呂沁風(fēng)，姜侃，楊永耀，何蕾，羅鵬，吳忠華

1.浙江國際旅行衛(wèi)生保健中心，浙江 杭州 310003；2.浙江省質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，浙江 杭州 310003

惡性瘧是由惡性瘧原蟲感染引起的瘧疾，目前高發(fā)于非洲和東南亞熱帶地區(qū)。根據(jù)WHO的報(bào)道，每年約有65 萬人死于惡性瘧，57%的非洲人口仍然生活在惡性瘧流行的高發(fā)地區(qū)，在非洲南部惡性瘧仍是住院的主要原因，同時(shí)給這些地區(qū)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-2]。惡性瘧潛伏期為9～14 d，平均12 d；常見發(fā)冷、發(fā)熱、出汗等癥狀，與重癥流行性感冒相似；發(fā)作周期一般為36～48 h。免疫力低下人群，如未及時(shí)治療或治療不當(dāng)易發(fā)展為重癥瘧疾，甚至腦型瘧而死亡。國內(nèi)目前惡性瘧主要來源于輸入性感染，且存在瘧疾的傳播媒介按蚊，開發(fā)快速檢測方法，對(duì)惡性瘧的防治具有重要的意義。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，該方法針對(duì)靶基因的6 個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4 種引物，在等溫條件60℃～65℃下利用Bst聚合酶即可進(jìn)行109～1010倍的核酸擴(kuò)增[3-4]。LAMP 產(chǎn)物通過濁度或熒光變化可用肉眼觀察，具有操作簡便、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。自2000 年問世以來，LAMP 技術(shù)在病原體檢測、疾病診斷等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[7-10]。目前，如何在現(xiàn)有LAMP 技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)掘更高效快速的等溫?cái)U(kuò)增方法，成為重要的研究方向。最快速的LAMP反應(yīng)方法就是加入環(huán)引物[11-12]。本研究的目的在于縮短等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)時(shí)間，達(dá)到比加入環(huán)引物更快的擴(kuò)增效率：把LAMP 的環(huán)引物由1 對(duì)增加至2 對(duì)，在進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)時(shí)，2 對(duì)環(huán)引物能同時(shí)和反應(yīng)回環(huán)的產(chǎn)物進(jìn)行貼合，亦即在退火的同時(shí)啟動(dòng)了再回環(huán)的擴(kuò)增，從而增加了反應(yīng)進(jìn)程，縮短反應(yīng)時(shí)間，達(dá)到快速檢測的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

2011～2014 年口岸截獲的瘧疾感染者全血標(biāo)本為本室保存。

DNA 提取試劑盒和膠回收試劑盒購自QIAGEN公司；BstDNA 聚合酶購自NEB 公司；ExTaq酶、dNTP、DL2000 DNA marker、瓊脂糖凝膠購自TaKa-Ra 公司；MgSO4和甜菜堿為Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品；EvaGreen 購自Biotium 公司；2720 型PCR 儀購自ABI公司；Chromo 4型熒光定量PCR儀、電泳儀購自BIO-RAD公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)

常規(guī)LAMP 技術(shù)含有1 對(duì)外引物、1 對(duì)內(nèi)引物，選擇加入1 對(duì)環(huán)引物，可在等溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增。本研究根據(jù)惡性瘧原蟲18S rRNA 基因保守區(qū)設(shè)計(jì)了 一組引 物[13-14]，分別為F3、B3、FIP、BIP、fLoop1、fLoop2、bLoop1 和bLoop2，第2 對(duì)環(huán)引物的加入，使等溫?cái)U(kuò)增回環(huán)的速率增加，從而縮短反應(yīng)的時(shí)間。引物序列見表1。

1.3 惡性瘧原蟲DNA的提取

嚴(yán)格按QIAGEN DNA 抽提試劑盒說明書提取DNA，-20℃保存。

1.4 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

快速LAMP 反應(yīng)體系：10×緩沖液2.5 μL，引物混合 物1 μL（F3、B3 各1 μmol/L，F(xiàn)IP、BIP 各15 μmol/L，fLoop1、fLoop2 各5 μmol/L，bLoop1、bLoop2各15 μmol/L），模板DNA 1 μL，8 UBstDNA 聚合酶1 μL，甜菜堿（8 mol/L）2 μL，dNTP（10 mmol/L）2 μL，MgSO4（100 mmol/L）1.2 μL，1.25 μL 20×的EvaGreen，加入滅菌雙蒸水補(bǔ)足25 μL。

加入環(huán)引物的LAMP 引物混合物為F3、B3 各1 μmol/L，F(xiàn)IP、BIP 各15 μmol/L，fLoop1、fLoop2 各5 μmol/L，其他成分與雙環(huán)引物L(fēng)AMP一致。

反應(yīng)條件：63℃ 55 s，熒光采集5 s，100 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在熒光定量PCR儀中進(jìn)行。

1.5 靈敏度試驗(yàn)

以DNA 為模板，用PCR 混合引物進(jìn)行擴(kuò)增，將PCR 產(chǎn)物純化回收試劑盒進(jìn)行純化回收，對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物測定D260nm值，根據(jù)產(chǎn)物長度和D260nm值計(jì)算拷貝數(shù)，將產(chǎn)物以1/10 梯度稀釋，最終稀釋到1×100拷貝/μL。分別取1 μL 作為模板加入反應(yīng)體系中，在63℃恒溫條件下反應(yīng)60 min。在熒光定量PCR 儀上觀察實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)曲線，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行65℃到95℃溶解曲線試驗(yàn)，每增加1℃保溫30 s，檢測熒光強(qiáng)度，試驗(yàn)結(jié)束后取2 μL 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，同時(shí)用外引物進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測靈敏度。

表1 惡性瘧原蟲快速LAMP擴(kuò)增引物

1.6 特異性試驗(yàn)

同時(shí)提取間日瘧、卵形瘧和三日瘧等感染者全血核酸，同時(shí)用雙環(huán)LAMP方法進(jìn)行檢測。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

根據(jù)靈敏度試驗(yàn)結(jié)果，選擇陰性、1×100拷貝/μL和1×106拷貝/μL 濃度的cDNA 模板分別進(jìn)行快速LAMP，每份樣本各取1 μL 重復(fù)3 次，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行檢測，觀察反應(yīng)的Ct 值，根據(jù)Ct 值計(jì)算變異系數(shù)，對(duì)該方法的重復(fù)性進(jìn)行考核。

1.8 樣本檢測

采用該方法對(duì)全省口岸送檢的29 例全血標(biāo)本及30例健康體檢者全血標(biāo)本進(jìn)行檢測，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

在熒光定量PCR 儀上觀察實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)，結(jié)果見圖1；取2 μL 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖2，1～5 泳道均出現(xiàn)細(xì)密的階梯狀條帶，表示有陽性擴(kuò)增反應(yīng)?？梢耘卸ū痉椒ǖ臋z測極限約為1×101拷貝/μL。PCR 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果見圖3，可見檢測限為1×102拷貝/μL。經(jīng)比較雙環(huán)引物L(fēng)AMP 檢測方法的靈敏度比PCR 法高一個(gè)數(shù)量級(jí)。溶解曲線試驗(yàn)結(jié)果見圖4，可見每個(gè)不同濃度的產(chǎn)物溶解曲線溫度都在同一點(diǎn)上。

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

采用惡性瘧快速LAMP 方法進(jìn)行檢測，電泳反應(yīng)結(jié)果見圖5，惡性瘧出現(xiàn)與普通LAMP 反應(yīng)相同的的階梯狀條帶。此外，陰性對(duì)照、間日瘧、卵形瘧、三日瘧核酸的檢測結(jié)果均為陰性，由此顯示了該方法具有很好的特異性。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)實(shí)時(shí)熒光LAMP 的結(jié)果，記錄各次試驗(yàn)的Ct 值。根據(jù)Ct 值計(jì)算SD值及變異系數(shù)（CV），結(jié)果見表2，強(qiáng)陽性及臨界值樣本的CV值均小于5%，重復(fù)性良好。

2.4 2種擴(kuò)增方法的反應(yīng)時(shí)間比較

根據(jù)實(shí)時(shí)熒光檢測結(jié)果可見，快速LAMP 的反應(yīng)時(shí)間最快可達(dá)15 min 左右，加入環(huán)引物的LAMP反應(yīng)時(shí)間為25 min左右。實(shí)時(shí)熒光檢測見圖6。

2.5 臨床樣本檢測

采用快速LAMP 技術(shù)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)29 例口岸送檢本實(shí)驗(yàn)室的樣本中有8 例惡性瘧陽性，與熒光定量PCR 檢測結(jié)果相符。30 例健康體檢者檢測結(jié)果全部為陰性。

3 討論

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)由于操作簡單、不需要昂貴的專用實(shí)驗(yàn)儀器、反應(yīng)在1～1.5 h 內(nèi)完成、靈敏度高，而吸引了大量研究力量投入該領(lǐng)域的研究。我們改進(jìn)的方法縮短了檢測時(shí)間，在實(shí)際檢測應(yīng)用中和定量PCR 檢測結(jié)果相符，證明本檢測方法具有應(yīng)用價(jià)值。但2對(duì)環(huán)引物設(shè)計(jì)比1對(duì)引物設(shè)計(jì)要困難，對(duì)于擴(kuò)增片段太短和能設(shè)計(jì)引物的位置太少的核酸檢測并不適合。對(duì)能設(shè)計(jì)雙環(huán)引物的LAMP 擴(kuò)增來說，能不能真正提高擴(kuò)增效率需要通過大量實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

圖1 惡性瘧原蟲雙環(huán)引物L(fēng)AMP靈敏度檢測實(shí)時(shí)熒光結(jié)果

圖2 惡性瘧原蟲雙環(huán)引物L(fēng)AMP產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖3 惡性瘧原蟲PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

表2 惡性瘧原蟲雙環(huán)引物L(fēng)AMP重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 惡性瘧原蟲雙環(huán)引物L(fēng)AMP產(chǎn)物溶解曲線試驗(yàn)

圖5 雙環(huán)引物L(fēng)AMP特異性試驗(yàn)結(jié)果

圖6 雙環(huán)引物和環(huán)引物擴(kuò)增速度比較

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