劉錦霞, 李 晶*, 李 娜, 杜文靜, 丁 品, 柳軍璽, 張建軍, 武建榮

(1.甘肅省科學(xué)院生物研究所, 蘭州 730000;2.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所,甘肅省天然藥物重點實驗室, 蘭州 730000)

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黃帚橐吾乙醇提取物對棉鈴蟲的生物活性

劉錦霞1, 李 晶1*, 李 娜1, 杜文靜1, 丁 品1, 柳軍璽2, 張建軍1, 武建榮1

(1.甘肅省科學(xué)院生物研究所, 蘭州 730000;2.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所,甘肅省天然藥物重點實驗室, 蘭州 730000)

棉鈴蟲食性雜,寄主廣,為害嚴(yán)重又對現(xiàn)有農(nóng)藥易產(chǎn)生抗藥性,為有效防控其對作物的為害, 本文通過室內(nèi)毒力測定研究了甘南草原有毒植物黃帚橐吾(Ligulariavirgaurea)乙醇提取物對棉鈴蟲幼蟲的農(nóng)藥生物活性,結(jié)果表明:黃帚橐吾乙醇提取物對棉鈴蟲2～3齡幼蟲有很強的拒食活性,拒食中濃度(AFC50)為2.59 mg/mL。當(dāng)提取物濃度為10.00 mg/mL時,拒食率可達95%以上;觸殺和胃毒活性也較強,致死中濃度(LC50)在3.00 mg/mL左右,濃度為10.00 mg/mL時,校正死亡率均可達80%以上,而且3種作用的活性強度隨濃度增大而增強。 殺卵和熏蒸活性相對較弱,但濃度大于10.00 mg/mL時也有比較明顯的殺滅活性。本研究結(jié)果證明黃帚橐吾乙醇提取物可以有效防控棉鈴蟲幼蟲的危害,為黃帚橐吾類農(nóng)藥的開發(fā)和棉鈴蟲的有效防治提供了依據(jù)和有效途徑。

黃帚橐吾; 棉鈴蟲; 農(nóng)藥; 生物活性

黃帚橐吾[Ligulariavirgaurea(Maxim.) Mattf.]系菊科橐吾屬多年生草本有毒植物,主要分布于我國西藏東北部、云南西北部、四川、青海、甘肅、不丹和尼泊爾等地,生長于海拔2 600～4 700 m的高寒草場、沼澤草甸、陰坡濕地及灌叢中,其大毒,性味甘、苦,入藥有清宿熱、解毒愈瘡,催吐等功效[1]。近年來, 青藏高原東部的高寒草場不斷退化, 群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,毒雜草增多,黃帚橐吾就是其中之一[2],其綜合利用也成為近幾年醫(yī)藥和植保等領(lǐng)域研究的熱點,據(jù)報道,黃帚橐吾莖葉甲醇提取物對菜粉蝶幼蟲有較強的拒食和觸殺作用,對水稻紋枯病菌和玉米大斑病菌也有較強的抑制作用[3-4],但黃帚橐吾對棉鈴蟲的農(nóng)藥生物活性國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。棉鈴蟲(HelicoverpaarmigeraHübner)屬鱗翅目,夜蛾科,廣泛分布在中國及世界各地。該蟲食性雜,寄主植物有20多科200余種。該蟲是棉花蕾鈴期重要的鉆蛀性害蟲,主要蛀食蕾、花、鈴,其次食害嫩葉。除棉花外,還為害小麥、玉米、高粱、番茄、豆類、瓜類等,由于種植結(jié)構(gòu)調(diào)整,氣候變化及其對現(xiàn)用農(nóng)藥的抗藥性等原因, 目前棉鈴蟲為害逐年加重, 對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大危害[5-7]。化學(xué)農(nóng)藥作為防治棉鈴蟲的主要手段,起到了非常重要的作用, 但是大量使用化學(xué)農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境和人類健康構(gòu)成不可逆轉(zhuǎn)的威脅。因此,開發(fā)環(huán)保、安全、高效的新農(nóng)藥勢在必行。植物源殺蟲劑以其作用方式多樣、害蟲不易產(chǎn)生抗藥性、低毒、無殘留、環(huán)保等優(yōu)點,在植物病蟲害防控體系中越來越受到植保工作者的重視。本文以棉鈴蟲3 齡前幼蟲為靶標(biāo), 對黃帚橐吾乙醇提取物的農(nóng)藥生物活性進行初步研究, 旨在為有效防控棉鈴蟲和開發(fā)新的無公害生物農(nóng)藥提供基礎(chǔ)和參考。

1 材料和方法

1.1 材料

黃帚橐吾(L.virgaurea)提取物為中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所提供的黃帚橐吾全草乙醇浸提物,有特異氣味的深褐色浸膏。棉鈴蟲(H.armigera)2～3 齡幼蟲(體重8～11 mg)為該實驗室用無菌小豆苗人工飼養(yǎng)的試蟲,飼養(yǎng)條件: 溫度(25±1)℃,相對濕度(80±5)%,光照時間 12 h/d,光強: 2 000～3 000 lx。

1.2 試驗方法

1.2.1 胃毒活性測定

采用葉片載毒法[8],首先將黃帚橐吾提取物用丙酮稀釋成1.00、2.50、5.00、10.00、20.00 mg/mL 5個濃度的藥液樣品。再選取直徑0.60 cm的無毒豆苗葉片,用1.00 μL的微量點樣器從低濃度開始,在每一片葉上點涂0.50 μL的藥液,每個濃度點涂90 片葉,用點涂丙酮作為對照,置于通風(fēng)處揮發(fā)掉溶劑后放入5 cm 培養(yǎng)皿中(皿底鋪保濕濾紙,防止葉片干縮),接入3 齡饑餓24 h的幼蟲,每頭試蟲給予一片載毒葉片,24 h后將沒有取食完一片葉的試蟲淘汰,剩下的處理蟲飼喂新鮮葉片。每處理30 頭試蟲,3 次重復(fù)。每天定時觀察、記錄,連續(xù)7 d。計算死亡率、校正死亡率和LC50。

校正死亡率(%)=(處理組死亡率-對照組死亡率)/(100-對照組死亡率)×100。

1.2.2 觸殺活性測定

采用點滴法[9],將2～3 齡棉鈴蟲幼蟲置于12.00 cm培養(yǎng)皿中,用微量點樣器點滴試蟲的前胸背板,每頭0.50 μL,每皿10頭試蟲,20 min后蓋上培養(yǎng)皿蓋。設(shè)置黃帚橐吾提取物1.00、2.50、5.00、10.00、20.00 mg/mL 5個濃度處理,每處理20頭試蟲,3次重復(fù),丙酮作為對照。處理后的試蟲用新鮮豆苗飼喂,連續(xù)觀察7 d,記錄死亡蟲數(shù)、中毒癥狀、活動狀態(tài)、取食情況。計算死亡率、校正死亡率和LC50。

1.2.3 拒食活性測定

采用葉碟法測其選擇性拒食活性[9],用丙酮作溶劑,將黃帚橐吾提取物稀釋成1.00、2.50、5.00、10.00、20.00 mg/mL 5 個濃度的藥液備用。挑選直徑為1.00 cm新鮮豆苗葉片,放入待測藥液中浸漬5 s取出, 對照葉片以丙酮作相同處理。置于通風(fēng)處待丙酮自然揮發(fā)后,取處理和對照葉碟各一片平行放置于直徑5.00 cm的培養(yǎng)皿中,皿底內(nèi)墊保濕濾紙,每皿接入1 頭饑餓24 h 的3 齡棉鈴蟲幼蟲,每處理20 頭試蟲,重復(fù)3 次。24 h 后取出殘存葉片,用坐標(biāo)方格紙法測定取食面積,并據(jù)此計算試蟲拒食率和拒食中濃度(AFC50):

拒食率(%)=(Sck-S)/Sck×100

式中:Sck、S分別表示對照和處理的取食面積。

1.2.4 熏蒸活性測定

采用三角瓶濾紙密閉熏蒸法[10],在250 mL 磨口三角瓶底部墊保濕濾紙,每瓶接入10 頭2～3 齡棉鈴蟲幼蟲,并放適量新鮮豆苗葉片,黃帚橐吾提取物用丙酮稀釋成1.00、2.50、5.00、10.00、20.00 mg/mL 5個濃度的藥液樣品,每個濃度藥液取200 μL點滴于濾紙條(7 cm2)上,懸掛于通風(fēng)處3 min后,用少量凡士林粘于磨口三角瓶內(nèi)口,迅速蓋好瓶塞,以丙酮處理為對照。每處理重復(fù) 5 次,將各處理置于光照培養(yǎng)箱中于溫度(25±1)℃,光照時間12 h/d的條件下飼養(yǎng),每12 h檢查一次死亡蟲數(shù),計算死亡率、校正死亡率和LC50。

1.2.5 殺卵活性測定

采用浸卵法[11],將黃帚橐吾提取物用丙酮稀釋成1.00、2.50、5.00、10.00、20.00 mg/mL 5個濃度的藥液備用,將計數(shù)后的棉鈴蟲卵塊(70 粒/塊)放入不同濃度藥液中浸 15 s,取出置于吸水紙上,待溶液揮發(fā)完后,放入墊有保濕濾紙的直徑 15 cm 的培養(yǎng)皿中,每處理3次重復(fù),置于光照培養(yǎng)箱中于溫度(25±1)℃,光照時間12 h/d的條件下培養(yǎng),每天觀察卵孵化數(shù)及幼蟲死亡數(shù),根據(jù)是否孵化出幼蟲判斷死卵與活卵,完全孵化的卵是活卵,未孵化的殘存卵或幼蟲不能鉆出卵殼都判斷為死卵,計算其7 d 卵孵化率、幼蟲死亡率和抑制卵孵化的LC50。

孵化率(%)=第n天累計孵化蟲卵數(shù)/供試蟲卵數(shù)×100。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析處理

采用SPSS 22.0軟件進行試驗數(shù)據(jù)處理和分析;校正累計死亡率經(jīng)反正弦轉(zhuǎn)換后再進行方差分析(ANOVA),多重比較選用Duncan法。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃帚橐吾提取物對棉鈴蟲幼蟲的胃毒活性

由表1可知,黃帚橐吾乙醇提取物對棉鈴蟲3齡前幼蟲有胃毒活性,這種活性作用與提取物濃度呈正相關(guān),LC50為2.02(1.34～2.72)mg/mL(表6), 當(dāng)其濃度達10.00 mg/mL 以上時棉鈴蟲幼蟲7 d的校正累計死亡率超過了80%,與低濃度之間在0.05水平上存在顯著性差異,而且黃帚橐吾提取物通過胃毒作用對棉鈴蟲幼蟲的致死高峰期在用藥后的第5～7天,取食完帶毒葉片后70%的試蟲取食減少,第5天開始濃度在10.00 mg/mL以上的處理試蟲停止取食,行動遲緩,死亡率顯著增加。

表1 黃帚橐吾乙醇提取物對棉鈴蟲2～3齡幼蟲胃毒活性1)

1) 表中校正累計死亡率數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;表中同列數(shù)據(jù)后字母相同者,表示在0.05水平上差異不顯著。下表同。

The corrected cumulative mortality in the table are mean±SD.The data within the same column followed by the same letters are not significantly different at 0.05 level. The same as in the following tables.

2.2 黃帚橐吾提取物對棉鈴蟲幼蟲的觸殺活性

由表2可知, 黃帚橐吾乙醇提取物對棉鈴蟲3齡前幼蟲有較強的觸殺活性,其活性與濃度呈正相關(guān), 其濃度在1.00～5.00 mg/mL時,7 d的校正累計死亡率不存在顯著性差異,LC50為3.34(2.70～5.15)mg/mL(表6),但藥物濃度成倍增加時,死亡率也劇增,當(dāng)濃度為20.00 mg/mL時校正累計死亡率增至93.22%,與低濃度間存在顯著差異。處理24 h后所有試蟲活動正常,但取食微減,死亡高峰期在用藥后第6～7天。

表2 黃帚橐吾乙醇提取物對棉鈴蟲2～3齡幼蟲觸殺活性

2.3 黃帚橐吾提取物對棉鈴蟲幼蟲的拒食活性

試驗結(jié)果顯示(見表3),黃帚橐吾乙醇提取物對棉鈴蟲3齡前幼蟲有顯著的拒食活性,且與藥物濃度呈正相關(guān),AFC50為2.59(2.00～2.81)mg/mL(見表6),濃度越大拒食活性越明顯,與低濃度(小于5.00 mg/mL)間存在顯著差異,當(dāng)藥物濃度為10.00 mg/mL時,拒食率高達95.81%,濃度為20.00 mg/mL,試蟲完全拒食,而且處理后正常飼喂時取食量與低濃度處理及對照相比顯著降低,一半試蟲甚至不再取食,這說明黃帚橐吾提取物對棉鈴蟲幼蟲的生物毒性作用方式復(fù)雜,但以影響其進食能力為主。

表3 黃帚橐吾乙醇提取物對棉鈴蟲2～3齡幼蟲的拒食活性

2.4 黃帚橐吾提取物對棉鈴蟲幼蟲的熏蒸活性

黃帚橐吾體內(nèi)富含具特殊氣味的單萜類、芳香族類揮發(fā)性化合物,而有毒植物體的揮發(fā)物是一類重要的害蟲熏蒸作用物質(zhì)[12-13]。試驗結(jié)果顯示(表4,表6),黃帚橐吾乙醇提取物對棉鈴蟲3齡前幼蟲具有熏蒸活性,且與濃度呈正相關(guān),LC50為5.86(4.94～7.65)mg/mL,但是低濃度(小于5.00 mg/mL)時熏蒸活性比較弱,只有達到比較高的濃度(20.00 mg/mL), 這種熏蒸活性才比較強,與低濃度間存在顯著差異。試驗過程中還發(fā)現(xiàn),處理12 h 后,試蟲取食明顯減少,24 h后90%試蟲停止取食,這說明黃帚橐吾提取物中的某個或某些揮發(fā)性物質(zhì)影響了棉鈴蟲幼蟲的取食能力。

2.5 黃帚橐吾提取物對棉鈴蟲卵的殺卵活性

黃帚橐吾乙醇提取物對棉鈴蟲卵有一定的殺滅活性,藥物濃度越大殺卵活性越強(表5),LC50為6.67 mg/mL(表6),當(dāng)其濃度在10.00 mg/mL以上時,蟲卵的孵化率小于35%,幼蟲的存活率也在52%以下,與對照在0.05水平上存在顯著性差異。從表6還可知,黃帚橐吾提取物對棉鈴蟲幼蟲的所有活性作用中,殺卵作用的LC50最大(6.67 mg/mL),這說明其對棉鈴蟲卵的生物活性沒有其他作用強,從卵控制棉鈴蟲為害的能力相對較弱。

表4 黃帚橐吾乙醇提取物對棉鈴蟲2～3齡幼蟲熏蒸活性

表5 黃帚橐吾乙醇提取物對棉鈴蟲卵殺卵活性

表6 黃帚橐吾乙醇提取物對棉鈴蟲2～3齡幼蟲的生物活性回歸分析

3 討論

長期應(yīng)用化學(xué)農(nóng)藥使得棉鈴蟲抗藥性增強、繁衍猖獗,目前我國棉鈴蟲已經(jīng)對擬除蟲菊酯、有機磷和氨基甲酸酯及其混配劑均表現(xiàn)出明顯的抗藥性,加之嚴(yán)重威脅人類健康生存的農(nóng)藥殘留問題,促使人們尋求各種趨利避害的方法和安全環(huán)保的有效活性物質(zhì)控制有害生物,從植物次生物質(zhì)中尋求新的殺蟲活性物質(zhì)是開發(fā)新型殺蟲劑以及克服或延緩害蟲抗藥性的有效途徑之一[14-16]。本文通過室內(nèi)毒力測定研究了甘南草原有毒植物黃帚橐吾提取物對棉鈴蟲幼蟲的農(nóng)藥生物活性作用,結(jié)果表明:黃帚橐吾乙醇提取物對棉鈴蟲3齡前幼蟲有很強的拒食活性,AFC50為2.59 mg/mL,濃度為10.00 mg/mL時,拒食率可達95%以上;觸殺和胃毒活性也較強,LC50在3.00 mg/mL左右,濃度為10.00 mg/mL時,校正死亡率均可達80%以上,而且3 種作用的活性強度隨濃度增大而增強。 殺卵和熏蒸活性相對較弱,但濃度大于10.00 mg/mL時也有比較明顯的殺滅活性。這證明黃帚橐吾乙醇提取物中含有可以控制棉鈴蟲幼蟲的有效活性物質(zhì)。

植物次生物質(zhì)對靶標(biāo)害蟲的活性作用方式是多樣和相互交織的,一般不是直接殺滅靶標(biāo)害蟲,而是害蟲接觸藥物后,大多產(chǎn)生拒食反應(yīng),停止取食或取食量明顯減少,或者藥物通過體壁和消化系統(tǒng)進入蟲體抑制和誘導(dǎo)昆蟲體內(nèi)的相關(guān)活性酶系(如:GSTs、AChE等),使其生長發(fā)育受到抑制,不能蛻皮進入下一個發(fā)育階段,最后死亡[17-18]。本研究顯示黃帚橐吾乙醇提取物對棉鈴蟲幼蟲的各種生物活性作用中,靶標(biāo)試蟲都在用藥后24～48 h內(nèi)表現(xiàn)出明顯的拒食或取食減少,最終死亡的現(xiàn)象,說明黃帚橐吾乙醇提取物對棉鈴蟲幼蟲的生物活性作用可能是其某些活性成分首先影響了幼蟲的神經(jīng)或消化系統(tǒng)酶系,使其不能正常取食,進而影響其正常生長發(fā)育,而且觸殺、胃毒、拒食和熏蒸活性相互作用,從而導(dǎo)致其較強的靶標(biāo)生物活性。在高濃度(20 mg/mL)時,也觀察到少部分幼蟲在用藥后12 h死亡的現(xiàn)象,可能是黃帚橐吾乙醇提取物中具有對棉鈴蟲幼蟲直接殺滅的高效活性物質(zhì)。因此,黃帚橐吾中的高效活性成分及其對棉鈴蟲的生物活性作用機理還需進一步深入研究,為開發(fā)新型高效生物農(nóng)藥和尋找新農(nóng)藥先導(dǎo)化合物奠定基礎(chǔ),提供參考。

甘肅肅南、天祝和甘南等地由于與青藏高原毗鄰,其獨特的地理、氣候環(huán)境和自然資源,有毒植物種類十分豐富,近年來由于保護措施不力,過度放牧使得這些地區(qū)的天然草場退化,有毒植物大量繁衍,已給畜牧業(yè)發(fā)展帶來嚴(yán)重危害[19-20]。因此在加強對有毒植物實施控制的同時,積極采取科學(xué)措施綜合利用,變害為寶,使其在農(nóng)林牧草的病蟲害防控中發(fā)揮重要作用。

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(責(zé)任編輯：王 音)

Bioactivity of ethanol extracts ofLigulariavirgaureaagainstHelicoverpaarmigera

Liu Jinxia1, Li Jing1, Li Na1, Du Wenjing1, Ding Pin1, Liu Junxi2, Zhang Jianjun1, Wu Jianrong1

(1. Institute of Biology, Gansu Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China; 2. Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province, Lanzhou Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China)

HelicoverpaarmigeraHübner is a major Lepidoptera pest on various crops in China, and it can develop easily pesticide resistance.Ligulariavirgaurea(Maxim.) Mattf. is a kind of poisonous plant growing in the grassland of Gannan Tibetan autonomous prefecture. In order to prevent and controlH.armigeraeffectively, the bioactivity of the ethanol extracts ofL.virgaureaagainstH.armigerawas investigated in laboratory. The results showed that the extracts ofL.virgaureahad strong antifeedant activity against the 2nd-3rd instars ofH.armigerawith the AFC50value of 2.59 mg/mL. Once the concentration of the extracts increased to 10.00 mg/mL, the antifeedant rate could reach to more than 95%. The extracts also demonstrated good contact toxicity and stomach toxicity activity, with LC50value of all above 3.00 mg/mL. The corrected mortality was above 80% when the concentration of the extracts was 10.00 mg/mL. The higher the concentration, the stronger the activity. The extracts had only weak ovicidal and fumigation activities, but the activity was obvious at the concentration of more than 10.00 mg/mL. These results demonstrated that the ethanol extracts ofL.virgaureacould effectively control the harm of ofH.armigeralarvae, which provided a scientific basis for further development of new pesticides withL.virgaureaforH.armigeracontrol.

Ligulariavirgaurea;Helicoverpaarmigera; pesticide; bioactivity

技術(shù)與應(yīng)用Technology&Application

2014-05-07

2014-06-23

全國科學(xué)院聯(lián)盟合作研究項目(2012)；2013、2014年隴原青年創(chuàng)新人才扶持計劃項目

S 482.39

B

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.04.038

* 通信作者 E-mail:93764672@qq.com