劉聰
(中國農(nóng)業(yè)大學(xué),北京 100094)
小熊貓卵巢肥大細(xì)胞與雌性生殖干細(xì)胞的初步觀察
劉聰
(中國農(nóng)業(yè)大學(xué),北京 100094)
肥大細(xì)胞分布于皮膚及內(nèi)臟粘膜下的微血管周邊,其與嗜堿性細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能相似。此次研究中選取17只成體小熊貓卵巢進(jìn)行研究,將其制成組織切片,并采用甲苯胺藍(lán)進(jìn)行染色,觀察不同時(shí)期肥大細(xì)胞數(shù)量變化情況,研究結(jié)果顯示,不同時(shí)期小熊貓卵巢肥大細(xì)胞數(shù)量對比存在顯著差異,P<0.05;采用免疫組化染色,卵巢中存在組胺陽性細(xì)胞,小鼠脈管同系物(MVH)在卵母細(xì)胞和生殖上皮中呈現(xiàn)陽性,說明小熊貓卵巢中有雌性生殖肝細(xì)胞存在,且肥大細(xì)胞與參與小熊貓生殖過程。
小熊貓;卵巢肥大細(xì)胞;雌性生殖干細(xì)胞
肥大細(xì)胞能分泌多種細(xì)胞因子,且能參與免疫過程,具有若吞噬功能。相關(guān)研究中對發(fā)情前期大鼠和倉鼠進(jìn)行研究,研究結(jié)果顯示,卵巢肥大細(xì)胞參與卵巢功能,在不同發(fā)情周期中數(shù)量不同差異性。而近年來,相關(guān)研究結(jié)果顯示,成年哺乳動(dòng)物卵巢中存在雌性生殖干細(xì)胞。因此此次研究中以成年小熊貓卵巢組織切片作為研究對象,研究肥大細(xì)胞與不同生理期之間的關(guān)系,總結(jié)小熊貓卵巢中肥大細(xì)胞雌性生殖干細(xì)胞之間的聯(lián)系,為臨床研究小熊貓生殖過程提供更多參考?,F(xiàn)將具體研究內(nèi)容進(jìn)行報(bào)道。
1.1 材料
1.1.1 動(dòng)物選取我市某動(dòng)物園17只死亡雌性小熊貓作為研究對象,其死亡原因均為非生殖系統(tǒng)疾病。取小熊貓卵巢制成組織切片,包括5例發(fā)情期,6例妊娠期,6例發(fā)情期。
1.1.2 試劑使用試劑包括上海化學(xué)試劑廠生產(chǎn)的甲苯胺藍(lán)、Alcian Blue 8GX(阿爾新藍(lán))、Safranine O(番紅花紅),上海古朵生物科技有限公司生產(chǎn)的鼠抗組胺抗體、兔抗小鼠IgG1、鼠抗MVH抗體。
1.2 方法
1.2.1 樣品制作將小熊貓卵巢進(jìn)行組織切片,形成1.5cm×1.5cm×0.5cm的組織切塊,將組織切片放入福爾馬林(40mL/L)中浸泡4h,保存溫度為4℃。依據(jù)組織學(xué)技術(shù)制成半連續(xù)石蠟切片,厚度5μm。
1.2.2 染色將組織切片放于固定液,使用甲苯胺藍(lán)進(jìn)行染色。將石蠟切片脫蠟,呈水狀后使用甲苯胺藍(lán)浸泡,30s后使用雙蒸水洗,水洗2次后使用乙醇(950mL/L)分色,使用顯微鏡觀察,分色完成標(biāo)準(zhǔn)為肥大細(xì)胞出現(xiàn)紫紅色顆粒。將分色完成的組織切片使用乙醇脫水,放入二甲苯,封片。進(jìn)行AB-S脫色時(shí),將切片進(jìn)行脫蠟,使用pH1.42醋酸鈉鹽酸緩沖液(含3.6g/L阿爾新藍(lán)8GX、0.18g/L番紅花紅O)染色,30min后經(jīng)乙醇脫水,放入二甲苯,封片。
1.2.3 免疫組化染色將切片脫蠟,放入過氧化氫室(30mL/L)10min滅活,放入正常山羊血清(50mL/L)培養(yǎng),30min后取出,放入pH7.0磷酸buffer液(鼠抗組胺抗體1:400/鼠抗MVH抗體、tritonX-100 0.2mL/L、bsat 0.1mL/L)孵育,保持4℃,使用PBS進(jìn)行漂洗,室溫下將兔抗小鼠IgG1孵育1h,室溫下在過氧化物酶、生物素、抗生物素蛋白中孵育1h。使用PBS沖洗3次,使用蘇木素再次染色,脫水后封片。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
按不同生理期將切片分組,每只小熊貓取5張切片,在顯微鏡下對切片觀察5個(gè)視野,取平均數(shù)。使用SPSS18.0軟件進(jìn)行單因素分析處理,計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)的組間比較采用t檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05時(shí)表示有顯著差異,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
發(fā)情期肥大細(xì)胞數(shù)為(11.1±0.5)個(gè),妊娠期為(4.1±0.4)個(gè),發(fā)情期為(8.4±0.3)個(gè),發(fā)情期肥大細(xì)胞數(shù)與發(fā)情期相比明顯較多,t=11.109,差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05。發(fā)情期肥大細(xì)胞數(shù)與妊娠期相比明顯較多,t=21.066,差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.05。經(jīng)AB-S染色后可將其分為結(jié)締組織型、黏膜型、混合型。經(jīng)免疫組化染色后,組胺陽性細(xì)胞在發(fā)情期時(shí)數(shù)量多,在妊娠期時(shí)數(shù)量較少,但細(xì)胞形態(tài)較大,在發(fā)情期時(shí)數(shù)量少,形態(tài)較小。小鼠脈管同系物(MVH)在卵母細(xì)胞中呈陽性,且在生殖上皮中也呈陽性。
肥大細(xì)胞是嗜堿性細(xì)胞在結(jié)締組織或粘膜中存在的一種形態(tài),其來源于造血干細(xì)胞,能參與MHC分子、B7分子表達(dá)具備APC功能;與嗜堿性細(xì)胞相同,肥大細(xì)胞具有強(qiáng)嗜堿性顆粒,其中含有肝素、組胺等物質(zhì),能引起速發(fā)過敏反應(yīng)。
肥大細(xì)胞是組胺重要來源之一,因此其能參與內(nèi)分泌腺活動(dòng)。研究結(jié)果顯示發(fā)情期肥大細(xì)胞數(shù)與發(fā)情期相比明顯較多,發(fā)情期肥大細(xì)胞數(shù)與妊娠期相比明顯較多,P<0.05。相關(guān)研究證明肥大細(xì)胞脫顆粒作用與排卵過程存在聯(lián)系,當(dāng)排卵開始時(shí),肥大細(xì)胞數(shù)將顯著減少。肥大細(xì)胞從發(fā)情期開始脫顆粒,數(shù)量顯著增加,隨生殖期變化,肥大細(xì)胞減少,脫顆粒及組胺也隨之減少,因此可以得出肥大細(xì)胞參與小熊貓生殖過程,在小熊貓生殖期中起一定調(diào)節(jié)作用。經(jīng)免疫組化染色后,在卵母細(xì)胞和生殖上皮中均發(fā)現(xiàn)雌性生殖干細(xì)胞,以往認(rèn)為哺乳動(dòng)物出生后卵母細(xì)胞不再生,這種理論對不育現(xiàn)象治療產(chǎn)生極大阻礙。此次研究結(jié)果與成年雄性哺乳動(dòng)物精元干細(xì)胞產(chǎn)生精子時(shí)期研究的相似。其證明了哺乳動(dòng)物出生后能生成新的卵母細(xì)胞,成年雄性哺乳動(dòng)物整個(gè)生命周期中精元干細(xì)胞均能產(chǎn)生精子和此次研究中成年小熊貓卵巢中雌性生殖干細(xì)胞的存在為小熊貓的繁殖過程提供了更多理論參考。
[1]修云芳,等.小熊貓卵巢肥大細(xì)胞與雌性生殖干細(xì)胞的初步觀察[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015,06:96-99.
[2]白耀富.豬卵巢源雌性生殖干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定[D].西北農(nóng)林科技大學(xué),2013.04.
[3]周勵(lì).大鼠雌性生殖干細(xì)胞建系、生物學(xué)特性研究與應(yīng)用[D].上海交通大學(xué),2014.03-05.
[4]陳忠良,等.雌性哺乳動(dòng)物生殖干細(xì)胞:在爭議中前進(jìn)[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2013,40(11):1081-1087.
10.3969/J.ISSN.1671-6027.2015.11.010
劉聰(1992~),河北省衡水市人,本科,研究方向:動(dòng)物醫(yī)學(xué)