郭靖 ，王濤，李齊宏，李玲，梁迎春，洪甜，梅國徽，冀全博，紀(jì)貝貝，徐小潔，葉棋濃

1.大連醫(yī)科大學(xué) 腫瘤干細(xì)胞研究院，遼寧 大連 116044；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850；3.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 附屬醫(yī)院，北京 100071

表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）是Ⅰ型受體酪氨酸激酶家族成員[1]。EGFR 是一種跨膜糖蛋白、細(xì)胞膜受體，其基因位于人類第7 號染色體短臂上。EGFR 由1186 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，相對分子質(zhì)量為170×103，由胞外區(qū)、胞內(nèi)配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)三部分組成[2]。胞外區(qū)包含L-1/2兩個(gè)富含亮氨酸序列和CR-1/2兩個(gè)富含半胱氨酸序列，是621 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的與配體結(jié)合的N端區(qū)；跨膜區(qū)是23個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的α螺旋；胞內(nèi)區(qū)由近膜區(qū)（juxtam embrane region，JM）、酪氨酸蛋白激酶區(qū)和C 端構(gòu)成，含有542 個(gè)氨基酸殘基。受其相應(yīng)配體誘導(dǎo)激活之后，EGFR 可參與細(xì)胞信號通路，通過不同的受體類型和磷酸化結(jié)合位點(diǎn)，激活不同的信號蛋白，參與細(xì)胞分化、增殖、遷移、侵襲和損傷修復(fù)[3]。因此，EGFR 發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)依賴于其胞外區(qū)和胞內(nèi)激酶區(qū)的完整性及穩(wěn)定性。

為了進(jìn)一步探索EGFR 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的具體功能，我們將EGFR 的胞外結(jié)構(gòu)域（extracellular domain，ED）和胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域（protein kinase domain，PKD）分別構(gòu)建在原核表達(dá)載體上，表達(dá)獲得融合蛋白GST-EGFR-ED 和GST-EGFR-PKD，為深入研究EGFR在腫瘤中的作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α、Rossate，原核表達(dá)載體pGEXKG 為本室保存；DNA 膠回收試劑盒、PCR 產(chǎn)物回收試劑盒為北京天根生物科技有限公司產(chǎn)品；XbaⅠ和XhoⅠ限制性核酸內(nèi)切酶、Prime STAR HS DNA 聚合酶、T4DNA 連接酶為TaKaRa 公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒為Promega 公司產(chǎn)品；GST-Sepharose 4B 珠子購自Pharmacia 公司；DMEM 及小牛血清均購自Gibco 公司；VigoFect 為威格拉斯生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗GST、Flag 單克隆抗體購自Sigma 公司；引物由北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成；測序由北京奧科生物技術(shù)公司完成。

1.2 人EGFR ED、PKD編碼基因的擴(kuò)增

分別設(shè)計(jì)人EGFR ED 和PKD 基因擴(kuò)增引物序列（表1），上、下游引物分別含XbaⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。以人乳腺文庫為模板，用Prime STAR HS DNA聚合酶PCR 擴(kuò)增目的片段。擴(kuò)增條件：95℃5 min預(yù)變性；95℃30 s、58℃30 s、72℃130 s，32 個(gè)循環(huán)；72℃延伸50 s。擴(kuò)增產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖DNA 膠檢測，用瓊脂糖DNA膠回收試劑盒回收。

1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及原核表達(dá)鑒定

EGFR ED 和PKD 膠回收產(chǎn)物用XbaⅠ、XhoⅠ雙酶切，載體pGEX-KG也經(jīng)相同酶雙酶切膠回收載體大片段；酶切產(chǎn)物經(jīng)T4DNA 連接酶于16℃連接4 h 后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂LB（含氨芐西林）平板，37℃培養(yǎng)過夜；挑選單克隆，做菌液PCR，再挑選陽性克隆，接種于LB（含氨芐西林）培養(yǎng)基中，37℃振蕩活化14 h；提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，正確質(zhì)粒送北京奧科生物技術(shù)公司測序。

1.4 融合蛋白的小量誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

將測序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossate 感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落，37℃振蕩培養(yǎng)至D600nm為0.6～1.0，加入IPTG 至終濃度1 mmol/L，誘導(dǎo)4 h后收集菌液離心，菌體行Western印跡檢測。

1.5 融合蛋白的純化

將小量誘導(dǎo)表達(dá)的重組Rossate 菌和含有pGEX-KG 空載體的Rossate 菌接種于LB（含氨芐西林）培養(yǎng)基中，37℃振蕩活化過夜；按10%的比例轉(zhuǎn)接同種液體培養(yǎng)基中，29℃振蕩培養(yǎng)至D600nm為0.4～0.6時(shí)加入IPTG 至終濃度0.1 mmol/L，19℃繼續(xù)培養(yǎng)20～24 h；離心收集菌體，按Pharmacia 公司提供的純化方法行蛋白純化：加入裂解液，超聲波破碎菌體，12 000 r/min 離心收集上清，加入適量GST-Sepharose 4B珠子，4℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合3 h，3000 r/min低速離心收集珠子，緩沖液充分洗脫未結(jié)合蛋白質(zhì)，以Western印跡鑒定純化的蛋白，作為誘餌蛋白。

2 結(jié)果

2.1 人EGFR ED、PKD編碼區(qū)基因的克隆

以人乳腺文庫為模板，按前述條件分別擴(kuò)增EGFR ED 和PKD 編碼序列，獲得的ED 片段大小為582 bp，PKD為811 bp，與預(yù)期一致（圖1）。

2.2 重組表達(dá)載體pGEX-GST-EGFR-ED、pGEXGST-EGFR-PKD 的構(gòu)建與鑒定

用Xba Ⅰ和XhoⅠ雙酶切EGFR ED、PKD 的PCR 產(chǎn)物，分別與經(jīng)同樣酶切的pGEX-KG 載體連接，2種連接產(chǎn)物均轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布LB（含氨芐西林）平皿，挑取克隆提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，得到與預(yù)期片段大小相符的外源基因插入片段，對照空載體雙酶切后無此片段，表明EGFR ED、PKD 基因的編碼序列已正確插入載體上游的多克隆位點(diǎn)中。DNA 測序結(jié)果顯示，插入表達(dá)載體pGEX-KG中的EGFR ED 和PKD 編碼序列完整，方向正確，無突變發(fā)生（數(shù)據(jù)略）。見圖2、3。

2.3 融合蛋白GST-EGFR-EDG 和GST-EGFRPKD的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

圖1 目的基因的PCR擴(kuò)增

將pGEX-KG 空載體、pGEX-EGFR-ED 和pGEX-EGFR-PKD 融合表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossate 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG 小量誘導(dǎo)后，Western 印跡檢測，GST-EGFR-ED 和GST-EGFR-PKD 融合蛋白獲得正確表達(dá)（圖4）。

2.4 融合蛋白GST-EGFR-ED、GST-EGFR-PKD 的純化

利用GST-Sepharose 4B 親和珠子純化獲得融合蛋白，考馬斯亮藍(lán)染色檢測結(jié)果顯示獲得一定量的純度較高的GST、GST-EGFR-ED 和GST-EGFRPKD融合蛋白（圖5）。

2.5 GST pull-down分析

圖2 重組質(zhì)粒pGEX-GST-EGFR-ED 和pGEX-GST-EGFR-PKD 的菌液PCR電泳結(jié)果

圖3 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

圖4 融合蛋白的Western印跡分析

為進(jìn)一步研究純化的GST-EGFR-ED 和GSTEGFR-PKD 能否與Memo（mediator of ErbB2-driven cell motility）蛋白相互作用，將帶有GST-EGFRED 和GST-EGFR-PKD 的純化珠子與過表達(dá)Myc-Her2 的293T 細(xì)胞裂解液于4℃結(jié)合后，用Myc-Her2抗體行Western 印跡檢測。結(jié)果顯示，GST-EGFRPKD 可與Myc-Her2 結(jié)合，在符合Myc-Her2 大小的相對分子質(zhì)量約180×103位置顯示出特異性條帶（圖6），而GST 載體蛋白及GST-EGFR-ED 在同一位置無此條帶，說明GST-EGFR-PKD 能夠與Myc-Her2特異地相互作用，GST 標(biāo)簽并不影響蛋白的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能。

3 討論

細(xì)胞表面EGFR 的表達(dá)是其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活的基礎(chǔ)，也是原癌基因的表達(dá)產(chǎn)物[4]。EGFR 在多種腫瘤中高表達(dá)，可促進(jìn)血管生成及腫瘤細(xì)胞的增殖、黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[5-7]。并且，EGFR 過度表達(dá)的細(xì)胞表現(xiàn)出對促凋亡藥的抵抗性[8]。另外，EGFR 直接參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程[9]。EGFR 的活化需要經(jīng)過3 個(gè)過程[10]：①EGFR 與配體結(jié)合后導(dǎo)致受體形成同源二聚體，也可與其他EGFR 家族成員形成異源二聚體；②形成的二聚體促使EGFR 胞內(nèi)區(qū)6 個(gè)特異的受體酪氨酸殘基磷酸化，分別將外界各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)；③當(dāng)細(xì)胞核接收到信號傳導(dǎo)后，核內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄水平增加，EGFR的表達(dá)增加。

圖5 純化的GST-EGFR-ED、GST-EGFR-PKD 融合蛋白SDS-PAGE分析

圖6 GST pull-down檢測目的蛋白與Myc-Her2蛋白的相互作用

Her2 過表達(dá)引起Ras/MAPK、PI3K/Akt 等信號通路的一系列反應(yīng)[11-12]。王瓊等證明Her2 和EGFR正相關(guān)，并推測兩者可能在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移等方面存在協(xié)同作用[13]。同時(shí)，Ling等證明EGFR和Her2之間存在相互作用[14]。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了EGFR 不同區(qū)域的原核表達(dá)載體，并與Her2 進(jìn)行了GST pulldown 實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示Her2 結(jié)合在EGFR 胞內(nèi)激酶區(qū)，而不與EGFR 胞外區(qū)結(jié)合。這可以解釋Her2 與EGFR 正相關(guān)并能協(xié)同影響信號通路的現(xiàn)象，為進(jìn)一步研究兩者的功能提供了另一條途徑。

EGFR 是具有良好前景的腫瘤診斷和治療靶點(diǎn)。阻斷EGFR 表達(dá)的靶向抑制劑能夠增加腫瘤細(xì)胞的放射敏感性，提高放射治療的療效，其機(jī)制可能是EGFR 的靶向抑制劑抑制了腫瘤細(xì)胞的EGFR 表達(dá)，阻斷了EGFR 信號傳導(dǎo)通路，從而加速細(xì)胞凋亡，干擾細(xì)胞周期分布及細(xì)胞輻射后DNA 損傷的修復(fù)[15]。但是，EGFR 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后等方面中的具體作用機(jī)制還有待探究。我們克隆了GSTEGFR-ED 和GST-EGFR-PKD 基因并獲得其原核表達(dá)融合蛋白，為后續(xù)進(jìn)一步研究其在腫瘤發(fā)生發(fā)展、蛋白相互作用及抗體制備等方面的作用奠定了實(shí)驗(yàn)學(xué)基礎(chǔ)。

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