鮑方印，肖明松，王松華，何慶元

(安徽科技學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100）

赤鏈蛇(Dinodon rufozonatum)屬爬行綱、蛇目、游蛇科，是一種國(guó)內(nèi)分布廣泛的后溝牙類毒蛇[1]。該物種已被列入中國(guó)國(guó)家林業(yè)局2000年8月1日發(fā)布的《國(guó)家保護(hù)的有益的或者有重要經(jīng)濟(jì)、科學(xué)研究?jī)r(jià)值的陸生野生動(dòng)物名錄》[2]。赤鏈蛇在臨床應(yīng)用上有治療慢性結(jié)核性瘺管的作用，藥理上有抗炎、鎮(zhèn)痛、催眠、鎮(zhèn)靜和抗驚厥作用，有一定的醫(yī)學(xué)研究?jī)r(jià)值[3]。關(guān)于赤鏈蛇的研究，早期主要集中在地理分布、生態(tài)習(xí)性、藥用價(jià)值等方面，近期深入到生理生化和分子水平，如陳壁輝報(bào)道了赤鏈蛇的棲息環(huán)境、活動(dòng)和捕食習(xí)性，蔡亞非等[4]發(fā)現(xiàn)赤鏈蛇達(dá)氏腺內(nèi)與特有取食習(xí)慣的關(guān)系，張蕾等[5]研究了赤鏈蛇的消化道中嗜銀細(xì)胞分布、細(xì)胞形態(tài)和功能，楊超等采用RT－PCR技術(shù)研究了赤鏈蛇不同組織Sox基因的表達(dá)[6]，但關(guān)于赤鏈蛇目前的資源現(xiàn)狀和遺傳多樣性的研究卻很少見(jiàn)報(bào)道。線粒體DNA(mtDNA)具有分子小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、母系遺傳、進(jìn)化速度快、幾乎不發(fā)生重組、不同區(qū)域進(jìn)化速度存在差異等特點(diǎn)，是一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的復(fù)制單位，已被廣泛地應(yīng)用于類群識(shí)別、地理隔離、起源、分化和擴(kuò)散、遺傳多樣性等領(lǐng)域[7－8]。本文利用mtDNA控制區(qū)序列對(duì)安徽省赤鏈蛇野生群體進(jìn)行遺傳分析，研究赤鏈蛇的系統(tǒng)發(fā)育和地理分布規(guī)律，為赤鏈蛇野生種群的保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

赤鏈蛇樣本14個(gè)，分別來(lái)自淮北、江淮、皖西、皖南和沿江等5個(gè)地區(qū)的6個(gè)種群，具體見(jiàn)表1。標(biāo)本采用95%乙醇固定，－20℃保存。

表1 赤鏈蛇樣本編號(hào)及采集地Table 1 Names and resources of tested samples

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定

改良苯酚氯仿抽提法，從每個(gè)樣本的肌肉組織中經(jīng)勻漿、裂解、消化提取、純化，得到基因組DNA，置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)總體積為30μL，其中含10×buffer反應(yīng)緩沖液3.0 μL，3μL dNTP(2.5mmol/L)，0.4μmol/L 引物，0.25 μL Taq酶，25ng DNA，用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足體積。94 ℃下預(yù)變性 5 min，94 ℃下變性30s，58℃下退火1min，72℃下延伸1 min，72℃下延伸10min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物在 1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果在凝膠圖像分析系統(tǒng)中拍照、保存。產(chǎn)物送往上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)得的序列用Clustal X 1.81程序[9]進(jìn)行比對(duì)，并輔以人工校對(duì)，進(jìn)行同源性比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用CLUSTALw軟件將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行對(duì)位排序，用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA4.0軟件計(jì)算不同序列間的堿基替代數(shù)、變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)、顛換百分比、轉(zhuǎn)換/顛換比率和Kimura兩參數(shù)(2 parameter)距離[13];用DNASTAR4.0軟件計(jì)算兩兩序列的遺傳相似度和序列差異百分比。通過(guò)MEGA4.0軟件構(gòu)建NJ樹(shù)，在重建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)時(shí)，去除兩兩對(duì)位序列中的缺失，應(yīng)用自舉法(Bootstrap)評(píng)估系統(tǒng)樹(shù)[11]。

2 結(jié)果

2.1 mtDNA D－Loop序列及其變異

測(cè)定了來(lái)自6個(gè)種群的14個(gè)赤練蛇樣本，結(jié)果D－Loop序列的長(zhǎng)為690bp，經(jīng)序列核對(duì)及氨基酸轉(zhuǎn)換，沒(méi)有缺失或插入。同時(shí)，在所有序列中共發(fā)現(xiàn)6個(gè)不同的單倍型(表2)。在這6個(gè)序列中，共有24個(gè)位點(diǎn)呈現(xiàn)變異，其中13個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。在所有的序列中，堿基組成的百分比中顯示了G的相對(duì)缺乏，A+T的平均含量為60.2%，而C+G的平均含量為39.8%。核苷酸堿基的變異也存在很大差異，其中T－C的轉(zhuǎn)換比A－G轉(zhuǎn)換發(fā)生的多，顛換中只有A與T之間的顛換發(fā)生，沒(méi)有A與C、C與G和G與T之間的顛換。

表2 赤鏈蛇D－Loop序列堿基組成頻率(%)Table 2 Frequencies of base composition in the D－Loop gene fragments of Dinodon rufozonatum(%)

2.2 分子系統(tǒng)樹(shù)的構(gòu)建

在Kimura雙參數(shù)距離中，所有6個(gè)單倍型間的數(shù)值在0.0016－0.1024，平均距離是0.0276。在序列差異百分比表中，所有單倍型間的數(shù)值在0.5% －0.8%，平均為0.66%，(見(jiàn)表3)。通過(guò)MEGA4.0軟件構(gòu)建NJ樹(shù)(圖1)，安徽省野生赤鏈蛇分為3個(gè)分支，皖南、皖西各一支，沿江、江淮和淮北為另一支。

表3 赤鏈蛇群體間D－Loop序列不同單倍型的雙參數(shù)距離(對(duì)角線下)和序列差異百分比(對(duì)角線上)Table 3 Kimura 2－parameter distance(below diagonal)and percent difference(above diagonal)for different hapotypes on D－Loop sequences of Dinodon rufozonatum

3 討論

6個(gè)赤鏈蛇野生種群之間的序列差異百分比在0.5%到0.8%之間，在mt DNA堿基替換中存在轉(zhuǎn)換偏奇，隨著進(jìn)化時(shí)間的增加，顛換的積累，轉(zhuǎn)換偏奇會(huì)下降;同時(shí)，一般認(rèn)為轉(zhuǎn)換顛換的比值小于2.0時(shí)，則此基因序列的突變已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)，受進(jìn)化噪音的影響可能性較大。對(duì)赤鏈蛇野生種群的研究也說(shuō)明了分歧時(shí)間越長(zhǎng)、親緣關(guān)系越遠(yuǎn)的分類單元之間，核苷酸發(fā)生顛換的頻率越高，即親緣關(guān)系較近的物種之間總是有更高的轉(zhuǎn)換差異比例;同時(shí)，赤鏈蛇野生種群之間的偏奇可能會(huì)隨著進(jìn)化時(shí)間的增加和空間隔離的加劇而下降，而它們之間的突變因受到多重替換和飽和效應(yīng)的影響而達(dá)到飽和。

一般認(rèn)為，置信水平值(BCL)高于70%的分支為可信[11]。從構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)上充分反映了皖南種群和皖西種群之間的遺傳距離最遠(yuǎn)，而淮北、江淮和沿江種群之間距離適中。所以考慮到赤鏈蛇在安徽的分布現(xiàn)狀和各地理種群的分布情況，將這6個(gè)地理種群分為3系。赤鏈蛇的遺傳分化呈現(xiàn)出地理區(qū)域上的連續(xù)性。Barber等認(rèn)為地理障礙與氣候特征的差異在種系地理學(xué)結(jié)構(gòu)的形成過(guò)程中可能起到了非常重要的作用。作者在進(jìn)行安徽省的赤鏈蛇資源現(xiàn)狀調(diào)查時(shí)參考陳壁輝等對(duì)安徽地理分布區(qū)的劃分，采集的標(biāo)本包括淮北、江淮、沿江、皖西和皖南5個(gè)地區(qū)，但江淮地區(qū)選取了蚌埠荊山和滁州皇甫山的標(biāo)本，雖然同屬一個(gè)地理區(qū)劃，但種群之間也出現(xiàn)了差異。沿江江北、皖南、皖西3系的分化與山脈形成的地理隔離有關(guān)。而長(zhǎng)江與淮河的隔離作用不大，遷徙能力較強(qiáng)的赤鏈蛇進(jìn)入同一地域中可能發(fā)生一定的基因交流。同時(shí)，隨著經(jīng)濟(jì)、交通的發(fā)展和偷獵走私的日益猖獗，使爬行動(dòng)物有機(jī)會(huì)進(jìn)入其他分布區(qū)，也進(jìn)一步導(dǎo)致了各個(gè)地理種群遺傳結(jié)構(gòu)的變化。

[1]趙爾宓，黃美華，宗愉.中國(guó)動(dòng)物志(爬行綱，第三卷)[M].北京:科學(xué)出版社，1998.

[2]國(guó)家林業(yè)局.國(guó)家保護(hù)的有益的或者有重要經(jīng)濟(jì)、科學(xué)研究?jī)r(jià)值的陸生動(dòng)物名錄[J].野生動(dòng)物，2000，21(5):49－82

[3]陳仁壽.淺析《本草綱目》蛇的藥用[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2000，16(5):309－310

[4]蔡亞非，劉兆斌，張利軍，等.赤鏈蛇達(dá)氏腺內(nèi)分泌細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)[J].解剖學(xué)雜志，2004，27(2):184－187.

[5]張蕾，李淑蘭.赤鏈蛇(Dinodon rufozonatum)消化道嗜銀細(xì)胞的分布及形態(tài)學(xué)觀察[J].哈爾濱師范大學(xué):自然科學(xué)學(xué)報(bào)，2009，25(1):77 －79.

[6]楊超，楊傳秀，聶劉旺.赤鏈蛇不同組織Sox基因表達(dá)的RT－PCR分析[J].激光生物學(xué)報(bào)，2004，13(5):334－338.

[7]Kyle C J，Wilson C C.Mitochondrial DNA identification of game and harvested freshwater fish species[J].Forensic science international，2007，166(1):68 －76.

[8]Teletchea F.Molecular identification methods of fish species:reassessment and possible applications[J].Reviews in Fish Biology and Fisheries，2009，19:265 －293.

[9]Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et al.The Clustal X windows interface:flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].Nucleic Acids Research，1997(24):4876 －4882.

[10]Kumar S，Tamura K，Nei M.Mega 3.0:Integrated Software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and Sequence A-lignment[J].Briefings in Bioinformatics，2004(5):150 － 163.

[11]Rozas J，Sánchez del Barrio J C，Messeguer X，et al.DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods[J].Bioinformatics，2003(19):2496 －2497.