夏 凱 孔華庭 崔之芬 張 瑜 潘 亮 諸 穎

1（中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所 物理生物學(xué)室生物成像中心，上海同步輻射光源 上海 201800）

2（中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 100049）

Fe3O4納米顆粒-蛋白的相互作用及生物效應(yīng)

夏 凱1,2孔華庭1,2崔之芬1張 瑜1,2潘 亮1,2諸 穎1

1（中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用物理研究所 物理生物學(xué)室生物成像中心，上海同步輻射光源 上海 201800）

2（中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 100049）

研究了在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的Fe3O4納米顆粒與多種蛋白（包括白蛋白、纖維蛋白和免疫球蛋白等）的相互作用及其生物學(xué)效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Fe3O4納米顆粒與蛋白的相互作用存在蛋白種類選擇性，對(duì)蛋白的吸附能力由強(qiáng)到弱依次為纖維蛋白＞免疫球蛋白＞白蛋白。形成的Fe3O4納米顆粒-蛋白復(fù)合物有效地降低了納米顆粒的細(xì)胞毒性。

Fe3O4納米顆粒，蛋白，吸附，選擇性，細(xì)胞毒性

眾所周知，生命體系富含多種蛋白，納米顆粒由于小尺寸、大比表面積和高的吸附活性，很容易和生命體系中的各種蛋白分子發(fā)生相互作用，形成納米顆粒-蛋白復(fù)合物[9–13]。因此，在Fe3O4納米顆粒的生物安全性評(píng)估中，首先研究其和生命體系中多種蛋白的相互作用及生物效應(yīng)具有十分重要的意義。

本工作以粒徑為5nm的Fe3O4為研究對(duì)象，研究其和多種蛋白包括白蛋白、纖維蛋白和免疫球蛋白等的相互作用，并考察納米顆粒-蛋白復(fù)合物的細(xì)胞攝取和生物相容性，研究結(jié)果為其更好地應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域打下了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

粒徑為5 nm的 Fe3O4納米顆粒購(gòu)于杭州納晶科技股份有限公司，儲(chǔ)存濃度為5mg·mL?1。表面修飾羧基(–COOH)，在水中及培養(yǎng)基中的分散性良好，室溫避光保存。

白蛋白、纖維蛋白和免疫球蛋白購(gòu)于sigma-aldrich西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑嗅鹽(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazo lium bromide, MTT)、十二烷基磺酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfonate, SDS)購(gòu)自Sigma上海公司；Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA)培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素、0.25% EDTA (Eathylene Diamine Tetraacetic Acid)胰蛋白酶、谷氨酰胺購(gòu)自Life technologies上海公司；10×磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline, PBS)、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfonate-Polyacrylamide Gelelectrophoresis)凝膠配制試劑盒、考馬斯亮藍(lán)快速染色液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；超薄鍍碳支持膜購(gòu)于中鏡科儀南京公司。

安全頭盔的顏色設(shè)計(jì)十分重要，因?yàn)樯屎腿藗兊那榫w有很大的聯(lián)系。在日常生活中，色彩的效果主要是，一加深視覺上的外觀感染力；二增強(qiáng)人們對(duì)產(chǎn)品的認(rèn)知及記憶；三影響人們的情緒及內(nèi)心情感[5]。在交通道路上，因?yàn)轭伾鸬氖鹿什辉谏贁?shù)。澳大利亞莫納什大學(xué)有過相關(guān)研究，通過分析了八十五萬起的交通事故記錄，發(fā)現(xiàn)了黑色的汽車在白天和黑夜發(fā)生事故的概率都遠(yuǎn)遠(yuǎn)地高于其他顏色的車輛。不只是莫納什大學(xué)有過研究，很多團(tuán)隊(duì)都有相關(guān)的調(diào)查，調(diào)查的結(jié)果都指向了黑色的汽車發(fā)生事故的概率更大。顏色與事故發(fā)生率之間有什么關(guān)系呢？通常來說，有兩個(gè)原因。一是顏色帶來的心理效應(yīng)，二是各種環(huán)境下顏色的視認(rèn)性[6]。

1.2 主要儀器

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(3423)：Thermo Scientific；高速離心機(jī)(CT 15RE)：Hitachi；超純水儀(Advantage A10)：Millipore；熒光酶標(biāo)儀(Synergy H1)：Biotek；倒置明場(chǎng)顯微鏡(CKX41)：Olympus。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 Fe3O4納米顆粒及Fe3O4納米顆粒-蛋白復(fù)合物的電鏡表征

Fe3O4納米顆粒以10μg·mL?1的濃度分散于超純水中，超聲30min使之分散均勻。2mg·mL?1的Fe3O4納米顆粒與1mg·mL?1的蛋白等體積混勻，25 °C孵育過夜，15 000r·min?14 °C離心30min，收集沉淀。將沉淀以10μg·mL?1的濃度重懸于超純水中，超聲30min使其分散均勻。將Fe3O4納米顆粒、Fe3O4納米顆粒-蛋白復(fù)合物滴于超薄碳膜上，用透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope, TEM)進(jìn)行觀察。

2.2 Fe3O4納米顆粒與蛋白的相互作用

2mg·mL?1的Fe3O4納米顆粒與1mg·mL?1的蛋白等體積混勻，25 °C孵育過夜。15 000r·min?1轉(zhuǎn)速，4°C離心30min，收集上清。上清液用蛋白上樣緩沖液(2×)稀釋，95°C 10min煮沸變性后SDS-PAGE電泳（SDS-PAGE濃度為12%，電泳條件為20mA，2h）?？捡R斯亮藍(lán)染色30min，脫色后于成像儀中觀察蛋白條帶。另外，上清液用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒定量檢測(cè)蛋白含量。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人宮頸癌細(xì)胞（HeLa細(xì)胞），購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。將HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，加有100μg·mL?1的鏈霉素，100U·mL?1的青霉素，4mmol·L?1的谷氨酰胺，4.5mg·mL?1的葡萄糖，10%熱滅活胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)。細(xì)胞培養(yǎng)于5% CO2和37 °C恒溫恒濕培養(yǎng)箱中。每?jī)商爝M(jìn)行一次細(xì)胞傳代，從而保持細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)。

2.4 Fe3O4納米顆粒的細(xì)胞毒性評(píng)估

將HeLa細(xì)胞種于24孔板中，每孔細(xì)胞密度為105，貼壁過夜。吸去培養(yǎng)基，用PBS緩沖溶液漂洗兩遍，每孔中加入一定量有血清或無血清培養(yǎng)基分散的Fe3O4納米顆粒，F(xiàn)e3O4納米顆粒終濃度為50μg·mL?1、100μg·mL?1、150μg·mL?1、200μg·mL?1、250μg·mL?1、300μg·mL?1、350μg·mL?1和400μg·mL?1。分別以不加納米顆粒的有血清或無血清培養(yǎng)基作為對(duì)照。24h后，使用PBS緩沖溶液漂洗三次，每孔加入440μL新鮮培養(yǎng)基與60μL MTT（終濃度為0.6mg·mL?1），繼續(xù)孵育4h至產(chǎn)生紫色甲瓚結(jié)晶，每孔加入500μL的酸化SDS溶液(pH 3.0–4.0)，孵育至紫色甲瓚結(jié)晶溶解。酶標(biāo)儀測(cè)OD 570nm吸光值。細(xì)胞存活率的計(jì)算為：細(xì)胞存活率(%)=（實(shí)驗(yàn)組OD值?空白組OD值）/（對(duì)照組OD值?空白組OD值）×100%。

2.5 光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞攝取Fe3O4納米顆粒-蛋白復(fù)合物

2mg·mL?1的Fe3O4納米顆粒與1mg·mL?1的三種蛋白等體積混勻，25 °C孵育過夜，使Fe3O4納米顆粒和蛋白質(zhì)充分吸附，15000 r·min?14 °C 離心30min，沉淀用PBS緩沖液洗滌三遍，得到Fe3O4納米顆粒-蛋白復(fù)合物。

HeLa細(xì)胞用24孔板培養(yǎng)，密度為105細(xì)胞/孔種板，貼壁過夜。將Fe3O4納米顆粒和Fe3O4納米顆粒-蛋白復(fù)合物分散于無血清培養(yǎng)基中，各組中納米顆粒的終濃度均為200μg·mL?1，混勻置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。PBS洗滌三次除去細(xì)胞表面及培養(yǎng)板中游離的Fe3O4納米顆粒和Fe3O4納米顆粒-蛋白復(fù)合物，每孔加入1mL PBS緩沖液，使用倒置光學(xué)顯微鏡(200×)觀察。

2.6 Fe3O4納米顆粒-蛋白復(fù)合物的細(xì)胞毒性評(píng)估

Fe3O4納米顆粒和Fe3O4納米顆粒-蛋白復(fù)合物與細(xì)胞的孵育過程同上，孵育結(jié)束后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，方法同§2.4。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 Fe3O4納米顆粒對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性效應(yīng)

TEM結(jié)果顯示(圖1)，實(shí)驗(yàn)所用Fe3O4納米顆粒平均粒徑為5nm，顆粒大小均一，無雜質(zhì)。對(duì)Fe3O4納米顆粒的細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)估(圖2)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)顆粒濃度低于100μg·mL?1時(shí)，無論培養(yǎng)基中是否含有血清，均顯示很好的生物相容性。當(dāng)濃度高于150μg·mL?1時(shí)，納米顆粒對(duì)細(xì)胞具有濃度依賴的毒性效應(yīng)。有意思的是，納米顆粒分散在有血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞毒性顯著低于其分散在無血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞毒性。例如，當(dāng)Fe3O4納米顆粒濃度為200μg·mL?1時(shí)，無血清培養(yǎng)基分散的納米顆粒和細(xì)胞孵育后存活率為33.7%，有血清培養(yǎng)基分散的納米顆粒和細(xì)胞孵育后存活率為76.9%，后者是前者的兩倍多。

圖1 Fe3O4納米顆粒透射電鏡成像圖Fig.1 TEM image of Fe3O4 nanoparticles.

圖2 含或不含血清培養(yǎng)液中Fe3O4納米顆粒對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性*р＜ 0.05；**р＜ 0.01；單因素ANOVA (Analysis of Variance)分析用于顯著性分析Fig.2 Cytotoxicity of Fe3O4 nanoparticles dispersed in culture medium with or without FBS. *р＜ 0.05; **р＜ 0.01; one-way ANOVA for comparison

3.2 Fe3O4納米顆粒與蛋白的相互作用

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e3O4納米顆粒和蛋白孵育后，對(duì)各種蛋白均有一定吸附。TEM成像(圖3)可見各種蛋白包裹在Fe3O4納米顆粒表面，形成了透明的蛋白冠，圖3中黑色箭頭指示蛋白冠。

圖3 Fe3O4納米顆粒-蛋白復(fù)合物的透射電鏡成像圖(a) Fe3O4-白蛋白復(fù)合物，(b) Fe3O4-免疫球蛋白復(fù)合物，(c) Fe3O4-纖維蛋白復(fù)合物Fig.3 TEM images of Fe3O4 nanoparticle-protein complexes.(a) Fe3O4-albumin complex, (b) Fe3O4-immunoglobulincomplex, (c) Fe3O4-fibrinogen complex

Fe3O4納米顆粒與蛋白作用后，分別用SDS-PAGE蛋白電泳和Bradford蛋白濃度定量法對(duì)上清蛋白濃度進(jìn)行半定量和定量檢測(cè)。SDS-PAGE蛋白電泳結(jié)果顯示（圖4(a)，第1、3、5泳道分別為吸附前總的白蛋白、免疫球蛋白和纖維蛋白；第2、4、6泳道分別為吸附后上清中的白蛋白、免疫球蛋白和纖維蛋白），F(xiàn)e3O4納米顆粒對(duì)纖維蛋白吸附最多，其次是免疫球蛋白，最少的是白蛋白。Bradford法定量分析顯示(圖4(b))，每毫克Fe3O4納米顆粒吸附白蛋白、免疫球蛋白、纖維蛋白的量分別為0.023mg、0.21mg和0.44mg，和蛋白電泳結(jié)果一致。

圖4 Fe3O4納米顆粒對(duì)不同蛋白的吸附(a) SDS-PAGE蛋白電泳分析，(b) Bradford蛋白濃度定量分析Fig.4 Adsorption amounts of various kinds of proteins on Fe3O4 nanoparticles.(a) SDS-PAGE analysis, (b) Bradford analysis

3.3 Fe3O4納米顆粒-蛋白復(fù)合物的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)

Fe3O4納米顆粒-蛋白復(fù)合物和HeLa細(xì)胞孵育24h后，倒置光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果顯示各種Fe3O4納米顆粒-蛋白復(fù)合物均能被攝取進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)(圖5)。進(jìn)一步評(píng)估各種Fe3O4納米顆粒-蛋白復(fù)合物的生物相容性。MTT測(cè)定結(jié)果顯示，200μg·mL?1的裸露的Fe3O4納米顆粒和細(xì)胞孵育24h后，細(xì)胞存活率僅為33.7%，而相同濃度的Fe3O4-白蛋白和細(xì)胞孵育24h后，細(xì)胞存活率上升為76.9%，F(xiàn)e3O4-免疫球蛋白、Fe3O4-纖維蛋白復(fù)合物和細(xì)胞孵育后，存活率均超過了90%(圖6)，可見Fe3O4納米顆粒上吸附的蛋白有效地降低了納米顆粒的細(xì)胞毒性，并且毒性減弱的程度和納米顆粒吸附蛋白的量有一定的相關(guān)性。

圖5 Fe3O4納米顆粒和Fe3O4納米顆粒-蛋白復(fù)合物與Hela細(xì)胞孵育后光學(xué)顯微成像圖(a) Fe3O4納米顆粒，(b) Fe3O4-白蛋白復(fù)合物，(c) Fe3O4-免疫球蛋白復(fù)合物，(d) Fe3O4-纖維蛋白復(fù)合物Fig.5 Optical microscope images of HeLa cells after incubation with Fe3O4 nanoparticles and various kinds Fe3O4 nanoparticle-protein complexes. (a) Fe3O4 nanoparticles, (b) Fe3O4-albumin complex, (c) Fe3O4-immunoglobulin complex, (d) Fe3O4-fibrinogen complex

圖6 Fe3O4和蛋白相互作用對(duì)細(xì)胞毒性的影響*р＜ 0.05；**р＜ 0.01；單因素ANOVA 分析用于顯著性分析Fig.6 Effect of proteins on the cytotoxicity of Fe3O4 nanoparticles. *р＜ 0.05; **р＜ 0.01; one-way ANOVA for comparison

4 討論

納米顆粒的生物安全性研究是一個(gè)十分重要的課題。本工作以粒徑為5nm的Fe3O4納米顆粒為研究對(duì)象，評(píng)估了其對(duì)HeLa細(xì)胞的毒性效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道相一致[7?8]，該顆粒在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞具有良好的生物相容性。但是，實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)顆粒濃度高于150μg·mL?1時(shí)，其對(duì)細(xì)胞具有濃度依賴的毒性效應(yīng)，且無血清培養(yǎng)基分散的納米顆粒的細(xì)胞毒性顯著高于有血清培養(yǎng)基分散的納米顆粒的細(xì)胞毒性。

我們進(jìn)一步對(duì)機(jī)制進(jìn)行了分析。實(shí)驗(yàn)中選取了血清中三種代表性的蛋白包括白蛋白、免疫球蛋白和纖維蛋白，研究了納米顆粒和蛋白的相互作用，發(fā)現(xiàn)納米顆粒對(duì)各種蛋白均有一定吸附，根據(jù)蛋白種類不同，吸附量也不同。該納米顆粒對(duì)各種蛋白吸附能力由高到低依次為纖維蛋白＞免疫球蛋白＞白蛋白。形成的Fe3O4納米顆粒-蛋白復(fù)合物有效地降低了納米顆粒的細(xì)胞毒性，且毒性減弱的程度和吸附的蛋白的量有一定的相關(guān)性。我們知道，胎牛血清中富含白蛋白、免疫球蛋白、纖維蛋白等多種蛋白，因此當(dāng)納米顆粒分散在含血清的培養(yǎng)基中時(shí)，血清蛋白的包裹能很好地改善納米顆粒對(duì)細(xì)胞的生物相容性。

Fe3O4納米顆粒在成像、藥物輸運(yùn)、核磁共振成像、熱療等生物醫(yī)藥領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[14?15]。并且，在體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，常需要使用較高的納米顆粒濃度而達(dá)到良好的生物學(xué)效果。該工作的結(jié)果為進(jìn)一步設(shè)計(jì)安全的納米成像試劑或納米載體用于藥物輸運(yùn)提供了有用的信息。

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CLC TL99, Q67

Fe3O4nanoparticle-protein interactions and their bioeffects

XIA Kai1,2KONG Huating1,2CUI Zhifen1ZHANG Yu1,2PAN Liang1,2ZHU Ying1

1(Division of Physical Biology and Bioimaging Center, Shanghai Synchrotron Radiation Facility, Shanghai Institute of Applied Physics, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201800, China)
2(University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Background: Fe3O4nanoparticles have wide applications in biomedical researches. Purpose: The aim is to study the Fe3O4nanoparticle-protein interactions and their bioeffects. Methods: Transmission electron microscope (TEM), light microscopy, SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfonate-Polyacrylamide Gelelectrophoresis), Bradford and MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide) methods were used to investigate the Fe3O4nanoparticle-protein interactions and their bioeffects. Results: The adsorption capacities of Fe3O4nanoparticle for different proteins were different, and the order was fibrinogen＞immunoglobulin＞albumin. The adsorption of proteins on the Fe3O4surface resulted in much reduced cytotoxicity for these protein-coated Fe3O4nanoparticles. Conclusion: These findings suggest that we should take the Fe3O4nanoparticle-protein interactions into consideration when designing safe Fe3O4nanoparticles for biomedical applications.

Fe3O4nanoparticle, Protein, Adsorption, Selectivity, Cytotoxicity

TL99，Q67

10.11889/j.0253-3219.2015.hjs.38.050501

項(xiàng)目(No.11275251、No.U1232113)、上海市青年科技啟明星計(jì)劃(No.14QA1404400)資助

夏凱，女，1989年出生，2012年畢業(yè)于安徽師范大學(xué)，現(xiàn)為碩士研究生

諸穎，E-mail: zhuying@sinap.ac.cn

2015-01-19，

2015-02-11