李亞東，李智華，畢研偉，陳晨，寸韡

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明 650118；2.云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650118

1989年Choo等[1]通過克隆方法鑒定了丙肝病毒（hepatitis C virus，HCV）基因組，加速了HCV 研究進(jìn)程；2005 年，HCV 2a 型JFH1 分離株在少數(shù)細(xì)胞系內(nèi)獲得體外培養(yǎng)[2-3]。病毒研究過程中常須對其滴度進(jìn)行測定，但HCV 感染細(xì)胞后產(chǎn)生的細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）不明顯，這為HCV 滴度測定帶來了一定難度。2005 年，免疫熒光法（IFA）被用于HCV 滴度的測定[4]，至今仍是測定HCV 滴度的主要方法。由于塑料細(xì)胞培養(yǎng)板在熒光顯微鏡下會產(chǎn)生衍射，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而玻璃細(xì)胞培養(yǎng)板較為昂貴，因此一般都采用細(xì)胞爬片進(jìn)行IFA 實(shí)驗(yàn)，但取出細(xì)胞爬片時(shí)易導(dǎo)致部分被感染的細(xì)胞損失，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性。另一方面，由于顯微鏡下一個(gè)視野不能觀察到整塊細(xì)胞爬片，因此計(jì)數(shù)誤差較大。該方法也難以避免病毒二次感染的產(chǎn)生，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不精確。

2009 年，免疫組化技術(shù)（IHC）被用于HCV 滴度的測定，該方法無須制備細(xì)胞爬片，可直接在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)感染并進(jìn)行后續(xù)免疫組化實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)96 孔板中被感染孔計(jì)算TCID50，得到HCV 滴度[5]。這相比IFA 測定滴度方法更加精確，但成本依然相對較高。我們對IHC 技術(shù)測定HCV 滴度的方法加以改進(jìn)，建立了一種更加簡便、經(jīng)濟(jì)、安全的測定HCV 滴度的方法，為HCV 的基礎(chǔ)研究及臨床藥物評估提供有效手段。

1 材料與方法

1.1 材料

Huh7 細(xì)胞購于中國科學(xué)院動物研究所；HCV JFH1 病毒株為本實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM 培養(yǎng)基、非必需氨基酸購于Hyclone 公司；胎牛血清（FBS）購于Gibco 公司；抗HCV 核心蛋白單克隆抗體購于Viro-Stat 公司；羊抗鼠二抗-HRP 購于Thermo Pierce 公司；ImmPress羊抗鼠二抗-HRP及ImmPACT DAB 顯色試劑購于Vector 公司；瓊脂糖購于Invitrogen 公司；甲基纖維素購于Sigma 公司；96 孔板購于Costar公司。

1.2 病毒感染

Huh7 細(xì)胞按8×103/孔于96 孔板中采用含10%FBS 的DMEM 完全培 養(yǎng)基培 養(yǎng)16 h，取10 μL HCV，用DMEM 完全培養(yǎng)基按1/10 梯度稀釋為10-1～10-5，吸棄96 孔板中的培養(yǎng)基，將病毒稀釋液按50 μL/孔輕輕加入96孔板，每個(gè)稀釋度設(shè)定3個(gè)復(fù)孔以驗(yàn)證此方法的可重復(fù)性，搖勻后置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行感染，每隔1 h輕輕搖晃96孔板，使病毒均勻感染細(xì)胞，10 h 后吸棄病毒稀釋液，按100 μL/孔加入甲基纖維素-DMEM（含2%FBS）半固體培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d。

1.3 HCV滴度測定

感染HCV 的Huh7細(xì)胞培養(yǎng)4 d后，輕輕吸棄甲基纖維素-DMEM 培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 于-20℃預(yù)冷的甲醇，-20℃固定10 min，吸棄甲醇，PBS 輕洗2次，用100 μL含3% H2O2的PBS室溫處理5 min[5]；PBS洗2次，加入50 μL含1% BSA和0.2%脫脂奶粉的PBS，4℃封閉過夜；吸棄封閉液，每孔加入30 μL用PBST（含0.5‰吐溫-20的PBS）以1∶500稀釋的抗HCV 核心蛋白單克隆抗體，室溫輕輕搖動1 h；吸棄一抗，PBS 洗2 次，PBST 洗1 次；每孔加入30 μL 用PBST以1∶1稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠聚合二抗，室溫輕輕搖動30 min；吸棄二抗，PBS 洗2 次，PBST 洗1 次；每孔加入50 μL 新鮮配制的DAB顯色試劑，室溫作用1～10 min至看到棕色病毒斑；吸棄DAB 染液，PBS 洗2 次，加100 μL PBS，在低倍倒置顯微鏡下觀察感染病毒的細(xì)胞斑塊并計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 聚合二抗聯(lián)合DAB 能夠使被HCV 感染的細(xì)胞清晰顯色

目前測定HCV 滴度的主要方法是IFA 法，鑒于IFA 法測定HCV 滴度存在的一些不足，我們擬通過免疫組化技術(shù)在96 孔板內(nèi)使被感染細(xì)胞顯色，減少IFA 法制備細(xì)胞爬片過程中造成的細(xì)胞損失，在一定程度上提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。

為了能夠完好地保存細(xì)胞內(nèi)病毒的抗原性進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，需要對細(xì)胞進(jìn)行固定。常用的固定劑有95%酒精、4%多聚甲醛、10%福爾馬林溶液、0.5%戊二醛、冷丙酮、冷甲醇等[6]。本實(shí)驗(yàn)比較了冷甲醇、4%多聚甲醛、10%福爾馬林溶液3種常用的固定劑，均能起到很好的固定效果（圖1）。由于冷甲醇相對較易獲得，固定細(xì)胞的同時(shí)能夠滅活病毒，對人體的危害相對較小，因此本研究后續(xù)試驗(yàn)采用甲醇進(jìn)行細(xì)胞固定。

固定后的細(xì)胞保持了蛋白的抗原性，可以進(jìn)行后續(xù)免疫組化實(shí)驗(yàn)。然而，我們采用常規(guī)免疫組化技術(shù)進(jìn)行后續(xù)操作，即封閉后用抗HCV 核心蛋白單克隆抗體進(jìn)行孵育，利用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠二抗識別鼠源一抗并采用DAB 顯色時(shí)，未觀察到細(xì)胞顯色；換用了HRP 標(biāo)記的羊抗鼠聚合二抗及DAB 顯色試劑，結(jié)果能觀察到明顯的棕色病毒感染斑（圖1）。

2.2 采用0.8%～1%的甲基纖維素能夠限制病毒在胞間感染形成肉眼可見斑塊

測定HCV 滴度時(shí)，細(xì)胞被病毒感染會形成二次感染，通過免疫組化技術(shù)將被感染細(xì)胞顯色，通過TCID50方法可計(jì)算病毒滴度，但較浪費(fèi)抗體，成本較高。因此，我們擬采用噬斑法計(jì)數(shù)病毒滴度。病毒感染細(xì)胞后，通過在細(xì)胞表面添加覆蓋物，可以限制病毒在細(xì)胞間感染。常用于病毒滴度測定的覆蓋物為瓊脂糖，但HCV 感染細(xì)胞不能形成可見的噬斑，因此在病毒感染細(xì)胞后，需要將覆蓋物移除以便于后續(xù)進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，而瓊脂糖覆蓋后凝固成塊狀，不易除去，因此需要選用一種既不完全凝固又能在病毒顆粒中自由流動的覆蓋物。甲基纖維素呈半固體狀，對細(xì)胞無毒害，易吸除，且不會同時(shí)吸走細(xì)胞，可以作為被實(shí)驗(yàn)的覆蓋物。我們選用粘度為4000 cP 的甲基纖維素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，比較了0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%、2%共8 個(gè)不同終濃度的甲基纖維素進(jìn)行覆蓋，綜合考慮其對病毒自由流動的限制以及移除的難易，發(fā)現(xiàn)終濃度為0.8%～1.0%的甲基纖維素既容易移除同時(shí)也能很好地限制病毒于細(xì)胞間感染，形成明顯斑塊（圖2）。

圖1 不同固定液及酶標(biāo)二抗使被感染細(xì)胞顯色結(jié)果

2.3 建立的滴度測定方法具有可重復(fù)性

為了驗(yàn)證所建立的滴度測定方法的穩(wěn)定性與可重復(fù)性，測滴度時(shí)樣品設(shè)立3 個(gè)復(fù)孔，低倍顯微鏡下對感染斑計(jì)數(shù)。為了提高計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，將96 孔板每個(gè)孔呈“十”字劃線，-3 稀釋度的感染斑分布較均勻，感染斑個(gè)數(shù)為30±5（3 個(gè)復(fù)孔感染斑個(gè)數(shù)分別為32、26、35），各復(fù)孔之間感染斑個(gè)數(shù)無顯著性差異，說明該滴度測定方法具有穩(wěn)定性和可重復(fù)性（圖3）。以此稀釋度計(jì)算，此批HCV 的滴度為6.2×105FFU/mL。

圖2 顯微鏡下HCV形成的感染斑

圖3 96孔板HCV滴度計(jì)算

3 討論

HCV 實(shí)現(xiàn)體外培養(yǎng)后，免疫學(xué)技術(shù)被運(yùn)用到HCV 滴度測定中，發(fā)展出IFA 測定方法[4,7-8]，成為HCV 滴度測定的主要方法，但仍然存在取出細(xì)胞爬片過程中會導(dǎo)致被感染細(xì)胞的損失，以及熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)誤差等不足。2009 年，IHC 技術(shù)被用于HCV 滴度測定[5]，將HCV 感染Huh7 細(xì)胞后，采用特異性的一抗識別HCV 蛋白，再采用HRP標(biāo)記的二抗與一抗特異性結(jié)合，最后用DAB 顯色，通過統(tǒng)計(jì)HCV 感染細(xì)胞情況計(jì)算出HCV 的TCID50，從而得到病毒滴度。TCID50法測定HCV 滴度要浪費(fèi)大量抗體，成本較高。本研究建立的測定HCV 滴度的方法，通過加入甲基纖維素限制病毒于胞間感染，利用聚合二抗及DAB 顯色形成肉眼可見的病毒斑塊，僅需一塊96 孔板就可測定4～6 個(gè)HCV 滴度，在保證結(jié)果精確的同時(shí)較為節(jié)約抗體。

本研究采用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗識別鼠源抗HCV 核心蛋白的單克隆抗體，再用DAB顯色劑顯色，結(jié)果常規(guī)Western印跡所用的酶標(biāo)二抗未使DAB 顯色；換用了高靈敏度的聚合型酶標(biāo)二抗后，能夠使DAB 底物較好地顯色，使HCV 感染斑清晰呈現(xiàn)出來。在感染斑計(jì)數(shù)時(shí)，稀釋度較低，感染斑個(gè)數(shù)較多，導(dǎo)致各個(gè)感染斑之間有相連的情況，計(jì)數(shù)誤差較大；而稀釋度較高時(shí)，各孔之間感染斑個(gè)數(shù)差異較大，若以此計(jì)算滴度，則會導(dǎo)致大的誤差。本實(shí)驗(yàn)中，10-3稀釋度在96 孔板各孔中出現(xiàn)約30 個(gè)感染斑，各感染斑之間分布較均勻，且復(fù)孔之間感染斑數(shù)無顯著性差異，因此以此感染斑數(shù)計(jì)算病毒的滴度。由于顯微鏡下計(jì)數(shù)易導(dǎo)致漏計(jì)或重復(fù)計(jì)數(shù)，可將每個(gè)孔劃線分成數(shù)個(gè)區(qū)域，以提高計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確度。同時(shí)，該方法形成的感染斑達(dá)到了肉眼可見的程度，可以直接計(jì)數(shù)或拍成照片后計(jì)數(shù)，若以更大的24孔板測定HCV 滴度，直接通過肉眼計(jì)數(shù)感染斑會更加容易。

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