潘 逸, 張 昊, 羅 文, 徐 進(jìn), 許景升, 馮 潔

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室, 北京 100193)

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Fusariumboothii特異性PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

潘 逸, 張 昊, 羅 文, 徐 進(jìn), 許景升, 馮 潔*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室, 北京 100193)

根據(jù)報道的Fusariumspp.的reductase-like基因序列,設(shè)計合成了1對用于Fusariumboothii的特異性檢測引物F-Fg/R-Fg。利用該對引物對包括F.boothii在內(nèi)的35株鐮刀菌的基因組DNA進(jìn)行了擴(kuò)增。結(jié)果表明:該引物特異性強(qiáng),僅從F.boothii基因組DNA中擴(kuò)增出300 bp左右的特異性條帶,其他參照菌株及陰性對照均無任何條帶;靈敏度驗證結(jié)果表明,該檢測法可以檢測出50 pgF.boothii基因組DNA。

鐮刀菌; 特異性檢測; 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);Fusariumboothii

由鐮刀菌(Fusarium) 引起的赤霉病是麥類作物的重要病害,廣泛分布于世界濕潤和半濕潤地區(qū)[1]。最近十幾年來,小麥赤霉病在亞洲、歐洲、加拿大和美國北部等地頻繁暴發(fā)[2],危害嚴(yán)重。在我國,長江流域是小麥赤霉病的傳統(tǒng)流行區(qū),而近年來小麥赤霉病在北方麥區(qū)發(fā)生也越來越頻繁,對小麥生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅[3]，不僅引起小麥產(chǎn)量損失, 而且感病谷粒被真菌毒素污染,使人畜的健康安全受到嚴(yán)重威脅。

禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearumsensu lato)是引起小麥赤霉病的主要病原菌,根據(jù)EF1α、reductase-like基因等13個功能基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果,目前認(rèn)為該菌是一個至少包含有15個種的復(fù)合種(Fusariumgraminearumspecies complex, FGSC),這些種很難通過形態(tài)學(xué)進(jìn)行區(qū)分[4]。F.boothii是FGSC中的一個種,在亞洲、非洲和美洲都有一定分布,在玉米和小麥中均有報道[5-7]。任旭通過對多個基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點分型對玉米穗腐病菌進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)我國玉米穗腐病菌中存在少量的F.boothii[8]。目前,鑒定F.boothii主要采用多位點基因分型法[2]、EF1α基因序列分析[9]2種方法,但均成本較高且耗時較長。因此,亟需開發(fā)快速、穩(wěn)定的檢測方法。

真菌的某些基因序列,如 ITS序列、β-tublin(TUB)基因、cox2基因等,在種內(nèi)不同菌株間具有高度的保守性,但在屬間和屬內(nèi)不同種間存在著豐富的多態(tài)性,利用這一特性進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序及序列分析后再設(shè)計特異性引物來進(jìn)行植物病原真菌的分子檢測是目前被廣泛接受的一種技術(shù),該技術(shù)憑借其快速、準(zhǔn)確、重演性好的優(yōu)點已經(jīng)成為植物病原檢測的核心技術(shù),得到越來越廣泛的應(yīng)用[10]。

本研究旨在建立F.boothii的種特異性PCR檢測技術(shù),從而能夠快速、低成本地檢測小麥赤霉病菌群體,監(jiān)測F.boothii的種群分布及動態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 材料

35株供試菌株分屬于28種鐮刀菌，相關(guān)信息見表1。

1.2 鐮刀菌基因組DNA的提取

取少許菌絲接種于PDA平板中央,每個菌株接種2個平板,28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d,待菌絲長滿平板。刮取2個平板的菌絲裝入2 mL離心管,放入烘箱里50 ℃過夜干燥。離心管中加入少量石英砂和一個玻璃珠,蓋上蓋子放入Mini-Beadbeater-96研磨儀模塊,用液氮冷凍后裝入研磨儀研磨100 s。采用OMEGA公司E.Z.N.A. Fungal DNA Kit (D3390) 提取菌株DNA,DNA于-20 ℃保存。

1.3 特異性引物的設(shè)計

對GenBank中已報道的F.boothii和其他多種鐮刀菌的reductase-like基因部分序列(GenBank登錄號見表1)進(jìn)行序列比對分析,尋找F.boothii種特異性SNP位點。利用PrimerPremier 5設(shè)計特異性PCR引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 反應(yīng)體系與程序

PCR反應(yīng)體系(20 μL):DNA模板1 μL,10 μmol/L引物各1 μL,20%PVP (W/V) 1 μL,2% BSA (W/V) 1 μL,2×PCR mix 10 μL,無菌水5 μL。

PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。

1.5 引物特異性驗證

以表1所示菌株基因組DNA為模板,用特異性引物F-Fg/R-Fg進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系及程序見1.4,設(shè)置水為模板的陰性對照,擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,觀察結(jié)果。

1.6 引物靈敏度驗證

用核酸濃度測定儀(GE公司,NanoVue Plus) 測定F.boothii基因組DNA濃度,并將其稀釋為5 ng/μL、500 pg/μL、50 pg/μL、5 pg/μL、500 fg/μL、50 fg/μL、5 fg/μL,然后利用特異性引物F-Fg/R-Fg,按1.4的反應(yīng)體系和程序分別對稀釋的F.boothii基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,觀察結(jié)果。

表1 引物F-Fg/R-Fg特異性驗證所用菌株及其PCR檢測結(jié)果1)

續(xù)表1 Table 1(Continued)

序號No.拉丁學(xué)名Latinname菌株編號aStrainno.寄主Host地理來源GeographicoriginGenBank登錄號bGenBankaccessionno.檢測cDetection16F.graminearumNRRL5883玉米Z.mays美國俄亥俄州Ohio,USAAF212566-17F.gerlachiiNRRL38380蘆竹Arundodonax美國中西部TheupperMidwestoftheU.S.DQ459794-18F.meridionale×F.asiaticumNRRL28721玉米Z.mays尼泊爾NepalAF212565-19F.lunulosporumNRRL13393葡萄柚Citrusparadisi南非SouthAfrica--20F.cerealisNRRL13721洋芋Solanumtuberosum波蘭PolandAF212575-21F.vorosiiNRRL38208小麥族TriticeaeDumort日本北海道Hokkaido,JapanDQ459797-22F.culmorumNRRL3288--AF212573-23F.pseudograminearumNRRL28062大麥H.vulgare澳大利亞AustraliaAF212578-24F.pseudograminearumNRRL28338土壤Soil澳大利亞AustraliaAF212581-25Fusariumsp.NRRL29380稗Echinochloa美國俄勒岡州Oregon,USAAY452927-26F.sporotrichioidesCBS448.67///-27F.acuminatumCBS334.75///-28F.verticillioidesCBS218.76///-29F.poaeCBS446.67///-30F.camptocerasCBS544.96///-31F.chlamydosporumCBS635.76///-32F.langsethiaeCBS121451///-33F.solaniCBS224.34///-34F.louisianenseCBS127524///-35F.nepalenseCBS127503///-

1) a: NRRL為美國菌種保藏中心標(biāo)準(zhǔn)菌株，CBS為荷蘭皇家藝術(shù)與科學(xué)院真菌多樣性研究中心標(biāo)準(zhǔn)菌株；b: reductase-like基因部分序列在GenBank登錄號;c: “+”表示檢測結(jié)果陽性，“-”表示檢測結(jié)果陰性。a: NRRL, Agricultural Research Service Culture Collection, CBS, Fungal Biodiversity Centre, the Institute of Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences; b: Only a part of reductase-like gene sequences are registered in GenBank；c: “+”means positive,“-”means negative.

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性引物設(shè)計

根據(jù)Fusariumspp.的reductase-like基因序列的比對分析結(jié)果,設(shè)計了檢測F.boothii的特異性引物F-Fg/R-Fg(F-Fg：5′-ATGGGTAAGGAGACAAGAC-3′；R-Fg:5′-GGAGTACCAGTATCATGTT-3′),目的片段大小約為300 bp。

2.2 引物特異性驗證

以表1所示菌株DNA為模板,用特異性引物F-Fg/R-Fg進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳檢測結(jié)果顯示:該引物僅從F.boothii的基因組DNA中擴(kuò)增出1條300 bp左右的特異性條帶,與預(yù)期結(jié)果一致,而其他33種參照菌株和陰性對照均無任何條帶(圖1)。特異性檢測結(jié)果表明,所設(shè)計的引物具有種間相對特異性,能夠區(qū)別F.boothii與Fusarium屬其他病原真菌。

圖1 引物F-Fg/R-Fg特異性擴(kuò)增Fusarium boothiiFig.1 Specificity validation of F-Fg/R-Fg

2.3 引物靈敏度驗證

用特異性引物F-Fg/R-Fg分別對不同濃度的F.boothii基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增,設(shè)置無菌水為模板的陰性對照,結(jié)果顯示:隨著模板濃度的降低,瓊脂糖凝膠電泳條帶亮度逐漸變暗,模板量為50 pg時還能分辨出1條約300 bp的特異性條帶(圖2),而模板量小于50 pg以及無菌水對照均無明顯的擴(kuò)增產(chǎn)物,說明該引物的靈敏度為50 pg。

圖2 引物F-Fg/R-Fg靈敏度驗證Fig.2 Sensitivity validation of F-Fg/R-Fg

3 討論

鐮刀菌屬真菌含有多個種,利用形態(tài)學(xué)方法鑒定比較復(fù)雜,而且禾谷鐮刀菌復(fù)合種內(nèi)的各個種很難通過形態(tài)學(xué)進(jìn)行區(qū)分。目前，F(xiàn).boothii鑒定方法成本較高,不適于大樣本篩查。PCR檢測技術(shù)在真菌中的應(yīng)用已很廣泛,具有低成本、穩(wěn)定性高的優(yōu)點,因此開發(fā)F.boothii的常規(guī)PCR檢測方法是十分必要的。

本研究通過對報道的鐮刀菌的reductase-like基因序列進(jìn)行同源性比對分析,設(shè)計合成了1對用于F.boothii檢測的特異性引物F-Fg/R-Fg。利用該引物對包括F.boothii在內(nèi)的35株鐮刀菌菌株的基因組DNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增,結(jié)果表明:該引物特異性強(qiáng),僅從F.boothii基因組DNA中擴(kuò)增出1條300 bp左右的特異性條帶,其他參照菌株及陰性對照均無任何條帶。該檢測法適用范圍廣,穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性高。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Establishment and application of PCR for detection ofFusariumboothii

Pan Yi, Zhang Hao, Luo Wen, Xu Jin, Xu Jingsheng, Feng Jie

(State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

A pair of species-specific primers F-Fg/R-Fg was designed for detection ofFusariumboothiibased on reductase-like gene sequences ofFusariumspp. A total of 35 strains ofFusariumwere tested by using the primers, the results showed that the F-Fg/R-Fg were of high specificity, since only a single product of about 300 bp was amplified fromFusariumboothiigenomic DNA. The sensitivity of the detection was 50 pg genomic DNA per 20 μL PCR reaction volume.

Fusarium; detection; PCR;Fusariumboothii

實驗方法與技術(shù)ExperimentalMethod&Technology

2014-05-12

2014-06-20

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303016)；國家國際合作專項(2013DFG31930)；國家自然科學(xué)基金(31201477)

S 435.121.45

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.04.022

* 通信作者 E-mail: jfeng@ippcaas.cn