史俊 席剛俊 徐超 徐曉燕

摘要：采用未成熟種子作為外植體，研究了硬葉斯垂科特（Tillandsia stricta Rigid）的組培快繁方法。結果表明，種子萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+1.0 mg/L IAA+80 g/L土豆汁+25 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂，40 d后，種子萌發(fā)率達89%；增殖培養(yǎng)基為1/2MS+1.0 mg/L IAA + 0.2 mg/L 6-BA+80 g/L土豆汁+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂，50 d后的增殖率達2.03；生根培養(yǎng)40 d后的小苗高1 cm左右，移栽成活率可達95%以上。

關鍵詞：硬葉斯垂科特（Tillandsia stricta Rigid）；培養(yǎng)基；增殖；快繁體系

中圖分類號：Q943.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）21-5429-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.058

Establishing of Tissue Culture Rapid Propagation System of Tillandsia stricta Rigid

SHI Jun，XI Gang-jun，XU Chao，XU Xiao-yan

（Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry，Jurong 212400，Jiangsu，China）

Abstract： The immature seeds were used as explants to research methods of tissue culture system from Tillandsia stricta Rigid. The results showed that the best media for seed germination was 1/2MS+1.0 mg/L IAA+80 g/L potato juice+25 g/L sucrose+6 g/L agar， seed germination rate reached 89% T. stricta from A2 medium formula after 40 days； and proliferation medium was 1/2MS+1.0 mg/L IAA+0.2 mg/L 6-BA+80 g/L potato juice+30 g/L sucrose+6 g/L agar，the proliferation rate was 2.03 after 50 days. Seedlings height was about 1 cm in rooting culture after 40 days， the transplanting survival rate may reach above 95%.

Key words： Tillandsia stricta Rigid；medium；proliferation；rapid propagation system

室內(nèi)空氣污染是目前國內(nèi)外迫切需要解決的環(huán)境問題，現(xiàn)代城市居民80%的時間在家庭居室、辦公室、公共建筑等環(huán)境中渡過，由于通風不良及現(xiàn)代建筑材料、裝飾材料、家具辦公用品（特別是新裝修后不久的房屋）不斷釋放甲醛、苯、甲苯等有害物質(zhì)，人體健康受到嚴重危害。鐵蘭屬（Tillandsia）植物是鳳梨科（Bromeliaceae）中的耐旱氣生種類，為多年生附生或氣生草本植物，可生長在空氣中，無需泥土花盆、抗逆性強，屬于景天酸植物（CAM）[1，2]，夜間吸收CO2，增加了局部環(huán)境的氧氣濃度，而且還可以吸收居室內(nèi)甲醛、苯等有毒有害物質(zhì)，凈化居室空氣[3-6]，有利于人們的身心健康。

硬葉斯垂科特（Tillandsia stricta Rigid）是我國引進的鐵蘭屬植物中應用較為廣泛的一種，為單生硬葉型，葉片綠色?；ò奂t色，花大，花形美觀，花期長[7]可制作成花球，市場應用前景巨大。但是斯垂科特生長緩慢，繁殖不易，主要的繁殖方式為種子繁殖和分株繁殖[8]，但這2種繁殖方式的繁殖速度緩慢。本研究的目的是利用硬葉斯垂科特未成熟的種子作為外植體材料，建立起斯垂科特的組培快繁體系，加快了硬葉斯垂科特的繁殖速度，為解決其應用瓶頸提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料來源

2011年7月，在江蘇農(nóng)林職業(yè)技術江蘇農(nóng)博園的智能溫室[（26±2） ℃，RH80%]中對硬葉斯垂科特進行人工授粉，10月底取未完全成熟的果莢作為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒 將取回的、未完全成熟的果莢用去污劑清洗干凈，再用自來水沖洗10 min，在超凈工作臺上，用75%乙醇浸泡60 s，0.1%升汞溶液消毒15 min，無菌水沖洗3～5次備用。

1.2.2 種子的萌發(fā) 將消毒好的果莢放在超凈工作臺上，用滅過菌的解剖刀剖開果莢，再用無菌鑷子取出未成熟的種子，接種于不同的培養(yǎng)基上（表1），每瓶接種20粒種子，每處理接種10瓶，在2 000 lx，12 h/d，（25±2） ℃條件下培養(yǎng)40 d觀察種子萌發(fā)情況。

1.2.3 增殖培養(yǎng)基篩選 采用L9（34）正交設計，選擇基礎培養(yǎng)基、IAA、6-BA、土豆汁4個因素，每個因素設計3個水平，設計方案如表2所示，每瓶接種20個芽，接10瓶，培養(yǎng)50 d后調(diào)查硬葉斯垂科特的增殖情況。

1.2.4 壯苗培養(yǎng)及移栽 將增殖后的硬葉斯垂科特幼苗進行分株，并接入壯苗培養(yǎng)基1/4MS+1.0 mg/L IAA+80 g/L香蕉汁+25 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂，pH 5.8，培養(yǎng)方式采用膜袋培養(yǎng)40 d，移入溫室中馴化15 d后進行移栽，30 d后觀察其成活率。

2 結果與分析

2.1 初始培養(yǎng)基對硬葉斯垂科特種子萌發(fā)的影響

為獲得較優(yōu)的硬葉斯垂科特種子萌發(fā)培養(yǎng)基，設計了9種培養(yǎng)基，將硬葉斯垂科特的種子接種到培養(yǎng)基后，40 d調(diào)查萌發(fā)率和幼苗生長情況（表3）。由表3可知，A2處理較有利于硬葉斯垂科特種子的萌發(fā)，萌發(fā)率達89%，同A4、A6、A8處理形成顯著差異，同A1、A3、A5、A7、A9處理差異不顯著，且A2處理幼苗生長更加健壯，葉色翠綠，并且大多數(shù)芽苗長出了2片以上真葉。另外，隨著6-BA含量的升高，幼苗逐漸出現(xiàn)輕微玻璃化的現(xiàn)象，鑒于硬葉斯垂科特幼苗對6-BA較敏感，在下面芽苗增殖培養(yǎng)基配方的設計中將采用低水平的6-BA。

2.2 不同培養(yǎng)基對硬葉斯垂科特幼苗增殖的影響

采用L9（34）正交設計進行硬葉斯垂科特增殖培養(yǎng)，結果見表4。由表4可知，通過因素內(nèi)水平極差（R）的大小得到參試的4個因素對硬葉斯垂科特增殖影響的主次關系為C、D、B、A，說明細胞分裂素6-BA對硬葉斯垂科特的增殖起著重要的作用。根據(jù)各因素水平均值的大小，可以得到最優(yōu)組合水平為A1B2C2D2。

用SPSS11.5統(tǒng)計軟件對試驗結果進行分析，從表5可以看出，在影響硬葉斯垂科特增殖培養(yǎng)的4個因素中，只有細胞分裂素6-BA的濃度對硬葉斯垂科特增殖影響達到顯著水平，而基礎培養(yǎng)基、IAA濃度和土豆汁濃度這3個因素對其增殖影響都不顯著。

綜合直觀分析與方差分析結果可知，在硬葉斯垂科特的增殖培養(yǎng)中，以1/2MS為基礎培養(yǎng)基添加1 mg/L IAA，0.2 mg/L 6-BA以及80 g/L土豆汁時，幼苗的增殖率最高，長勢也最好，4個因素的最佳水平組合為A1B2C2D2，即增殖培養(yǎng)基的配方為1/2MS+1.0 mg/L IAA +0.2 mg/L 6-BA +80 g/L土豆汁+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂，pH 5.8。

2.3 硬葉斯垂科特的壯苗及移栽

將增殖后的硬葉斯垂科特幼苗進行分株，并接入壯苗培養(yǎng)基1/4 MS+1.0 mg/L IAA+80 g/L香蕉汁+25 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂，pH5.8，采用塑料膜袋培養(yǎng)40 d后，小苗長至1 cm左右，移入溫室馴化、煉苗15 d，開袋洗苗后直接將幼苗平放在蛭石上面或粘于泡沫板上，正常管理即可。由于硬葉斯垂科特可以依靠密布于表面的鱗片從空氣中吸收水分和養(yǎng)分，其抗逆性很強，移栽成活率可達95%以上。

3 小結

在硬葉斯垂科特的組培快繁體系研究中，采用未成熟種子作為外植體，整個快繁過程分為種子萌發(fā)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)和壯苗培養(yǎng)三個階段，種子萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+1.0 mg/L IAA+80 g/L土豆汁+25 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂，40 d后有89%的種子萌發(fā)成幼苗，并且大多長出2片真葉，葉色翠綠，植株健壯；增殖培養(yǎng)以1/2 MS+1.0 mg/L IAA +0.2 mg/L 6-BA +80 g/L土豆汁+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂為佳，50 d后的增殖率達2.03，植株較為健壯，無玻璃化現(xiàn)象。

在種子萌發(fā)培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)硬葉斯垂科特幼苗對細胞分裂素6-BA較敏感，較高濃度的6-BA易引起硬葉斯垂科特幼苗的輕微玻璃化，故在增殖培養(yǎng)中采用了低水平的6-BA。土豆汁和香蕉汁都是天然附加物，含有豐富的氨基酸、礦物質(zhì)、維生素、碳水化合物和天然激素等，土豆汁具有促進種子萌發(fā)和幼苗增殖的作用，而香蕉汁則有利于植物的壯苗和生根[9]，因此，在種子萌發(fā)和幼苗增殖培養(yǎng)基中添加了80 g/L的土豆汁，在壯苗培養(yǎng)基中添加了80 g/L的香蕉汁?？紤]到將來硬葉斯垂科特組培工廠化育苗的要求，在壯苗培養(yǎng)時采用了膜袋培養(yǎng)方式，可以大幅度降低企業(yè)的生產(chǎn)成本，且方便運輸。

在硬葉斯垂科特增殖培養(yǎng)基的配方篩選中采用了正交設計，該方法應用于植物離體培養(yǎng)的研究，國內(nèi)的報道最早見于在秈稻（Oryza sativa subsp. indica）花藥培養(yǎng)中的應用[10]。后來在延胡索（Corydalis yanhusuo）和黨參（Codonopsis pilosula）的組織培養(yǎng)試驗中研究者也采用正交設計的方法并取得了良好的試驗結果[11，12]，在硬葉斯垂科特的增殖培養(yǎng)中尚未見報道。本研究在硬葉斯垂科特的增殖培養(yǎng)中采用了4因素3水平試驗，如果全部實施，需要配制34（81）種培養(yǎng)基，但利用正交設計，只配制了9種培養(yǎng)基就達到了目的，大大提高了試驗效率，簡化了研究方案，縮短了試驗進程。但是，正交設計是一種均一化的設計方案，不可能包含所有處理組合，所得到的最佳組合也不一定是最優(yōu)的配方，因此，為獲得最優(yōu)配方還需進行進一步試驗。

參考文獻：

[1] 張 蕾.空氣鳳梨的引種應用及其生物學特性初步研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學，2008.

[2] HEUSSER C J. Age vegetation and climate of subtropical Chile[J]. Palaeogeography， Palaeoclimatology， Palaeoecology， 1990， 80（2）： 107-127.

[3] CERVANTES S E， GRAHAM E A， ANDRADE J L. Light microhabitats， growth and photosynthesis of an epiphytic bromeliad in a tropical dry forest[J]. Plant Ecology， 2005，179（1）：107-118.

[4] FIGUEIREDO A M G， SAIKI M， TICIANELLI R B， et al. Determination of trace elements in Tillandsia usneoides by neutron activation analysis for environmental biomonitoring[J].Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry，2001，249（2）： 391-395.

[5] FIGUEIREDO A M G， ALCAL？魣 A L， TICIANELLI R B， et al. The use of Tillandsia usneoides L. as bioindicator of air pollution in Sao Paulo， Brazil[J]. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry，2004，259（1）：59-63.

[6] FIGUEIREDO A M G， NOGUEIRA C A， SAIKI M， et al. Assessment of atmospheric metallic pollution in the metropolitan region of S？觔o Paulo， Brazil， employing Tillandsia usneoides L. as biomonitor[J]. Environmental Pollution， 2007， 145（1）：279-292.

[7] 俞祿生.神奇的無根花卉空氣鳳梨[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2009.

[8] MANHART J R.Spanish Moss-Tillandsia usneoides L.[DB/OL]. http：//plant-materials.Nrcs.Usda.Gov/intranet/pfs.html，2002.

[9] 王永平，史 俊.園藝植物組織培養(yǎng)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010.

[10] 廣東省植物研究所遺傳室，廣東師范學院數(shù)學系.用正交與不完全區(qū)組試驗法提高秈稻花藥培養(yǎng)成功率[J].廣東師范學院學報，1976（1）：100-112.

[11] 張自國，嚴 霄，王鳳仙，等.正交設計在植物組織培養(yǎng)基研究中的應用[J].植物生理學通訊，1985（5）：46-48.

[12] 孟玉玲，谷祝乎.正交設計在誘導植物體細胞胚胎發(fā)生中的應用[J].西北植物學報，1995，13（1）：10-15.