杜欣蔚，佘永新*，李騰飛，張艷欣，劉廣洋，王 靜*，王珊珊，金 芬，金茂俊，邵 華，鄭鷺飛，曹維強

(1．中國農業(yè)科學院 農業(yè)質量標準與檢測技術研究所，農業(yè)部農產品質量安全重點實驗室，北京 100081;2．廣東惠州出入境檢驗檢疫局 檢測中心，廣東 惠州 516000)

三嗪類農藥是全世界范圍內廣泛使用的一類除草劑，在農業(yè)生產中發(fā)揮著重要作用。但該類除草劑具有一定的“致癌、致畸、致突變”作用，美國環(huán)保署將莠去津、西瑪津等原藥及其代謝物列入優(yōu)先控制污染物名單［1］。莠去津等三嗪類除草劑可轉化為多種降解產物，主要有脫乙基莠去津(DEA)、脫異丙基莠去津(DIA)、羥基化莠去津(HYA)和脫乙基脫異丙基莠去津(DEDIA)等［2］，另外，草凈津(Cyanazine)和西瑪津(Simazine)可降解生成DIA，撲滅津(Propazine)可降解生成DEA［3］。上述代謝物具有類似于原藥或高于原藥的毒性［4］，由于其在樣品基質中多以結合狀態(tài)存在，很難用一種前處理技術快速提取、分離與富集，致使其樣品前處理過程較為繁瑣。目前報道的三嗪類農藥的樣品前處理方法主要有基質固相分散萃?。?－6］、凝膠滲透色譜［7］、固相萃取［8－11］等，其中固相萃取技術研究較多，但通用型的固相萃取柱缺乏選擇性，凈化效果不理想，常會發(fā)生雜質共萃取基質效應［8］，從而影響后期的儀器分析結果，因此探索一種選擇性好、凈化富集能力強的前處理技術十分必要。

分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymers，MIPs)是一種具有較強分子識別能力的新型高分子仿生材料，具有“類抗體”的特異性、高選擇性、高強度等優(yōu)點，而且制備簡單、成本低、可重復利用，非常適合作為固相萃取柱的填料。與傳統(tǒng)的固相萃取技術相比，分子印跡固相萃取技術克服了樣品基質復雜、預處理繁瑣等不利因素，有效提高了分析準確性和靈敏度，更適用于痕量分析。目前分子印跡技術在樣品前處理中的應用，多數(shù)僅以單一成分作為目標物，常需要分批合成幾種分子印跡聚合物來富集多種目標物，增加了對目標物的提取次數(shù)和成本，不能滿足當前多殘留檢測技術的要求。已有學者將分子印跡固相萃取應用于蔬果［12－15］、水［16－18］、土壤［19－20］、大豆［21－22］、小米［21］、玉米［23－24］、草藥植物［25］等基質中三嗪類除草劑的殘留量檢測，但這些方法均不能實現(xiàn)對DEA，DIA和DEDIA 3種主要代謝物的同時檢測。

本研究合成了三嗪類農藥類特異性分子印跡聚合物，研究了聚合物的吸附性能，并將其作為填料制備分子印跡固相萃取(MIP－SPE)柱，建立了5種三嗪類農藥(環(huán)丙津、西瑪津、特丁津、撲滅津、莠去津)及其3種主要代謝物(DEDIA，DIA，DEA)的分子印跡固相萃?。合嗌V－串聯(lián)質譜分析方法。與已有文獻相比，本文建立的MIP－SPE/HPLC－MS/MS方法在檢測氯代三嗪類農藥基礎上，還能檢測其3種代謝物;與市售的Oasis HLB固相萃取柱相比，MIP－SPE柱對脫異丙基莠去津的回收率明顯提高，且試劑用量更少。該方法可應用于玉米、小麥及棉花樣品中三嗪類除草劑及其代謝物的殘留檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

安捷倫系列1100高效液相色譜儀，API2000串聯(lián)質譜儀(AB公司);Agilent ZORBAX RX－C8色譜柱(150 mm×2.1 mm，5 μm，安捷倫公司);Oasis HLB固相萃取柱(60 mg，3 mL，Waters公司);HITACHI S－4800掃描電鏡(日本日立公司);Tecnai G2 F30場發(fā)射透射電子顯微鏡(美國FEI公司)。

環(huán)丙津、西瑪津、特丁津、撲滅津、脫乙基脫異丙基莠去津、脫異丙基莠去津、脫乙基莠去津、莠去津標準品(德國Dr.Ehrenstorfer公司);三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)、乙腈、甲醇、乙酸(色譜純，Aldrich公司);甲基丙烯酸(MAA)、偶氮二異丁腈(AIBN)及其它試劑(分析純，北京百匯佳興科技有限公司);實驗用水為超純水。

1.2 模板分子與功能單體相互作用的紫外光譜

選擇甲基丙烯酸作為功能單體，在乙腈溶液中固定莠去津的濃度，加入不同體積的甲基丙烯酸，使模板與功能單體的比例分別為1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，將模板與功能單體的混合液于室溫下振蕩30 min，通過紫外光譜法觀察混合溶液最大吸收波長的變化，研究模板與功能單體的相互作用機制，確定兩者之間的最佳配比。

1.3 類特異性分子印跡聚合物的合成

將模板分子莠去津溶于一定量乙腈中，加入功能單體甲基丙烯酸(與模板分子的摩爾比為1∶4)，振蕩30 min后，加入交聯(lián)劑三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(與功能單體的摩爾比為1∶1)和一定量的引發(fā)劑偶氮二異丁腈，超聲5 min，通N2除氧5 min，密封后放入60℃水浴鍋中反應24 h。反應完成后取出聚合物，研磨后過篩(200目)，在索氏提取裝置中用10%的乙酸甲醇洗去模板，直至用高效液相色譜法檢測不到提取液中的模板分子。

非印跡聚合物(NIPs)的制備過程與印跡聚合物(MIPs)相同，只是不加入模板分子莠去津。

1.4 印跡聚合物的吸附性能研究

分別稱取MIPs和NIPs 10 mg置于10 mL離心管中，加入3 mL不同濃度的莠去津乙腈溶液，恒溫振蕩2 h，離心取上清液，HPLC測定其濃度。根據(jù)式(1)計算 MIPs和 NIPs對不同濃度莠去津的吸附量Q(μg/g)，并繪制等溫吸附曲線。根據(jù)式(2)(Scatchard方程)計算印跡聚合物的結合常數(shù)及最大吸附量。

式中，Q為平衡時聚合物對分析物的吸附量(μg/g)，Qmax為最大表觀吸附量(μg/g)，C0為莠去津的初始濃度(mg/kg)，C為平衡時上清液中的莠去津濃度(mg/kg)，V為加入莠去津溶液的體積，M為加入聚合物的質量，KD為平衡離解常數(shù)。

1.5 色譜－質譜條件

1.5.1 色譜條件 安捷倫系列1100高效液相色譜儀;色譜柱:150 mm×2.1 mm×5 μm(ZORBAX RX－C8柱，Agilent);流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈;梯度洗脫程序:0～2 min，25%～60%B;2～3 min，60%B;3～6 min，60%～40%B;6～7 min，40%～60%B;7～13 min，60%B;13～13.5 min，60%～25%B;13.5～20 min，25%B;流速:200 μL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:5 μL。

1.5.2 質譜條件 API 2000質譜儀(AB公司);離子源:電噴霧電離(ESI);離子源溫度:450℃;掃描方式:正離子掃描;檢測方式:多反應監(jiān)測(MRM)模式;霧化氣(Gas1)壓力:30 psi;加熱輔助氣(Gas2)壓力:30 psi;氣簾氣壓力:35 psi;噴霧電壓:5.5 kV;8種三嗪類農藥的m/z及其碰撞能量見表1。

表1 8種三嗪類除草劑的質荷比(m/z)及其碰撞能量Table 1 m/z ratios and ion collision energies of 8 kinds of triazine herbicides

1.6 分子印跡固相萃取方法及其性能研究

稱取50 mg分子印跡聚合物，用濕法裝柱方式填裝到固相萃取空柱中，獲得分子印跡固相萃取(MIP－SPE)柱?；罨?3 mL乙腈活化，并保證乙腈在柱中未完全流干;上樣:取1 mL 8種三嗪類除草劑的乙腈溶液作為上樣液，緩慢過柱(約0.3 mL/min);淋洗:1 mL乙腈淋洗，流干;洗脫:依次用3次×1 mL甲醇和2次×1 mL乙酸－甲醇溶液(1∶9，體積比)洗脫固相萃取柱，收集洗脫液，N2吹干，1 mL乙腈再次溶解，高效液相色譜－串聯(lián)質譜法檢測洗脫液中8種三嗪類農藥的含量。

1.7 分子印跡固相萃取柱與Oasis HLB固相萃取柱性能的對比

參照文獻［8］，用Oasis HLB固相萃取柱對8種三嗪類農藥進行富集，8種三嗪類農藥用甲醇－水溶液(1∶9)配制，濃度分別為10，50，100 μg/kg。活化:5 mL甲醇和5 mL水;上樣:1 mL 8種三嗪類農藥的甲醇－水溶液;淋洗:5 mL水，減壓抽干;洗脫:10 mL乙腈。收集洗脫液，N2吹干，1 mL甲醇－水溶液(1∶9)再次溶解，高效液相色譜－串聯(lián)質譜法檢測洗脫液中8種三嗪類農藥的含量。

1.8 分子印跡固相萃取柱應用于實際樣品

稱取2 g加入8種三嗪類農藥混標的玉米(或小麥、棉花)樣品置于50 mL具塞離心管中，加入20 mL乙腈，旋渦2 min，振蕩30 min，離心5 min(5 000 r/min)，重復提取兩次，合并上清液，再加入20 mL正己烷乙腈飽和溶液，棄去正己烷層，乙腈層用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至干后，用2 mL乙腈溶解，取1 mL待凈化。其凈化過程參照“1.6”的固相萃取方法，用LC－MS/MS進行檢測。

圖1 莠去津和MAA相互作用的紫外光譜圖Fig.1 UV spectra of interaction between atrazine(ATR)and methacrylic acid(MAA)

2 結果與討論

2.1 分子印跡聚合物的表征

2.1.1 模板分子與功能單體相互作用的紫外光譜分析 由于莠去津的分子結構為三嗪環(huán)上連有2個氨基取代基及1個氯取代基，因此理論上選擇帶有羧基官能團的甲基丙烯酸(MAA)比較合適［19，26］。從紫外光譜(圖1)可以看出，向莠去津溶液中加入功能單體甲基丙烯酸后，混合溶液的最大吸收波長位置發(fā)生了變化，說明兩者產生了相互作用。隨著MAA量的增加，最大吸收波長發(fā)生了藍移且藍移量亦增大;當莠去津與MAA的摩爾比為1∶4時藍移量最大(220 nm移至211 nm)，隨著MAA的繼續(xù)增加，混合液的最大波長幾乎不變，說明更多的MAA不會增加兩者的相互作用，因此模板與功能單體的最優(yōu)比例選為1∶4。

2.1.2 印跡聚合物的形態(tài)分析 圖2為MIP和NIP的掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)圖。由SEM圖可以看出印跡聚合物具有一定的孔穴結構，而非印跡聚合物(NIP)的表面較光滑(圖2A，B)，這是印跡聚合物具有特異性吸附的原因;由TEM圖可以看出，本體聚合法合成的印跡聚合物和非印跡聚合物均為連接的塊狀結構(圖2C，D)。

圖2 印跡聚合物和非印跡聚合物的掃描電鏡圖(A，B)及透射電鏡圖(C，D)Fig.2 SEM(A，B)and TEM(C，D)photographs of MIP and NIPA，C:MIP;B，D:NIP

2.2 分子印跡聚合物的吸附性能研究

2.2.1 印跡聚合物的特異性分析 圖3為莠去津MIP和NIP的等溫吸附曲線，可以看出隨著莠去津濃度的增加，MIP對莠去津的吸附量明顯高于NIP，說明MIP對莠去津是特異性吸附。

2.2.2 印跡聚合物的Scatchard方程分析 由莠去津分子印跡聚合物的Scatchard分析曲線(圖4)可見，Q/C對Q明顯呈非線性關系，這表明MIP對莠去津的結合位點是非均一的，但在圖的兩端均具有較好的線性關系。據(jù)此判斷，在不同的濃度范圍內，存在著兩類不同親和性的結合位點。這可能是由于功能單體和印跡分子之間存在多種相互作用，可以形成多種不同組成的復合物，不同類型的復合物在聚合之后形成了具有不同性質的作用位點。由兩個方程可以計算得出第一類結合位點的結合常數(shù)KD1=2.63，理論最大吸附量Qmax1=532.49 μg/g;第二類結合位點的結合常數(shù)KD2=142.857，理論最大吸附量 Qmax2=6 228.85 μg/g。

圖3 莠去津MIP與NIP的等溫吸附曲線Fig.3 Isothermal adsorption curves of MIP and NIP

2.3 分子印跡固相萃取條件的優(yōu)化

為保證分子印跡聚合物空間結構和位點的高效識別性，選擇固相萃取過程的上樣液為莠去津乙腈溶液，進一步研究了MIP－SPE柱的萃取條件，篩選和優(yōu)化了活化、淋洗和洗脫過程的溶劑，其結果見圖5。

圖4 莠去津分子印跡聚合物的Scatchard分析曲線Fig.4 Scatchard curve for atrazine molecualrly imprinted polymer

分別選擇乙腈、二氯甲烷和甲醇3種溶劑作為活化液，以莠去津為三嗪類農藥類似結構的代表物，考察其在MIP－SPE柱上的保留效果。結果表明，當活化液為乙腈時固相萃取柱對莠去津乙腈溶液的吸附效果最好，二氯甲烷次之，這與MIP合成溶劑為乙腈有關。進一步考察了乙腈、二氯甲烷和水3種溶劑作為淋洗液時的洗脫效果，結果表明，乙腈不能將莠去津洗脫，而二氯甲烷和水均會不同程度地將莠去津淋洗下來，這是因為水和二氯甲烷的加入破壞了莠去津與MIP之間的作用力。同時考察了甲醇、10%乙酸甲醇和兩者共同作為洗脫液的洗脫效果，結果表明，3 mL甲醇可以洗脫89%莠去津，而3 mL 10%乙酸甲醇可以洗脫66%莠去津，因此最終選擇甲醇和10%乙酸甲醇共同作為洗脫液，可以洗脫97%莠去津。

圖5 莠去津分子印跡固相萃取柱萃取條件的優(yōu)化Fig.5 Optimizing extraction conditions of MIP－SPE for atrazine

2.4 MIP－SPE類特異性研究

選擇三嗪類除草劑及其代謝物混合乙腈溶液為上樣液，在上述MIP－SPE條件下進行類特異性富集性能研究(表2)。結果表明，MIP－SPE柱對莠去津的結構類似物氯代三嗪類農藥及3種代謝物均有吸附，回收率均高于70%，具有較好的類特異性。

2.5 分子印跡固相萃取柱與Oasis HLB固相萃取柱性能的對比

分別選擇自制的MIP－SPE小柱與Oasis HLB柱對樣品中8種三嗪類農藥的萃取效果進行比對研究(結果見表2)。由表可知，在最佳的萃取條件下，Oasis HLB柱對脫異丙基莠去津的吸附效果差，對其他7種三嗪類農藥的回收率均高于63.6%，而MIP－SPE柱是以莠去津分子印跡聚合物為填料，對莠去津及其結構類似的氯代三嗪類農藥表現(xiàn)出選擇性吸附性能，具有較好的萃取效果，對結構不相似的氯代三嗪類農藥氰草津的回收率小于20.0%(表2未列出)。同時，MIP－SPE柱萃取過程中使用的有機溶劑較少，具有較好的環(huán)保效應。因此，本文選擇MIP－SPE柱作為檢測復雜基質中8種氯代三嗪類農藥及其代謝物的固相萃取柱。

表2 不同萃取柱對8種三嗪類農藥的回收率與相對標準偏差Table 2 Recoveries and RSDs of 8 kinds of triazine herbicides on different extraction columns /%

2.6 回收率與精密度

分別以玉米、小麥和棉花為樣品基質，8種三嗪類農藥的加標水平為10，50，100 μg/kg，采用MIP－SPE柱進行凈化、富集，并用液相色譜－串聯(lián)質譜法進行測定，結果見表3。測得方法的回收率為61.1%～107.6%，相對標準偏差(RSD，n=3)為2.0%～10.7%。該方法用時短，試劑用量少，回收率高，凈化效果好，可用于玉米、小麥及棉花樣品中三嗪類除草劑及代謝物的殘留檢測。

表3 實際樣品的加標回收結果Table 3 Recoveries of 8 kinds of triazine herbicides in real samples /%

2.7 線性范圍與檢出限

將玉米空白樣品按照MIP－SPE方法凈化后進行基質配標，配制濃度分別為10，25，50，100，200 μg/kg的8種三嗪類農藥溶液，在優(yōu)化條件下進行測定。結果顯示，在10～200 μg/kg線性范圍內8種三嗪類農藥的濃度與其相應的峰面積具有良好線性關系，相關系數(shù)均大于0.998 1。根據(jù)最小濃度響應的信噪比(S/N=3)計算得方法的檢出限(LOD)分別為:環(huán)丙津2.3 μg/kg、西瑪津3.3 μg/kg、特丁津2.1 μg/kg、撲滅津3.8 μg/kg、脫乙基脫異丙基莠去津8.1 μg/kg、脫異丙基莠去津3.0 μg/kg、脫乙基莠去津 1.9 μg/kg、莠去津 0.4 μg/kg。

3 結論

本文以莠去津為模板，甲基丙烯酸為功能單體，三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，采用本體聚合法制備了三嗪類農藥及其代謝物的類特異性分子印跡聚合物。該印跡聚合物對莠去津的結構類似物及代謝產物均具有良好的選擇性和吸附性。以該聚合物作為固相萃取填料制備了MIP－SPE柱，建立了8種三嗪類農藥的分子印跡固相萃取/液相色譜－串聯(lián)質譜分析方法，并應用于玉米、小麥和棉花樣品中痕量三嗪類農藥的殘留檢測。

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