王希，陳麗*，趙春雷，李彥麗，丁廣洲，賈海倫，徐杰，廖鵬

不同方法對甜菜葉片基因組DNA提取效果比較與適用性探討

王希1，2，3，4，陳麗1，2，3，4*，趙春雷1，2，3，4，李彥麗1，2，3，4，丁廣洲1，2，3，4，賈海倫1，2，3，4，徐杰5，廖鵬5

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，黑龍江哈爾濱150080；2.黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，黑龍江哈爾濱150080；3.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150080；4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150080；5.黑龍江大學(xué)研究生學(xué)院，黑龍江哈爾濱150080)

對比了7種不同原理的提取方法對甜菜葉片基因組DNA的提取效果袁從得率堯純度堯耗時等多方面分析DNA提取效果袁為不同研究目的確定了最適的提取方法遙最終確定了SDS法是最適合自甜菜葉片中低成本大量提取DNA的方法袁CTAB也基本能滿足要求袁吸附柱法是最適合高通量提取優(yōu)質(zhì)DNA的方法袁堿裂解法是最適合樣品迅速檢測的方法袁必要時可改用ROSE法遙檸檬酸鈉法產(chǎn)物質(zhì)量不高且操作不夠簡便袁尿素法產(chǎn)物純度過低且耗時過長袁在應(yīng)用上未見優(yōu)勢。

甜菜；基因組DNA；提取方法

基因組DNA是大部分分子生物學(xué)、基因工程、分子遺傳學(xué)研究的試驗(yàn)材料，其提取方法既是重要的基礎(chǔ)性技術(shù)，又是影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因素之一。由于DNA分子在生物體內(nèi)的分布及含量不同，對于不同物種、不同組織，需要選擇不同的提取方法；不同方法在得率、純度、效率、難度、成本等方面會有差異，也需要根據(jù)不同的研究目的進(jìn)行選擇。甜菜的分子生物學(xué)研究尚處于起步階段，有針對性地探討適合甜菜葉片組織的DNA提取方法，并針對不同用途建立最適宜的方法，有助于保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性和提高工作效率，對甜菜分子生物學(xué)研究的發(fā)展具有重要的價(jià)值。

經(jīng)典的基因組DNA提取方法借助表面活性劑SDS裂解細(xì)胞，并按后期DNA的純化方式分成蛋白酶K-苯酚法、甲酰胺法、纏繞法等，另有不使用表面活性劑，僅通過物理方法（如煮沸）破壞細(xì)胞，得到DNA的粗提物的提取方法[1]。如今，研究人員在這些方法的基礎(chǔ)上，通過調(diào)整裂解液成分與DNA純化方式，已形成了SDS法、CTAB法、尿素法、檸檬酸鈉法等幾種方法[2-3]，并根據(jù)各自研究物種的特征，對提取細(xì)節(jié)進(jìn)行了適當(dāng)?shù)恼{(diào)整[4-8]；另有眾多公司應(yīng)用復(fù)合的表面活性劑與高鹽溶液，并與硅膠膜吸附柱相結(jié)合，研制出了商品化的吸附柱法；還有人開發(fā)或是改進(jìn)了一些適用于DNA快速提取的方法，包括堿裂解法[9]、一步式提取法（rapid one-step extraction ROSE)[10-11]等方法，以滿足特定的研究需要。也有研究者對甜菜的基因組DNA提取方法進(jìn)行過初步的探討，但研究主要集中在對方法的改良上，且采用的方法集中于CTAB法[12-17]。

為方便不同用途的甜菜研究，本文分別用堿裂解法、SDS法、尿素法、檸檬酸鈉法、吸附柱法、CTAB法、ROSE法7種不同的方法對甜菜葉片基因組DNA進(jìn)行了提取，從得率、純度、雜質(zhì)對后續(xù)實(shí)驗(yàn)影響程度、操作耗時等多方面分析DNA提取效果，對這7種方法進(jìn)行對比，為不同研究目的篩選最適宜的提取方法。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

植物材料為課題組所保存的甜菜品系YZ19，取幼苗期（葉片數(shù)不超過10片）的幼嫩葉片。

1.2基因組DNA提取方法

CTAB法、SDS法、尿素法、檸檬酸鈉法具體操作參考伍艷芳等的方法[4]，堿裂解法提取基因組DNA具體操作參考李筱婷與吳則東的方法[9，12]，ROSE法參考Steiner和李文鳳的方法[10-11]，吸附柱法使用Axygen公司的試劑盒（AP-MN-MS-GDNA-50G)，方法見說明書。為排除RNA殘留對電泳遷移率的干擾，在提取過程中進(jìn)行RNA酶消化。具體的葉片用量與產(chǎn)物的最終體積見表1。

1.3檢測

產(chǎn)物完整性檢測：通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，具體方法見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[1]。

得率與純度檢測：利用紫外分光光度計(jì)檢測DNA樣品在230nm，260nm，280nm波長下的吸光值（opticaldensity，OD)，樣品稀釋倍數(shù)1000倍。用OD260計(jì)算DNA得率，分別用OD260/OD280及OD260/OD230值反映蛋白質(zhì)與小分子雜質(zhì)殘留程度。得率（μg/mg)=OD260×50（μg/μL)×產(chǎn)物溶解體積（μL)÷起始組織質(zhì)量（mg)。

表1　各方法葉片用量與產(chǎn)物最終體積

1.4雜質(zhì)殘留對后續(xù)研究影響的分析

用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行短時間酶切，并以產(chǎn)物為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR)，檢測所得DNA中殘留雜質(zhì)對后續(xù)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是否有不良影響，間接地檢測各種雜質(zhì)的殘留情況。酶切使用EcoR玉，PCR引物選擇特異性中等的引物。

圖1　不同方法所得DNA的電泳結(jié)果

2　結(jié)果與分析

2.1DNA提取結(jié)果與完整性分析

將各方法提取產(chǎn)物平行進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1。瓊脂糖凝膠電泳可反映DNA產(chǎn)物的完整性，并可粗略地反映DNA的產(chǎn)量。基因組DNA在電泳結(jié)果中應(yīng)呈現(xiàn)＞10kb的單一條帶，若在條帶下方有彌散狀條帶，表明產(chǎn)物有降解或者斷裂。由圖1可見，吸附柱法所得產(chǎn)物為比較清晰的條帶，表明產(chǎn)物的完整性比較好；SDS法、CTAB法、ROSE法、檸檬酸鈉法的彌散條帶亮度遠(yuǎn)低于DNA主帶，表明產(chǎn)物有輕微的降解；尿素法產(chǎn)物降解比較嚴(yán)重，主帶幾乎已不可見；堿裂解法產(chǎn)物濃度低，電泳后無可見的DNA條帶，表明產(chǎn)物中DNA濃度低于本次瓊脂糖凝膠電泳中最低的條帶濃度。

2.2產(chǎn)物得率及純度分析

利用紫外分光光度計(jì)檢測并計(jì)算DNA產(chǎn)物的得率及雜質(zhì)殘留程度，結(jié)果如表2。

在紫外吸收值可檢測的6種方法中，吸附柱法得率最高，尿素法得率最低。在所有7種方法中，得率最低的是堿裂解法，由于其產(chǎn)物濃度很低，無法檢測紫外吸收值，只能根據(jù)電泳時無明顯的DNA條帶的現(xiàn)象，推斷電泳樣品濃度低于同次電泳時的最低條帶濃度，即尿素法的條帶濃度，再根據(jù)溶解體積，推斷其得率低于0.7μg/mg。

表2　不同方法的DNA得率與雜質(zhì)殘留程度分析

圖2　不同方法所得DNA的酶切結(jié)果

圖3　不同方法所得DNA的PCR結(jié)果

據(jù)紫外吸收值推斷除堿裂解法之外的6種方法的雜質(zhì)殘留情況。DNA的吸收峰在260nm左右，大部分蛋白質(zhì)的吸收峰在280nm左右，酚類物質(zhì)與鹽分的吸收峰在230nm左右，因此OD260/OD280可反映蛋白質(zhì)殘留情況，OD260/OD230可反映酚和鹽類等小分子殘留情況。在紫外吸收值可檢測的6種方法中，ROSE法、尿素法和檸檬酸鈉法的OD260/OD280顯著低于另外3種方法，表明其產(chǎn)物中蛋白質(zhì)殘留較多；CTAB法和尿素法的OD260/OD230顯著低于另外4種方法，表明產(chǎn)物中小分子殘留較多。

2.3雜質(zhì)殘留對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響

在DNA產(chǎn)物中，若蛋白質(zhì)雜質(zhì)殘余過多，容易影響酶切效率；若酚類、多糖、無機(jī)鹽等雜質(zhì)殘余過多，容易影響PCR重復(fù)性和特異性。因此，采用短時間酶切與PCR這2種方法分析殘留雜質(zhì)對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響。酶切結(jié)果見圖2，PCR結(jié)果見圖3。

由圖2可見，尿素法所得產(chǎn)物的酶切效率很低，幾乎看不到消化后的彌散狀條帶，表明殘留雜質(zhì)比較嚴(yán)重地抵制了限制性內(nèi)切酶的活性。CTAB法、吸附柱法和SDS法的酶切產(chǎn)物條帶呈正常的大面積彌散狀，表明這3種方法所得產(chǎn)物純度比較高，未對酶活性產(chǎn)生明顯的干擾。檸檬酸鈉法和ROSE法的產(chǎn)物片段較小，表明產(chǎn)物被過度消化，有可能是雜質(zhì)中殘留著降解DNA的酶類。

由圖3可見，吸附柱法所得產(chǎn)物的PCR結(jié)果重復(fù)性和特異性最好，表明產(chǎn)物中幾乎不含有影響PCR結(jié)果的雜質(zhì)。ROSE法、檸檬酸鈉法、堿裂解法的產(chǎn)物PCR特異性也較高，但重復(fù)性較差，3種方法各有至少1份產(chǎn)物的PCR效率很低，表明其中可能含有影響Taq酶活性的雜質(zhì)，從而影響PCR擴(kuò)增效率。其中，對堿裂解法來說，泳道b3無可見產(chǎn)物的原因也可能是PCR體系中模板量過少，即此份DNA產(chǎn)物的產(chǎn)量與濃度過低，導(dǎo)致PCR無可見產(chǎn)物。SDS法與CTAB法所得產(chǎn)物的PCR重復(fù)性很好，特異性中等，隱約有非特異性條帶，但基本不影響主帶的判斷，表明其中可能殘留有少量小分子物質(zhì)，從而影響PCR的特異性。尿素法產(chǎn)物的特異性與重復(fù)性均較差。

各方法提取效果匯總于表3。由表3可見，吸附柱法提取效果最好，得率和純度都足夠高。CTAB法與SDS法的綜合效果也都比較好，殘留雜質(zhì)對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干擾很小。堿裂解法與ROSE法得率雖低，但耗時很短，在工作效率方面有優(yōu)勢。尿素法產(chǎn)物質(zhì)量低于其它方法，且會影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。檸檬酸鈉法的產(chǎn)物質(zhì)量檢測結(jié)果中等，但雜質(zhì)對后續(xù)實(shí)驗(yàn)有不良影響。

表3　不同方法提取效果對比

3　討論

衡量基因組DNA的質(zhì)量主要需要考慮兩個方面，一是完整性，一是純度。由于機(jī)械剪切力的存在，在提取過程中，操作步驟越多，基因組的完整性越低，各步的具體操作方法也會影響DNA產(chǎn)物的完整性。此外，降解DNA的酶大部分來自細(xì)胞內(nèi)部，少部分來自操作過程中引入的污染，如果去除蛋白質(zhì)的步驟效率不夠高，或者是在去蛋白之前的步驟較多，這些酶就有可能在操作過程中陸續(xù)降解DNA，導(dǎo)致產(chǎn)物的完整性下降。當(dāng)需要進(jìn)行印跡雜交等對完整性要求較高的實(shí)驗(yàn)時，需要重點(diǎn)注意產(chǎn)物的完整性。

純度方面，基因組DNA中殘留的主要雜質(zhì)為蛋白質(zhì)，其次是酚類物質(zhì)，還可能有可溶性多糖、鹽離子等。甜菜的葉片中葉綠素和金屬離子含量均比較高，因此在選擇方法時需要考慮這些雜質(zhì)的去除效果。DNA的純度高可保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成功率，并延長DNA樣品的保存時間，但過多的去雜質(zhì)操作又會影響DNA完整性，并延長提取時間，因此根據(jù)不同的研究需要，應(yīng)適當(dāng)調(diào)整DNA純度的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。若用于長期保存，則產(chǎn)物純度應(yīng)盡量高；若要兼顧工作效率，則將雜質(zhì)殘留控制在不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的程度即可。

除這兩點(diǎn)之外，產(chǎn)物得率、提取所需時間、操作通量、操作難度、實(shí)驗(yàn)成本等方面也是需要考慮的因素。當(dāng)需要從少數(shù)樣品中提取較大量DNA時，可以優(yōu)先考慮DNA得率、完整性與純度，獲得質(zhì)量較好的DNA；當(dāng)需要對大量樣品進(jìn)行粗略的定性分析時，則優(yōu)先考慮通量、速度與成本；當(dāng)需要對大量樣品進(jìn)行多種分析或比較精細(xì)的分析時，對DNA質(zhì)量要求較高，工作量又較大，則需要將以上因素綜合考慮。

根據(jù)本研究結(jié)果，吸附柱法得率與純度最高，耗時中等，但成本較高，當(dāng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果要求比較高或難度比較大時，應(yīng)采用此方法，以避免DNA質(zhì)量對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。對同時要求優(yōu)質(zhì)與高效的實(shí)驗(yàn)，或是在PCR時需要使用隨機(jī)引物、多重引物等質(zhì)量較低的引物時，也可使用吸附柱法以保證實(shí)驗(yàn)效率與結(jié)果可靠性。CTAB法與SDS法得率也比較高，質(zhì)量較好，且成本較低，但耗時略長，適合大部分對操作通量要求不高的常規(guī)研究，如用優(yōu)質(zhì)引物進(jìn)行少量樣品的PCR檢測，以基因組為材料的基因或啟動子克隆等。其中SDS法的提取效果略優(yōu)于CTAB法。堿裂解法與ROSE法都是為快速、高通量、低成本地進(jìn)行PCR檢測而設(shè)計(jì)的方法，二者產(chǎn)物的PCR效果類似；而堿裂解法耗時更短，操作更簡便，因此，當(dāng)引物質(zhì)量較好、且需要對大量樣品進(jìn)行快速的PCR檢測時，可首選堿裂解法。堿裂解法的缺點(diǎn)是無法事先檢測產(chǎn)物質(zhì)量，只能直接進(jìn)行PCR檢測；而ROSE法產(chǎn)物濃度更高，可進(jìn)行電泳、紫外吸光值測定等分析，因此當(dāng)堿裂解法的PCR結(jié)果重復(fù)性過差時，可改用ROSE法，以排除DNA提取失敗引起的假陰性。尿素法與檸檬酸鈉法得率與產(chǎn)物純度均不高，后續(xù)實(shí)驗(yàn)受到干擾，且提取耗時較長，不適合甜菜葉片的基因組DNA提取。

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Comparison of Different Leaf Genomic DNA Extraction Methods for Their Efficacies and Applicability in Sugarbeet(Beta valgaris L.)

WANG Xi1,2,3,4,CHEN Li1,2,3,4*,ZHAO Chun-lei1,2,3,4,LI Yan-li1,2,3,4,DING Guang-zhou1,2,3,4,JIA Hai-lun1,2,3,4, XU Jie5and LIAO Peng5
(1.Sugarbeet Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150080;2.Academy of Crop Sciences, Heilongjiang University,Harbin 150080;3.Key Laboratory of Sugarbeet Genetics&Breeding,Colleges and Universities of Heilongjiang Province,Harbin 150080;4.Key Laboratory of North Sugar Crop Resource and Utilization,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150080;5.Graduate School of Heilongjiang University,Harbin 150080)

In this study,seven different methods with different working principles were used to extract genomic from sugarbeet(B.vulgaris L.)leaves,and were compared for multiple features including yield,purity,timeconsuming,cost and so on.Suitable methods were selected for different kind of studies.SDS method is the best method for many studies because of its low cost,high yield and acceptable purity.Absorbing column method prepares DNA with the highest quality and cost less time,so it's suitable for higher demanded studies.Alkali lysis method is the fastest method for PCR test.ROSE method can be used instead of alkali lysis method if needed.Carbamide method and sodium citrate method are not suitable for genomic DNA extraction from sugarbeet leaves.

sugarbeet(Beta valgaris L.);genomic DNA;extracting method

S566.301；Q78

院A

1007-2624（2015）05-0003-04

10.13570/j.cnki.scc.2015.05.002

2015-08-07

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-210101）；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究面上項(xiàng)目（12531488）；黑龍江大學(xué)青年科學(xué)基金項(xiàng)目（QL201124）。

王希（1984-），女，博士，助理研究員，研究方向：甜菜遺傳育種。E-mail：lagow@163.com

陳麗（1959-），女，研究員，研究方向：甜菜遺傳育種。E-mail：caaschenli@163.com