗癌中的表達與臨床病理特點的關(guān)系。方法采用熒光定量PCR法檢測60例食管鱗癌患者的食管鱗癌組織、癌旁組織和正常食管組織中c-myc、PTEN、p33/ING1和P-gp/MDR1的表達水平。分析它們在食管鱗癌浸潤、分化、轉(zhuǎn)移時表達的差異性及其相關(guān)性。結(jié)果C-myc和P-gp/MDR1在正常食管組織、癌旁組織、食管鱗癌組織中的表達逐漸升高（P＜0.05）。PTEN和p33/ING1在正常食管組織、癌旁組織、食管鱗癌組織中的表達逐漸降低（P＜0.05）。C-myc在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化、浸潤深的食管鱗癌組織中的表達高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。PTEN和p33/ING1在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化、浸潤深的食管鱗癌組織中的表達低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。P-gp/MDR1的陽性表達與食管鱗癌組織的分化程度、浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論C-myc和PTEN的協(xié)同作用共同參與了食管鱗癌的發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移。聯(lián)合檢測癌基因c-myc、抑癌基因PTEN，p33/ING1和P-gp/MDR1基因在食管鱗癌組織中的表達可能為臨床診斷病情發(fā)展程度、化療治療療效、預(yù)后等提供指導(dǎo)意義。

食管鱗狀細胞癌；c-myc；PTEN；p33/ING1；P-gp/MDR1

食管癌是嚴重損害人類健康的癌癥之一，有研究發(fā)現(xiàn)，原癌基因的激活、抑癌基因的失活、細胞凋亡調(diào)控基因的失調(diào)及腫瘤對化療藥物產(chǎn)生耐藥是許多腫瘤的發(fā)生機制及聯(lián)合化療失敗的主要原因之一。本研究通過聯(lián)合檢測癌基因c-myc、PTEN、抑癌基因p33/ING1和P-gp/MDR1在食管鱗癌手術(shù)切除標本的癌灶、癌旁組織和正常食管黏膜中的表達，對其分級分化轉(zhuǎn)移的相關(guān)性進行研究，并探討它們相互之間的關(guān)系及作用機制，以期尋求食管鱗癌癌變過程的重要分子靶點，從而為食管鱗癌在基因水平的診斷和治療提供思路。

材料和方法

一、實驗標本

選擇內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2010年8月至2011年6月期間的胸外科食管鱗癌手術(shù)后大體標本60例，全部患者術(shù)前均未行放療、化療等治療，其中男性50例，女性10例，年齡在41～75歲，平均59.87歲，每例標本分別在癌組織、癌旁食管組織（距離癌腫組織邊緣3 cm以內(nèi)）及正常食管組織（距離癌腫組織邊緣5 cm以外）分別取材。依據(jù)術(shù)后病理回報判斷食管鱗癌分化程度及浸潤深度，依據(jù)術(shù)后清掃的淋巴結(jié)病理回報來判斷是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者32例，淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移者28例，分化程度：高分化23例，中分化20例，低分化17例。浸潤深度：淺層組（癌組織限于黏膜層或黏膜下層或淺肌層）14例，深層組（癌組織侵及深肌層或外膜層）46例。

二、主要試劑

Trizal試劑盒，上海生工生產(chǎn)。PrimeScriptRRT reagent Kit With gDNA Ereser（PerfectReal Time）試劑盒和SYBRRPremix Ex TaqTMII（Perfect Real Time）熒光定量均由寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)。

三、方法

1.提取總RNA。

2.測定RNA純度和含量。

3.合成cDNA。

4.PCR擴增。

5.PCR產(chǎn)物的凝膠電泳和掃描。

6.熒光定量PCR檢測C-myc、PTEN、p33/ ING1和P-gp/MDR1基因表達。

7.記錄結(jié)果

每份標本以C-myc、PTEN、p33/ING1和P-gp/ MDR1基因和內(nèi)參基因各重復(fù)3孔，求出3復(fù)孔檢測循環(huán)閾值（Ct）的平均值，最后用2-△Ct=2-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）作為評價C-myc、PTEN、p33/ING1和P-gp/MDR1基因表達水平指標，同時做空白孔對照，質(zhì)控監(jiān)測，保證試驗準確性。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，免疫組化所得結(jié)果為計數(shù)資料，采用χ2檢驗；熒光定量PCR結(jié)果為計量資料，采用t檢驗和方差分析進行統(tǒng)計；相關(guān)性檢驗用Pearson列聯(lián)系數(shù)相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、c-myc、PTEN、p33/ING1和P-gp/MDR1 mRNA在食管正常組織、癌旁組織和食管鱗癌組織中的表達水平及與食管鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1、2。

二、c-myc、PTEN、p33/ING1和P-gp/MDR1 mRNA在食管正常組織、癌旁組織和食管鱗癌組織中的表達見圖1-8。

三、食管鱗癌組織中c-myc、PTEN、p33/ING1和P-gp/MDR1表達的相關(guān)性

食管鱗癌組織Pearson相關(guān)性分析c-myc與PTEN基因呈負相關(guān)表達（r=-0.306，P＜0.05）；P-gp/ MDR1與P33/ING1基因表達呈負相關(guān)（r=-0.309，P＜0.05）。

討論

研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展是多種癌基因的激活[1-3]、抑癌基因的抑制或缺失共同作用[4]的結(jié)果，腫瘤多藥耐藥性（MDR）是腫瘤化療失敗的最大障礙。本研究通過分析癌基因c-myc、抑癌基因PTEN、抑癌基因p33/ING1和P-gp/MDR1在食管鱗癌患者各種臨床病理特征中表達的相互關(guān)系，探討癌基因c-myc、抑癌基因PTEN、抑癌基因p33/ ING1和P-gp/MDR1在食管鱗癌中表達的意義及相互關(guān)系，為臨床治療和延緩食管鱗癌患者病情發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

表1 c-myc、PTEN、p33/ING1和P-gp/MDR1 mRNA在食管正常組織、癌旁組織、鱗癌組織的表達（x±s）

表2 c-myc、PTEN、p33/ING1和P-gp/MDR1 mRNA在食管鱗癌組織中的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系（x±s）

一、c-myc表達與食管鱗癌的關(guān)系

C-myc基因為細胞癌基因，它在DNA合成、細胞分化、調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡和調(diào)控細胞周期中均起到重要作用。依據(jù)本實驗研究結(jié)果及分析可以得出，c-myc的異常表達在食管鱗癌的發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移中，都起到至關(guān)重要的作用。C-myc可能通過基因擴增、過表達、與其它基因的共同作用等機制致組織癌變。C-myc導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生可能通過以下幾條途徑：①C-myc的異常表達可下調(diào)p27蛋白水平[5]，也可激活Cullin基因，促進SCF對p27的泛素化降解，降低p27蛋白水平，p27蛋白可以通過抑制細胞周期素依賴性蛋白激酶來抑制細胞周期，阻止腫瘤形成，它的降低促進腫瘤細胞的增殖；②C-myc基因異常激活后，通過其轉(zhuǎn)錄目標mimitin基因[6]，激活食管鱗癌細胞的增殖；③C-myc通過定位DNA合成點及與復(fù)制前復(fù)合體相結(jié)合，能夠控制DNA復(fù)制；當失控時，同一機制也許還能引起DNA損傷和不正確的細胞增殖，從而引起癌癥的發(fā)生[7]。以上途徑可能單獨、協(xié)同或共同引起食管鱗癌的發(fā)生，或許還有其他未知途徑，需要我們不斷探索。

二、PTEN表達與食管鱗癌的關(guān)系

PTEN基因在正常情況下抑制細胞過度生長，誘導(dǎo)細胞凋亡。當PTEN突變或失活時，機體細胞的正常凋亡過程受到抑制，細胞無限制生長，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。本實驗研究結(jié)果表明，在腫瘤惡性程度增高、浸潤能力增強過程中，PTEN的抑制作用逐漸喪失。PTEN通過多種途徑來參與調(diào)控細胞的代謝、生長、凋亡、惡變行為，如生長因子的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)--P13K/Akt信號途徑[8-9]、MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[10]等。PTEN基因的異常表達還可能會導(dǎo)致PIP3通路不正常激活，從而使細胞無限制生長，同時可促進血管內(nèi)皮因子形成，使血管內(nèi)皮細胞增殖和腫瘤微血管形成，從而使腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力增高[11]Ghita C等[12]研究認為PTEN通過其脂質(zhì)磷酸酶活性調(diào)節(jié)局灶聚集黏附激酶和SHC磷酸化對細胞與細胞間的粘附作用、細胞與細胞外基質(zhì)的降解作用進行有效的調(diào)節(jié)，從而多方面調(diào)節(jié)腫瘤的生物學(xué)功能。PTEN/P53/ MDM2信號通路原癌蛋白MDM2被鑒定為PTEN/ PI3K/AKT的下游分子，PTEN可以抑制AKT磷酸化，從而AKT不能從細胞漿進入細胞核，進而MDM2與P53蛋白相互結(jié)合受抑，最終抑制P53轉(zhuǎn)錄激活[13]。同時，PTEN啟動子上有P53的結(jié)合位點，P53又能從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)PTEN表達。因此，PTEN、MDM2與P53形成了相互作用通路，相互協(xié)調(diào)之間的作用與功能。

三、P-gp/MDR1在食管鱗癌中的表達和意義

圖1 c-myc RT-PCR電泳圖

圖2 c-myc擴增曲線

圖3 PTEN RT-PCR電泳圖

圖4 PTEN擴增曲線

圖5 p33/ING1 RT-PCR電泳圖

圖6 p33/ING1擴增曲線

圖7 P-gp/MDR1 RT-PCR電泳圖

圖8 p-gp/MDR1擴增曲線

腫瘤多藥耐藥性（MDR）是腫瘤化療失敗的最大原因，多藥耐藥基因MDR1表達增高是影響腫瘤多藥耐藥性的主要表型，MDR1基因的編碼產(chǎn)物P-gp可使抗癌藥物泵出細胞外，使細胞內(nèi)的藥物濃度降低，從而使腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性。機制如下：當有耐藥性的細胞置于含有抗癌藥物的液體中時，大多數(shù)的脂溶性藥物將按濃度梯度進入細胞內(nèi)，此時P-gp將結(jié)合藥物分子，同時其核苷酸結(jié)合位點連上腺嘌呤核苷三磷酸，ATP水解之后釋放的能量使抗癌藥物主動地轉(zhuǎn)運到細胞外，使細胞內(nèi)側(cè)的藥物濃度始終維持比較低水平，從而使相應(yīng)抗癌藥的細胞毒作用減弱或消失，而出現(xiàn)耐藥性。本實驗結(jié)果提示該基因的表達是獨立于病理形態(tài)指標之外的分子參數(shù)，食管癌組織中存在著原發(fā)性多藥耐藥，這可能是在病情發(fā)展的過程中，腫瘤細胞的自身MDR1基因擴增的結(jié)果，無論組織分化好壞、病變早晚、大體形態(tài)如何，就從P-gp/MDR1基因表達情況來看，食管癌都有相當高耐藥機率，這很可能是多年來食管癌的化療效果不明顯的原因之一，合理選擇化療藥物尤為重要。

四、p33/ING1在食管鱗癌中的表達和意義

抑癌基因ING1主要作用是參與細胞生長的負性調(diào)節(jié)、細胞衰老和凋亡[14]。P33/ING1蛋白為ING1基因主要的翻譯產(chǎn)物。抑癌基因的功能失活的主要機制：①基因水平的改變、插入、缺失、突變和重組等；②基因的結(jié)構(gòu)正常，但其產(chǎn)物表達異常，可能在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工、蛋白降解、翻譯等的環(huán)節(jié)出現(xiàn)了異常；③雖然有正常的產(chǎn)物但不能發(fā)揮其功能，如被癌基因產(chǎn)物所結(jié)合從而封閉了功能[15-16]。本試驗結(jié)果提示，p33/ING1基因的表達與食管癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移有關(guān)；食管癌中p33/ING1基因突變存在一定比例，同時與局部基因的雜合性缺失有密切關(guān)系。

五、癌基因c-myc、抑癌基因PTEN、抑癌基因p33/ING1和P-gp/MDR1在食管鱗癌組織中表達的聯(lián)系

本實驗發(fā)現(xiàn)，食管正常組織和食管鱗癌組織中c-myc和PTEN蛋白的表達呈負相關(guān)，說明在食管鱗癌發(fā)展過程中，原癌基因c-myc被激活，導(dǎo)致細胞異常增生，而抑癌基因PTEN的負調(diào)控作用減弱甚至消失，組織無限制、無規(guī)律生長，最終發(fā)展為惡性腫瘤。二者在腫瘤形成過程中的關(guān)系，可能有以下幾點：①PTEN基因是c-myc基因的靶基因之一，c-myc的異常激活，導(dǎo)致PTEN的表達失活，二者相互作用，引起腫瘤的發(fā)生[17]。②PTEN基因可以在轉(zhuǎn)錄水平上抑制內(nèi)生性和外源性c-myc的表達[18]，當PTEN基因缺失或突變時，c-myc基因表達增加，二者協(xié)同或共同，引發(fā)癌癥。

本實驗結(jié)果顯示，p33/ING1和P-gp/MDR1基因在食管鱗癌中的表達水平呈負相關(guān)。p33/ING1在食管鱗癌中的表達顯著低于正常組織細胞，對γ射線及化療藥物和紫外線處理的敏感性也降低。然而促進p33/ING1轉(zhuǎn)錄水平升高可直接抑制腫瘤細胞的生長和阻止惡性轉(zhuǎn)化。因而誘導(dǎo)p33/ING1mRNA表達升高的方法被認為是治療食管鱗癌、白血病等惡性腫瘤的新手段。另有研究認為，MDR1基因的過量表達除了涉及到耐藥外，也是腫瘤細胞生物學(xué)行為更進一步惡化的指標[19]。因此聯(lián)合檢測食管鱗癌組織中p33/ING1和P-gp/MDR1基因表達水平，可能為判斷腫瘤惡性程度，并開展有效的治療和預(yù)后評估提供一個重要的參考指標。雖然目前對p33/ ING1基因抑制癌細胞生長方面的機制和P-gp/ MDR1基因在腫瘤耐藥性方面的機制分別較明確，但它倆在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移及耐藥方面的共同的作用環(huán)節(jié)點還不是很明確，有待進一步研究。

綜上所述可得出以下結(jié)論：①c-myc的高表達、PTEN的低表達、p33/ING1的失活和P-gp/MDR1的高表達與食管鱗癌的發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移相關(guān)；②cmyc和PTEN在食管鱗癌中表達的負相關(guān)性提示可能共同參與食管鱗癌的發(fā)展、增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移；③p33/ING1在食管鱗癌組織中表達的下降或缺失提示食管鱗狀細胞癌可能發(fā)生了浸潤甚至有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后不良。無論食管鱗癌的病變早晚、組織分化好壞及大體形態(tài)如何，從P-gp/MDR1基因表達的情況來看，食管癌都有相當高的耐藥機率，合理選擇藥物化療優(yōu)為重要。

1猶東,高平.C-myc、P53、bcl-2、CD44V6、nm23-H1基因在食管鱗癌中表達及其與預(yù)后的關(guān)系.寧夏醫(yī)學(xué)雜志,2010,32(3):206-208.

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Expression and significance of C-myc，PTEN，p33/ING1,and P-gp/MDR1 in esophageal squamous cell carcinoma

LENG Xue-qin1,JIA Hui-qiong1,CHEN Wen-xia2,LI Hui-e2,CHAO Chun-li1,SU Bing-zhong1.

1)Department of Gastroenterology,Inner Mongolia Medical University Affiliated Hospital,Hohhot 010059,China;2)Department of Gastroenterology,the First Hospital of Hohhot City,Hohhot 010010,China

ObjectiveTo explore the expression of C-myc,PTEN,p33/ING,and P-gp/MDR1 in esophageal squamous cell carcinoma and its relationship with pathological features.Methods RT-PCR method was used to detect the expression level of C-myc,PTEN,p33/ING,and P-gp/MDR1 in 60 cases of esophageal squamoue cell carcinoma,adjacent tissue,and normal esophageal mucosa.The differences and correlation of c-myc,PTEN,p33/ING,and P-gp/MDR1 expression in infiltration,division,metastasis of esophageal squamoue cell carcinoma were analyzed.Results The expression of C-myc and P-gp/MDR1 in normal esophageal tissues,adjacent tissues,esophageal squamous cell carcinoma tissues was gradually increased(P＜0.05).PTEN and p33/ING1 in normal esophageal tissues,adjacent tissues,esophageal squamous cell carcinoma tissues were significantly decreased(P＜0.05).The expression of C-myc was significantly higher in esophageal squamous cell carcinoma with lymph node metastasis,low differentiation,deep infiltration(P＜0.05).The expression of PTEN and p33/ING1was significantly lower in esophageal squamous cell carcinoma with lymph node metastasis,low differentiation,deep infiltration(P＜0.05).The positive expression rate of P-gp/MDR1with esophageal squamous cell carcinoma was not significantly different with the depth of invasion,lymph node metastasis(P＞0.05).Conclusion The synergy C-myc with PTEN might participate in the development,invasion,and metastasis of esophageal squamous cell carcinoma.Combined detection of the expression of oncogene c-myc,tumor suppressor gene PTEN,p33/ING1 P-gp/MDR1gene in esophageal squamous cell carcinoma might provide guidance to the clinical diagnosis,chemotherapy and prognosis.

Esophageal squamous cell carcinoma;c-myc;PTEN;p33/ING;P-gp/MDR1

2014-08-12）

（本文編輯：南清振）

10.3969/j.issn.1672-2159.2015.03.001

1 010059內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科；2 010010呼和浩特市第一醫(yī)院消化內(nèi)科

內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項目（2009MS1147）