徐俊鴻 高卓維 黃景彬 仇志坤 伍志勇

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬順德中醫(yī)院（佛山市順德區(qū)中醫(yī)院）· 佛山 528333）

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株與試劑

人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1(由中國(guó)科學(xué)院提供），細(xì)胞培養(yǎng)試劑：胎牛血清（Hyclone，Cat.No.SH30087.01），RPMI-1640 培養(yǎng)基（Hyclone，Cat.No.SH30809.01B），青鏈霉素（Hyclone，Cat.No. H30010），PBS 磷酸鉀緩沖液（Hyclone，Cat.No.SH30256.01B）

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥與儀器實(shí)驗(yàn)用藥與儀器：實(shí)驗(yàn)用藥：龍葵鮮藥由順德中醫(yī)院提供。龍葵鮮藥水煎提取液(1g/ml)的制備：取鮮龍葵500g,加水1000m1煎煮，得第一次提取液約500ml;再將其藥渣用水700ml煎煮，得第二次提取液約500ml。兩次提取液混合，過濾，濾液再加熱濃縮至500ml，即得。龍葵鮮藥水煎提取液由順德中醫(yī)院制劑室制備。儀器：蘇州安泰潔凈工作臺(tái)（SWCJ-IFD），低速離心機(jī)（中佳，SC3614），倒置光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS CKX41, U-CTR30-2）, 細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱(Thermo scientific, HERACELL150i) 倒置熒光顯微鏡生產(chǎn)商：Leica型號(hào)：DMI6000B

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藥物配制及分組 藥物過濾除菌，藥液配成濃度為1g／ml于-20℃保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)取出用新鮮培養(yǎng)基配成相應(yīng)的濃度進(jìn)行給藥。實(shí)驗(yàn)分組：按龍葵鮮藥水煎液濃度分為5mg/ml組、10mg/ml組、30mg/ml組、50mg/ml組和80mg/ml組，對(duì)照組不加藥。

1.3.2 CNE-1細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇CNE-1細(xì)胞。將其用RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清青霉素、鏈霉素100U／ml)于37℃，5%C02飽和濕度培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，每隔2～3天換一次液。置倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞取匯合率達(dá)80%～90%時(shí)，

用0.25%胰酶（含0.02%EDTA）消化，按1:2～3傳代培養(yǎng)或者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)消化后吹打散細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105 個(gè)/ml，分到96孔板，每孔100ul，即每孔細(xì)胞為1×104個(gè)，每個(gè)濃度組（5mg/ml、10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml、80mg/ml）和對(duì)照組均做3個(gè)復(fù)孔。貼壁細(xì)胞需待細(xì)胞貼壁后，再收集各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。收集各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞（24h，48h，72h）加入cellTiter96AQ 單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑（Promega，Cat.No.G3582），比例為1/10（即100ul培養(yǎng)液加入10ul 檢測(cè)液）。

孵育4 小時(shí)后，使用KC-100酶標(biāo)儀讀板（波長(zhǎng)490），讀取OD值數(shù)據(jù)。抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值／對(duì)照組平均OD值 )×100%。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡/壞死 上述各組細(xì)胞培養(yǎng)48h后，將細(xì)胞培養(yǎng)板各組的培養(yǎng)基分別轉(zhuǎn)移到15 ml的錐形管中，并置于冰上。用2 ml PBS溶液輕輕洗細(xì)胞2次。加入0.5ml 0.25%胰酶（不含EDTA）消化。用預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液中使得其密度約為1×106細(xì)胞/ml。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，加入1.25 μl Annexin V-FITC后與室溫（18-24°C）避光反應(yīng)15分鐘。室溫1000×g離心5分鐘，去除上清。將細(xì)胞用0.5 ml 預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液輕輕重懸。加入10 μl Propidium Iodide試劑后，將樣本放置在冰上避光保存。室溫孵育15分鐘，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用SPSS 16.0軟件，多組計(jì)量資料分析采用One way ANOVA，多重比較采用Dunnett’s 法進(jìn)行比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 龍葵鮮藥水煎液對(duì)CNE-1細(xì)胞增殖的抑制作用（表1）

在加入龍葵鮮藥水煎液24小時(shí)后，對(duì)照組5mg/ml、10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml、80mg/ml組的CNE-1細(xì)胞平均抑制率分別為0.00%、4.21%、5.88%、7.40%、6.68%和4.43%，各劑量組的平均抑制率與對(duì)照組比較，差異均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各劑量組的的平均抑制率間相合比較，差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 龍葵鮮藥水煎液對(duì)CNE-1細(xì)胞增殖的影響

在加入龍葵鮮藥水煎液48小時(shí)后，對(duì)照組5mg/ml、10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml、80mg/ml組的CNE-1細(xì)胞平均抑制率分別為0.00%、6.11%、15.00%、19.52%、28.53%和47.60%，CNE-1細(xì)胞平均抑制率隨著龍葵鮮藥水煎液濃度的增高而逐漸增加。各劑量組的平均抑制率分別與對(duì)照組比較，均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05；各劑量組間平均抑制率相互比較，10mg/ml組與30mg/ml組間平均抑制率的差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余各劑量組間平均抑制率相互比較，差異均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

在加入龍葵鮮藥水煎液72小時(shí)后，對(duì)照組5mg/ml、10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml、80mg/ml組 的 CNE-1細(xì) 胞平均抑制率分別為 0.00%、20.87%、27.56%、37.46%、42.14%和59.09%，CNE-1細(xì)胞平均抑制率隨著龍葵鮮藥水煎液濃度的增高而逐漸增加。各劑量組的平均抑制率分別與對(duì)照組比較，均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；各劑量組間平均抑制率相互比較，差異均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

在 5mg/ml、10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml、80mg/ml這5個(gè)濃度組，在不同時(shí)間點(diǎn)平均抑制率的由多到少均為：24h<48h<72h，分別比較同一濃度組在24h、48h、72h這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)平均抑制率的差異，其中5mg/ml濃度組在24h和48h的抑制率差異之間無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余同一濃度組在不同時(shí)間點(diǎn)平均抑制率之間的差異均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 龍葵鮮藥水煎液對(duì)CNE-1細(xì)胞凋亡和壞死的影響：

流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析不同濃度龍葵鮮藥水煎液與CNE-1細(xì)胞凋亡的相關(guān)性，CNE-1細(xì)胞凋亡率由大到小依次為80mg/ml >50mg/ml >30mg/ml >10mg/ml >5mg/ml >對(duì)照組，隨著龍葵鮮藥水煎液濃度的增加，CNE-1細(xì)胞凋亡率相應(yīng)增多（圖1、表2）。不同龍葵鮮藥水煎液濃度組與對(duì)照組比較，CNE-1細(xì)胞凋亡率的差異均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

CNE-1細(xì)胞壞死率由大到小依次為50mg/ml>80mg/ml>10mg/ml >30mg/ml >5mg/ml >對(duì)照組（表2），不同龍葵鮮藥水煎液濃度組與對(duì)照組比較，CNE-1細(xì)胞壞死率的差異均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析不同濃度龍葵鮮藥水煎液與CNE-1細(xì)胞凋亡的相關(guān)性

表2 龍葵鮮藥水煎液對(duì)CNE-1細(xì)胞凋亡和壞死的影響

4討論

鼻咽癌為嶺南地區(qū)常見頭頸部惡性腫瘤。因鼻咽部位的特殊解剖特點(diǎn)，大部分患者就診是已屬晚期。局部晚期鼻咽癌治療上以放療為主，根據(jù)患者的具體情況應(yīng)用化療。盡管調(diào)強(qiáng)放療技術(shù)的得以開展的今天，使得鼻咽癌五年生存率也一直徘徊在70%-80%左右[1]。因此，在常規(guī)西醫(yī)治療的基礎(chǔ)上，如何進(jìn)一步提高療效，研究發(fā)掘民間中藥方，具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。

嶺南地區(qū)為鼻咽癌的高發(fā)區(qū)之一。鮮龍葵湯為嶺南地區(qū)民間治療鼻咽癌的經(jīng)驗(yàn)單方。中國(guó)古代哲學(xué)認(rèn)為一物治一物。本課題通過研究嶺南地區(qū)民間經(jīng)驗(yàn)單方鮮龍葵在體外對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞增殖抑制和凋亡的影響，以期為今后研究鮮龍葵聯(lián)合西醫(yī)常規(guī)療法治療鼻咽癌提供參考。

研究通過MTS法檢測(cè)龍葵鮮藥水煎液對(duì)鼻咽癌CNE-1細(xì)胞增殖的抑制作用，以及采用流式細(xì)胞檢測(cè)定量和定性地分析龍葵鮮藥水煎液對(duì)CNE-1細(xì)胞凋亡和壞死的影響。研究中發(fā)現(xiàn)，各劑量組對(duì)CNE-1癌細(xì)胞作用24h、48h、72h均抑制CNE-1細(xì)胞增殖，而且抑制作用隨著用藥時(shí)間的增加而增強(qiáng)；5mg/ml、10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml、80mg/ml濃度組在48h、72h時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)為龍葵鮮藥水煎液濃度越高，抑制作用越強(qiáng)的趨勢(shì)，但在用藥24h時(shí)，藥物濃度的高低與抑制趨勢(shì)的無顯著關(guān)系。研究表明，不同濃度的藥物作用于CNE-1細(xì)胞后，CNE-1細(xì)胞增殖受到抑制，這一作用隨藥物濃度的變化而變化，且在一定范圍內(nèi)與用藥時(shí)間相關(guān)，用藥時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)CNE-1細(xì)胞的抑制越顯著。同時(shí)，隨著給藥劑量的增加，48h凋亡的CNE-1細(xì)胞也顯著增多。

本研究證實(shí)了，在體外實(shí)驗(yàn)中，龍葵鮮藥水煎液能誘導(dǎo)有效抑制CNE-1細(xì)胞的增殖和促進(jìn)胞CNE-1凋亡，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。本研究為龍葵鮮藥治療鼻咽癌提供一定的依據(jù)。

[1] 馬駿.鼻咽癌治療的研究進(jìn)展[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)科學(xué)版）,2010,31(2):179-185.