劉 巖，沈國新，計(jì)東風(fēng)，朱 燕，林天寶，呂志強(qiáng)

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶桑研究所，浙江杭州 310021）

桑樹AKR2A伴侶蛋白基因的克隆及分析

劉 巖，沈國新，計(jì)東風(fēng)，朱 燕，林天寶，呂志強(qiáng)*

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶桑研究所，浙江杭州 310021）

通過RACE等生物學(xué)技術(shù)，從桑葉中克隆獲得AKR2A同源基因。cDNA全長1 488 bp，ORF長為1 050 bp，編碼349個(gè)氨基酸。編碼蛋白預(yù)測分子量為37.31 ku，等電點(diǎn)4.43；富含螺旋結(jié)構(gòu)，與同類蛋白同源性較高。鹽脅迫后AKR2A在根組織中表達(dá)量上升，在不同桑樹品種葉片中表達(dá)豐度存在差異。

伴侶蛋白；AKR2A；桑樹

高溫會(huì)嚴(yán)重破壞植物細(xì)胞加工進(jìn)程，影響蛋白降解，產(chǎn)生毒性非特異性反應(yīng)。為此，植物進(jìn)化出一種保護(hù)機(jī)制，其中包括產(chǎn)生大量熱激蛋白（small heat shock protein，sHsps）應(yīng)對(duì)脅迫［1］。這些蛋白具有分子伴侶活性，可阻止熱脅迫誘導(dǎo)蛋白變性、非特異性降解。此外，這些蛋白也響應(yīng)其他脅迫，調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育。

AKR2A和AKR2B（ankyrin repeat-containing protein，AKR2）與GF14相互作用［2］，可識(shí)別葉綠體外膜蛋白信號(hào)，將它們轉(zhuǎn)運(yùn)至葉綠體外膜。植物外膜蛋白包含有一個(gè)N端跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrance protein，TMD），需要一個(gè)葉綠體錨定信號(hào)。AKR2A能結(jié)合APX3側(cè)翼結(jié)構(gòu)域，充當(dāng)APX3的分子伴侶蛋白，阻止翻譯后APX3的降解，對(duì)植物生長代謝、發(fā)育都有重要作用［3-4］。目前擬南芥AKR2A蛋白已經(jīng)有研究報(bào)道，為了對(duì)桑樹AKR2A同源基因進(jìn)行了解，開展與之相互作用蛋白的篩選，分析AKR2A對(duì)桑樹生長發(fā)育與代謝的調(diào)控機(jī)制，本研究利用RACE等技術(shù)，克隆桑樹AKR2A同源基因，并對(duì)其進(jìn)行表達(dá)及生物信息學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用桑葉樣品均采自浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所實(shí)驗(yàn)苗圃。

1.2 主要試劑

大腸桿菌Dh5α由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所保存；5＇和3＇RACE試劑盒購自Clontech生物技術(shù)公司；RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR酶反應(yīng)系統(tǒng)、T-Vector購自全式金生物有限公司；DNA膠回收試劑盒購自鼎國生物有限公司，測序和PCR引物均由上海生工生物工程公司完成。

1.3 桑葉RNA抽提及RT-PCR

采集新鮮桑葉，參照TransZol plant操作說明，抽提樣品總RNA，紫外分光光度法測定總RNA濃度，并通過電泳檢測抽提RNA純度。每個(gè)RNA樣品取500 ng，參照操作說明書步驟進(jìn)行RT轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄的AKR2A序列信息，設(shè)計(jì)兼并引物對(duì)MaAKR2A-F（5＇-GGYARYGC NYTVATGCAGGA-3＇，其中Y=C/T；R=A/G；N=A/T/C/G；V=A/C/G）和MaAKR2A-R（5＇-TCRATTGMGCRCAYTTCAVCTC-3＇，其中R=A/G；M=A/C；Y=C/T；V=A/C/G）進(jìn)行擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性1 m in，56℃復(fù)性1 min，72℃延伸30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。上述PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后，割膠回收對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物，與Easy以適當(dāng)?shù)谋壤B接，轉(zhuǎn)化E.coli TG1細(xì)胞，然后篩選鑒定陽性克隆，送交上海生工生物技術(shù)有限公司測序。

1.4 5＇-和3＇-RACE

根據(jù)Clontech公司試劑盒操作說明，1.5 min在上述測得的序列區(qū)域內(nèi)分別設(shè)計(jì)用于5＇和3＇RACE的特異性引物GSP-AKR2-R（5＇-CTTCC CTCCGAATCTTCCTCGTCCT-3＇）和GSP-AKR2-F（5＇-GTCTTGCCGCTTCTGGTGATCCAGCTACTTC-3＇）分別進(jìn)行兩端RACE擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物，與Easy T以適當(dāng)?shù)谋壤B接，轉(zhuǎn)化E.coli TG1細(xì)胞，然后篩選鑒定陽性克隆，送交上海生工生物技術(shù)有限公司測序。

根據(jù)RACE結(jié)果，設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長MaAKR2A基因的引物AKR2-ORF-F（5＇-ATGGCGTCTAATTCG CAGAAGGATTC-3＇）和AKR2-ORF-R（5＇-TTACAG GAAGGCATCCTTCTCGAGC-3＇），經(jīng)克隆后測序。

1.5 生物信息學(xué)分析

將MaAKR2A基因cDNA序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫，與家蠶的全基因組序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，分析MaAKR2A基因的基本結(jié)構(gòu)信息。通過軟件CLUSTAL X（ver.1.83）推導(dǎo)出MaAKR2A cDNA編碼產(chǎn)生的氨基酸序列，并對(duì)MaAKR2A蛋白的基本特性進(jìn)行分析。蛋白序列提交Blast（http：// www.ncbi.nlm.nih.gov/），分析蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。將MaAKR2A的氨基酸序列提交https：// npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-automat.pl？page =npsa-sopm.htm l，結(jié)合系統(tǒng)展現(xiàn)的蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)分析蛋白功能；并利用PHYLIP軟件對(duì)MaAKR2A蛋白進(jìn)行比對(duì)分析。

1.6 表達(dá)譜分析

1.6.1 對(duì)鹽脅迫前后不同幼苗的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

桑種子發(fā)芽長出2片真葉時(shí)，隨機(jī)挑選10株置于100 mmol·L-1NaCl浸潤濾紙的平皿中24 h，同時(shí)設(shè)置蒸餾水組為對(duì)照。分別采集處理前后，處理組、對(duì)照組根、莖、葉片樣品，同上抽提 RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。利用設(shè)計(jì)的引物AKR2A-F（5＇-CAAAATCCCCAGTTTATGACCA-3＇）和AKR2A-R（5＇-CCATTGCTTCACCCAACTTCT-3＇）進(jìn)行定量PCR檢測，并以MaActin的Actin-F（5＇-TGAAG GCTGGGTTTGCTGGT-3＇）和Actin-R（5＇-GCTCGT TGTAGAAAGTGTGATGC-3＇）引物對(duì)的擴(kuò)增作為內(nèi)參，按照全式金公司real-time PCR kit操作說明，在StepOne熒光定量PCR儀上進(jìn)行定量PCR檢測（美國ABI生物公司），按照2-△△Ct方法統(tǒng)計(jì)分析不同轉(zhuǎn)基因純化株系的表達(dá)。

1.6.2 對(duì)不同品種桑樹葉片中AKR2A的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平分析

選取9個(gè)不同桑樹品種，取同葉位葉片，分布抽提RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，利用定量檢測引物按照全式金公司real-time PCR kit操作說明，在StepOne熒光定量PCR儀上進(jìn)行定量PCR檢測（美國ABI生物公司），按照2-△△Ct方法統(tǒng)計(jì)分析MaAKR2A的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 M aAKR2A cDNA序列的克隆

根據(jù)AKR2A的保守區(qū)設(shè)計(jì)兼并引物，以此擴(kuò)增獲得MaAKR2A的保守序列片段。經(jīng)3＇和5＇RACE擴(kuò)增后，得到特異性擴(kuò)增產(chǎn)物條帶 （圖1）?？寺∠鄳?yīng)序列，經(jīng)拼接得到全長的MaAKR2A cDNA序列 （圖2）。序列全長1 488 bp，含一個(gè)完整的開放閱讀框編碼349個(gè)氨基酸。

圖1 MaAKR2A的擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 桑樹AKR2A基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

經(jīng)預(yù)測比較分析，桑樹AKR2A編碼蛋白分子量為37.31 ku，等電點(diǎn)p I為4.43.在C端含有ANK保守結(jié)構(gòu)域 （圖3），序列富含螺旋Helix結(jié)構(gòu) （圖4）。

2.3 進(jìn)化比較分析

桑樹AkR2A蛋白與同類蛋白同源性較高，與桃樹來源蛋白的（M5VQ6，Prunus persica）同源性最高，達(dá)85.4%；相對(duì)而言，與云杉 （A9NRF1，Picea sitchensis）的同源性最低，為69.1%，在不同品種間保守性較高 （圖5）。

2.4 不同桑葉葉片AKR2A的表達(dá)譜活性

隨機(jī)克隆5個(gè)品種桑樹AKR2A基因的全長ORF序列，測序表明序列間無明顯差異。選擇9個(gè)品種桑樹葉片，通過定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，不同品種間表達(dá)量有較大差別，以圍西、荷葉白、強(qiáng)桑和上清4個(gè)品種居高，另外臺(tái)青、GM5、建水長穗桑、農(nóng)桑14、8632桑品種中，該基因表達(dá)量顯著低于前面4個(gè)品種 （圖6）。

圖2 MaAKR2A cDNA的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

通過100 mmol·L-1NaCl鹽脅迫雜交桑幼苗24 h后，分別取不同組織樣品，以未脅迫正常組織為對(duì)照，通過定量檢測發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫后根組織中AKR2A基因相對(duì)表達(dá)量上升，而葉、莖中相對(duì)表達(dá)含量略呈下降態(tài)勢，但總體變化程度不大（圖7）。

圖3 MaAKR2A蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

圖4 MaAKR2A蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測

圖5 不同品種來源AKR2A蛋白的進(jìn)化分析

3 小結(jié)和討論

膜蛋白的正確定位對(duì)真核蛋白功能的發(fā)揮起重要作用，膜蛋白通常有2種合成途徑，一種是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜合成，在Sec61膜蛋白幫助下形成復(fù)合物，通過膜囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)至目的地；另一種是在細(xì)胞質(zhì)游離核糖體中，然后通過分子伴侶和受體蛋白錨定到靶膜上［5］。AKR2A是一種很重要的分子伴侶蛋白，與之相互作用的蛋白中，C端 （如APX3，APX5，CB5和TOM20）、N端（OEP7和CB5R）、靠近C端 （TOC34）均含有 ABS（AKR2A-binding sequence，ABS）。Zhang等［6］推測ABS在膜上位置不影響AKR2A功能，AKR2A與單一ABS結(jié)構(gòu)域蛋白結(jié)合。AKR2A結(jié)合膜蛋白的ABS，可能在組織膜蛋白特異性受體作用下轉(zhuǎn)運(yùn)至指定位置。AKR2A含有4個(gè)C端的ankyrin repeats和一個(gè)N端PEST結(jié)構(gòu)域［2］，前者是蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域，后者是指富含Pro，Glu，Ser和Thr，降解短壽命蛋白信號(hào)域。Shen等［4］報(bào)道AKR2A可以與APX3相互作用。本文克隆鑒定了桑樹AKR2A基因，為今后圍繞該基因開展桑樹生長發(fā)育和代謝調(diào)控研究提供了理論基礎(chǔ)。

圖6 不同品種間MaAKR2A基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的比較

圖7 NaCl脅迫后不同組織AKR2A基因表達(dá)量變化

本研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫后，相對(duì)于葉、莖組織而言，AKR2A基因在植物根組織中表達(dá)水平提高，這可能與鹽離子進(jìn)入質(zhì)膜，根細(xì)胞代謝發(fā)生變化，需要更多的AKR2A參與調(diào)控各類脅迫響應(yīng)蛋白；而Eugenia等［7］對(duì)脅迫條件下抗壞血酸的表達(dá)檢測研究發(fā)現(xiàn)，植物損傷后前3 h內(nèi)AKR2A表達(dá)量增加。另外，研究檢測發(fā)現(xiàn)不同品種桑樹AKR2A基因表達(dá)水平存在較明顯差異，而AKR2A又能與APX3，Hsp17.8等發(fā)生相互作用，調(diào)節(jié)膜蛋白合成轉(zhuǎn)運(yùn)［8］，不同桑樹品種AKR2A的表達(dá)調(diào)控及其與植物抗逆等性能的關(guān)系目前尚不清楚，尚待進(jìn)一步調(diào)控和作用機(jī)制研究。

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（責(zé)任編輯：張 韻）

S 888

A

0528-9017（2015）04-0553-05

10.16178/j.issn.0528-9017.20150435

2014-12-19

浙江省蠶桑農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項(xiàng) （2012C12910）；浙江省蠶桑產(chǎn)業(yè)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì) （2011R50028）；家蠶基因組生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題 （sklsgb2013015）；國家蠶桑產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系-現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng) （蠶桑）（CARS-22-ZJ0105）

劉 巖（1976-），女，河南人，副研究員，主要研究方向?yàn)樯ＰQ分子生物學(xué)。E-mail：mayanly@sina.com。

呂志強(qiáng)。E-mail：13958131715@139.com。

文獻(xiàn)著錄格式：劉巖，沈國新，計(jì)東風(fēng)，等.桑樹AKR2A伴侶蛋白基因的克隆及分析 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，56（4）：553-557.