梁龍輝，劉石磊，于惠蘭，高 川，周世坤

(防化研究院 國(guó)民核化生災(zāi)害防護(hù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102205)

蓖麻毒素(Ricin)是從天然植物蓖麻的種子中提取的一種Ⅱ型核糖體失活蛋白，由1條具有酶催化活性的A鏈和1條具有半乳糖殘基結(jié)合位點(diǎn)的B鏈通過1個(gè)二硫鍵連接而成，分子量為62～64 kDa［1］。蓖麻毒素的A鏈稱為效應(yīng)鏈，是一種蛋白酶，具有失活核糖體功能，通過作用于真核細(xì)胞核糖體60S亞單位的28 SrRNA，并水解A4324位點(diǎn)的腺嘌呤，導(dǎo)致抗RNA酶的活性不可逆喪失，從而抑制蛋白質(zhì)合成導(dǎo)致細(xì)胞死亡;B鏈稱為靶向鏈，其表面含有兩個(gè)半乳糖結(jié)合位點(diǎn)，能與細(xì)胞膜上糖蛋白或糖脂結(jié)合，從而介導(dǎo)A鏈進(jìn)入細(xì)胞發(fā)生毒性作用［2］。蓖麻毒素是自然界中毒性最高的植物毒素之一，其毒性約為有機(jī)磷神經(jīng)性毒劑VX的385倍，氰化物的6 000倍，成人吸入蓖麻毒素的半致死染毒劑量(LD50)為5～10 μg/kg，口服LD50為1～20 mg/kg［3］。蓖麻植物種植廣泛，蓖麻毒素易于制備和獲取，加之缺乏有效的解毒措施，所以長(zhǎng)期以來蓖麻毒素受到世界各國(guó)的高度關(guān)注。在禁止化學(xué)武器公約中，蓖麻毒素是唯一被列入禁控化學(xué)品清單的蛋白類毒素。由于很多國(guó)家的單一小規(guī)模設(shè)施都具有蓖麻毒素的生產(chǎn)能力。蓖麻毒素還被用于一些暗殺行動(dòng)及恐怖事件［4］中，如1978年的馬爾科夫殺人傘案件，2013年的白宮蓖麻毒素恐嚇信件等。因此，建立準(zhǔn)確、靈敏、快速的蓖麻毒素檢測(cè)方法，在化武履約、公共安全等領(lǐng)域的需求非常迫切。

目前，最常用、最靈敏的蓖麻毒素分析方法是免疫分析法，如酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)法［5－7］、抗體生物傳感器法［8］等。免疫分析法雖靈敏度高、操作簡(jiǎn)便，但當(dāng)抗體與其它具有相似作用位點(diǎn)的蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合時(shí)，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。例如同樣從蓖麻植物中提取出的蓖麻凝集素(RCA120，分子量120 kDa)，也由A，B兩條鏈組成，與蓖麻毒素A，B鏈的氨基酸序列同源性分別高達(dá)94%和84%［9］，但其毒性遠(yuǎn)小于蓖麻毒素。另一種Ⅱ型核糖體失活蛋白相思子毒素(Abrin)，可從植物相思的種子中提取得到，與蓖麻毒素具有相似的結(jié)構(gòu)與毒性作用機(jī)理。目前的免疫分析法很難準(zhǔn)確區(qū)分這3種蛋白，不能滿足當(dāng)前準(zhǔn)確鑒定的需求。為實(shí)現(xiàn)蛋白、多肽等生物大分子的準(zhǔn)確、靈敏鑒定，近年來，電噴霧電離(ESI)和基質(zhì)輔助激光解析電離(MALDI)等軟電離技術(shù)得到了越來越多的關(guān)注和發(fā)展，形成了生物質(zhì)譜技術(shù)，可通過對(duì)蛋白分子量的準(zhǔn)確測(cè)定以及酶解后肽質(zhì)量指紋譜(PMF)數(shù)據(jù)分析等手段分析鑒定大分子蛋白［10－11］。MALDI－ TOF/MS［12］，LC － ESI/MS［13－15］等質(zhì)譜技術(shù)用于蓖麻毒素分析，盡管取得了快速、準(zhǔn)確的分析鑒定結(jié)果，但這些方法大多針對(duì)天然提取蓖麻毒素純樣或生物樣品基質(zhì)，很少有針對(duì)應(yīng)用最廣泛的水樣基質(zhì)所建立的分析方法。

本研究選擇生活自來水、海水和OPCW考試用水3種具有代表性的水樣基質(zhì)，利用結(jié)合有蓖麻毒素抗體的免疫磁珠進(jìn)行免疫捕獲樣品前處理，對(duì)基質(zhì)中的蓖麻毒素進(jìn)行富集和純化，結(jié)合高效液相色譜－四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC－Q－TOF/MS)建立了復(fù)雜水樣基質(zhì)中蓖麻毒素的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

6520高效液相色譜－四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)，1200快速高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)Agilent公司);Mass Hunter B.04數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國(guó)Agilent公司);Eppendorf 5424高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);12道磁力架(美國(guó)Promega公司);500 μL 10 kD超濾管(美國(guó)Millipore公司)。

乙腈(色譜純，美國(guó)Honey Well公司);甲酸、三氟乙酸(TFA)(色譜純，美國(guó)Sigma Aldrich公司);天然蓖麻子(河北康德瑞琪公司);蓖麻毒素標(biāo)準(zhǔn)品由本實(shí)驗(yàn)室從天然蓖麻子中提取純化制備［16］，于－20℃冷凍保存;蓖麻毒素單克隆抗體6A6、HRP－標(biāo)記的ricin單克隆抗體7G7以及包被抗體6A6的免疫磁珠由中科院生物物理所制備［17］;N-四甲基聯(lián)苯胺(TMB，華美生物技術(shù)有限公司);磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉(美國(guó)Arcos公司);牛血清白蛋白(BSA，北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司)。

OPCW考試水樣為國(guó)際禁化武組織(OPCW)第33次官方水平考試樣品，含有大量鹽類以及化武公約相關(guān)附表化合物;海水取自大連黃花港;自來水取自本單位生活區(qū)。

1.2 色譜－質(zhì)譜條件

色譜條件:Agilent Proshell 300SB－C8色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);柱溫30℃;流動(dòng)相A為0.1%的甲酸水溶液，B為乙腈(含0.1%甲酸);洗脫梯度:0～2 min，5%B，2～8 min，5%～70%B，8～16 min，70%B，16～18 min，70%～5%B，總分析時(shí)間18 min;流速0.25 mL/min;柱溫30℃;進(jìn)樣量 2 μL。

質(zhì)譜條件:離子源ESI，正離子模式;掃描范圍為m/z 150～2 400;掃描頻率1.3 spectra/s;毛細(xì)管電壓(Vcap)3.5 kV;霧化氣壓力35 psi;干燥氣溫度350℃;干燥氣流速8 L/min;碎裂電壓150 V;聚焦電壓(Skimmer)65 V;儀器在高分辨率(4 GHz)、高質(zhì)量范圍下(＜m/z 3 200)操作;使用嘌呤(m/z 121.05)和六(1H，1H，3H-全氟丙氧基)磷氮(m/z 922.01)作為基準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量校準(zhǔn)，質(zhì)量誤差低于5 ppm。

1.3 ELISA法考察免疫磁珠捕獲方法的回收率

按照文獻(xiàn)［17］用ELISA法繪制免疫磁珠捕獲檢測(cè)蓖麻毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并考察方法的回收率與精密度。向每個(gè)離心管中加入1 mL抗體稀釋液(1%BSA)和10 μL連接蓖麻毒素抗體6A6的Fe3O4磁性納米顆粒。除1號(hào)管作為空白外，將濃度分別為2，5，10，25，50，100 μg/mL的蓖麻毒素加入各離心管中，37℃孵育30 min后，放入帶有磁鐵的離心管架中進(jìn)行磁吸附，再用PBST(含0.1%Tween－20的20 mmol/L PBS緩沖液)洗滌3次。各管中分別加入200 μL稀釋3 000倍的HRP－7G7，37℃孵育15 min后，用PBST洗滌3次。每管加入200 μL 10 g/L的TMB顯色劑，室溫下放置15 min，再加入50 μL 2 mol/L的H2SO4溶液，使反應(yīng)終止。用移液槍吸取各管中的液體50 μL分別加入96孔酶標(biāo)板的各孔中，在Bio－Rad550型酶標(biāo)儀上測(cè)定A450nm值，用試劑空白孔調(diào)零。

1.4 復(fù)雜水樣的免疫磁珠捕獲富集

取20 μL 1 mg/mL的免疫磁珠添加到500 μL不同濃度蓖麻毒素的自來水、海水及OPCW考試水樣中，混合均勻后于37℃下孵育反應(yīng)1 h。用磁力架沉淀吸附免疫磁珠，棄去上清液后，用1 mL的PBST分兩次洗滌除去與磁珠非特異性結(jié)合的化合物，然后用500 μL超純水分兩次洗滌除去體系中剩余的PBST。最后用35 μL 0.1%的三氟乙酸(TFA)對(duì)結(jié)合在磁珠上的蓖麻毒素進(jìn)行洗脫，將洗脫液轉(zhuǎn)入新的離心管中，用10 kD超濾管在13 500 r/min下進(jìn)行超濾，用20 mmol/L的PBS緩沖液溶劑置換3次，得到約100 μL上層保留液，用HPLC－Q－TOF/MS分析。將結(jié)果與未經(jīng)免疫捕獲富集的樣品進(jìn)行比對(duì)，考察磁珠免疫捕獲后的方法學(xué)指標(biāo)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜－質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇 由于本文主要研究水樣基質(zhì)中的蓖麻毒素，樣品組分相對(duì)單一，故選用5 μm粒徑的色譜柱，另外，由于樣品中蓖麻毒素的分子量遠(yuǎn)大于4 000 Da，故選擇色譜柱孔徑為300。結(jié)合蓖麻毒素的性質(zhì)及高效液相色譜的性能，比較了Proshell 300SB－C8(4.6 mm ×150 mm，5 μm)，Zorbax 300SB －C18(4.6 mm ×150 mm，5 μm)以及Eclipse plus－C18(4.6 mm ×100 mm，5 μm)3種色譜柱對(duì)蓖麻毒素樣品的保留與檢測(cè)靈敏度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:雖然100 mm柱長(zhǎng)的色譜柱用時(shí)更短，但不能保證大分子樣品在色譜柱上有很好的保留。在柱長(zhǎng)、柱徑、粒徑及孔徑相同的情況下，用C8柱分析得到的峰形比C18柱更好。因此，最終選用Proshell 300 SB－C8(4.6 mm ×150 mm，5 μm)色譜柱分離目標(biāo)物。

2.1.2 洗脫梯度的優(yōu)化 以水(0.1%甲酸)－乙腈(0.1%甲酸)為流動(dòng)相，研究了不同梯度條件下(見表1)的洗脫效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙腈含量高，目標(biāo)化合物的信噪比高，檢測(cè)靈敏度高。但是對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)樣品，若乙腈含量過高，可能會(huì)使混合物分離不完全，峰形變差。采用表1中的梯度4，在分析時(shí)間較短的情況下，能夠保證蓖麻毒素與背景干擾物有很好的分離且靈敏度最高。

表1 復(fù)雜水樣基質(zhì)中蓖麻毒素的梯度洗脫條件Table 1 The elution gradient of ricin in complex water samples

2.1.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 采用高分辨ESI+模式，在m/z 150～2 400范圍進(jìn)行全掃描，由于目標(biāo)化合物的分子量大，需要通過軟件的去卷積計(jì)算以得到分子量的準(zhǔn)確測(cè)定值，因此對(duì)儀器的靈敏度、準(zhǔn)確度都有較高要求。為減少質(zhì)譜信號(hào)中的噪音，提高目標(biāo)物的響應(yīng)，考察了質(zhì)譜的不同掃描頻率(1.1，1.3，1.5 spectra/s)、干燥氣流量(5，8，10 L/min)、噴霧壓力(20，30，40 psi)、干燥氣溫度(250，300，350℃)、毛細(xì)管電壓(3.2，3.5 kV)以及碎裂電壓(120，150，180 V)對(duì)分析結(jié)果的影響，確定最佳MS條件如“1.2”所示。

利用優(yōu)化得到的儀器采集參數(shù)，對(duì)蓖麻毒素純品進(jìn)行分析，蓖麻毒素屬于大分子蛋白化合物，在HPLC－Q－TOF/MS中生成一系列 ［M+nH］n+多電荷離子(n為質(zhì)子化數(shù)，即電荷數(shù))，利用去卷積軟件計(jì)算得到蓖麻毒素純品的分子量(見圖1)。4次重復(fù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得蓖麻毒素的分子量分別為:62 884.21，62 884.99，62 885.48，62 885.21 Da，其平均值為62 884.97 Da，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性良好。

圖1 HPLC－Q－TOF/MS分析蓖麻毒素得到的質(zhì)譜圖(A)以及去卷積計(jì)算結(jié)果(B)Fig.1 HPLC－Q－TOF/MS spectrum of ricin(A)and its deconvolution result(B)

2.2 HPLC－Q－TOF/MS直接分析不同基質(zhì)水樣

由于環(huán)境水樣中含有鹽類、醇類、脂類等背景干擾物，因此對(duì)目標(biāo)物的分析會(huì)造成一定干擾。本實(shí)驗(yàn)采用Agilent 1200/6520 HPLC－Q－TOF/MS系統(tǒng)結(jié)合蛋白分析專用色譜柱Agilent－proshell 300SB－C8，采用優(yōu)化的色譜－質(zhì)譜條件，能夠?qū)悠分械谋吐槎舅嘏c背景干擾物基本分離，從而可直接用于復(fù)雜水樣的分析。但不同樣品的背景復(fù)雜程度不同，分離效果不同，其檢測(cè)靈敏度也各不相同。用HPLCQ－TOF/MS直接對(duì)不同濃度的自來水、海水以及OPCW考試水樣中的蓖麻毒素進(jìn)行分析，以3倍信噪比(S/N)時(shí)樣品的濃度為檢出限(LOD)，結(jié)果見表2。

表2 HPLC－Q－TOF MS直接分析不同基質(zhì)水樣中蓖麻毒素的保留時(shí)間、檢出限及測(cè)得分子量Table 2 Retention times，LODs and determined masses of ricin directly analyzed by HPLC－Q－TOF MS in different water matrices

圖2為不同水樣中的1.00 ng/μL蓖麻毒素經(jīng)HPLC－Q－TOF/MS分析后的總離子流色譜圖，譜圖中積分的部分為蓖麻毒素的色譜峰。結(jié)果表明，OPCW考試用水的背景最復(fù)雜，基質(zhì)中大量聚乙二醇、醇胺、磷酸酯、無機(jī)鹽類干擾物對(duì)蓖麻毒素的分析造成了嚴(yán)重干擾，使得蓖麻毒素的保留時(shí)間和分子量與標(biāo)樣相比存在較大偏差，峰面積大大降低，僅能檢測(cè)濃度高于1.00 ng/μL的樣品。因此，雖然HPLC－Q－TOF/MS可以直接篩查不同基質(zhì)水樣中的蓖麻毒素，但對(duì)于復(fù)雜背景干擾的基質(zhì)樣品，分析靈敏度和準(zhǔn)確性均較差，必須對(duì)復(fù)雜樣品中的目標(biāo)蛋白進(jìn)行有效的純化與富集后才能得到理想的分析結(jié)果。

圖2 HPLC－Q－TOF MS直接分析不同基質(zhì)水樣中蓖麻毒素(1.00 ng/μL)的總離子流色譜圖Fig.2 TIC chromatograms of ricin(1.00 ng/μL)in different water matrices directly analyzed by HPLC－Q－TOF MS

2.3 復(fù)雜基質(zhì)中蓖麻毒素的免疫磁珠富集與純化

2.3.1 抗體效價(jià)的測(cè)定 利用間接ELISA［18］方法考察了不同抗體的效價(jià)，通過實(shí)驗(yàn)得到ELISA最低響應(yīng)信號(hào)對(duì)應(yīng)抗體的質(zhì)量濃度，計(jì)算包被的蓖麻毒素濃度與抗體濃度的比值，從而得到抗體的效價(jià)。結(jié)果表明，抗體3G7的效價(jià)太低，僅為1∶50，不能用于實(shí)驗(yàn)分析;而抗體6A6和7G7的效價(jià)分別達(dá)1∶2 800和1∶5 000，能夠滿足免疫分析的實(shí)驗(yàn)需求，所以選擇抗體6A6和7G7進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3.2 免疫捕獲富集方法的線性方程、回收率與精密度 分別配制濃度為0，0.01，0.10，1.00，2.00，5.00，10.0，25.0，50.0，100 μg/mL的蓖麻毒素，用ELISA－光度法繪制免疫磁珠捕獲檢測(cè)蓖麻毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以蓖麻毒素濃度的對(duì)數(shù)為X軸，對(duì)應(yīng)A450nm值為Y軸，進(jìn)行線性回歸計(jì)算。結(jié)果顯示，蓖麻毒素濃度在5.00～100 μg/mL范圍內(nèi)，其對(duì)數(shù)與發(fā)光強(qiáng)度A450nm呈線性關(guān)系，回歸方程為Y=0.634X －0.347，r2為0.974。

在5.00～100 μg/mL線性范圍內(nèi)配制加標(biāo)濃度為15.0和30.0 μg/mL的蓖麻毒素樣品，采用免疫捕獲方法測(cè)定相應(yīng)濃度樣品的A450nm值，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，以工作曲線計(jì)算對(duì)應(yīng)樣品的濃度，并計(jì)算其回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示，樣品在15.0，30.0 μg/mL加標(biāo)濃度下的回收率分別為88.8%和82.1%，RSD分別為5.9%和4.2%。

2.3.3 免疫捕獲結(jié)合HPLC－Q－TOF/MS對(duì)復(fù)雜水樣的分析 將免疫捕獲富集技術(shù)與HPLC－QTOF/MS相結(jié)合用于復(fù)雜水樣的測(cè)定。圖2C及圖3分別為OPCW考試水樣在免疫磁珠富集前后的HPLC－Q－TOF/MS總離子流色譜圖。從圖中可以看出，免疫磁珠富集前(圖2C)，由于受到大量背景化合物的干擾，蓖麻毒素不能在色譜柱上很好地保留，保留時(shí)間明顯靠前，質(zhì)譜響應(yīng)較差。而經(jīng)免疫磁珠富集后，有效除去了OPCW考試水樣基質(zhì)中的背景干擾物，使樣品的保留時(shí)間更接近標(biāo)樣，且顯著提高了質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)與檢測(cè)靈敏度。

圖3 OPCW考試水樣中蓖麻毒素(1.00 ng/μL)經(jīng)免疫磁珠富集后的HPLC－Q－TOF/MS總離子流圖Fig.3 TIC chromatogram of OPCW test water(1.00 ng/μL)analyzed by HPLC －Q －TOF/MS after immunocapture enrichment

2.4 蓖麻毒素染毒樣品的分析

采用本文建立的免疫捕獲樣品前處理方法和優(yōu)化的液相色譜－質(zhì)譜條件對(duì)自來水、海水及OPCW考試水等基質(zhì)中不同濃度蓖麻毒素的加標(biāo)樣品進(jìn)行篩查分析，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，通過保留時(shí)間比對(duì)以及分子量測(cè)定確證了陽性樣品中的蓖麻毒素，并考察了不同基質(zhì)樣品的檢出限，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可見，經(jīng)過免疫捕獲，自來水和PBS基質(zhì)中蓖麻毒素的檢出限達(dá)2.5 ng/mL，對(duì)于更加復(fù)雜的海水和OPCW考試水樣，檢出限分別達(dá)10，50 ng/mL，靈敏度比免疫捕獲之前提高了約20倍。

表3 蓖麻毒素染毒樣品分析的保留時(shí)間、檢出限及測(cè)得分子量Table 3 Retention times，LODs and determined masses of ricin contaminated samples

3 結(jié)論

基于免疫磁珠捕獲富集技術(shù)，結(jié)合高效液相色譜－四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜分析，建立了復(fù)雜水樣中蓖麻毒素的檢測(cè)方法。該方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于突發(fā)情況下可疑樣品中蓖麻毒素的快速篩查與確證，但由于方法檢測(cè)的是蓖麻毒素全蛋白，缺乏可靠?jī)?nèi)標(biāo)物，還不能進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。本文所建立的免疫磁珠富集方法，為真實(shí)染毒樣品的酶解－二級(jí)質(zhì)譜鑒定提供了思路。在今后的工作中，本課題組將進(jìn)一步對(duì)磁珠免疫捕獲后的蓖麻毒素樣品進(jìn)行酶解，在酶解產(chǎn)物中篩選出蓖麻毒素序列特異性肽段，建立基于蓖麻毒素標(biāo)識(shí)性肽段的準(zhǔn)確定量的HPLC－MS/MS(MRM)方法，以形成初步完備的復(fù)雜樣品中蓖麻毒素的定性、定量質(zhì)譜分析技術(shù)體系。

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