張德珍, 陳曉霞, 高先悅, 于金鳳*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學植物保護學院植物病理學系, 泰安 271018; 2. 濰坊科技學院, 壽光 262700)

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禾谷絲核菌(Rhizoctoniacerealis)原生質(zhì)體制備與再生的研究

張德珍1,2, 陳曉霞1, 高先悅1, 于金鳳1*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學植物保護學院植物病理學系, 泰安 271018; 2. 濰坊科技學院, 壽光 262700)

禾谷絲核菌(Rhizoctoniacerealis)是引起我國小麥紋枯病的主要致病菌。為了建立高效穩(wěn)定的禾谷絲核菌遺傳轉(zhuǎn)化體系,本試驗比較研究了不同細胞壁降解酶、酶液濃度、酶處理溫度和時間等因素對禾谷絲核菌原生質(zhì)體制備的影響,利用正交設(shè)計試驗優(yōu)化了原生質(zhì)體再生條件。結(jié)果表明,液體培養(yǎng)6 d的菌絲,采用15 mg/mL溶壁酶+10 mg/mL蝸牛酶組成的混合酶液,30 ℃下酶解4 h,可以獲得較高的原生質(zhì)體釋放量,可達到3.0×106個/mL;禾谷絲核菌原生質(zhì)體再生的最佳條件是以SuTC緩沖液作為滲透壓穩(wěn)定劑懸浮原生質(zhì)體,采用單層混菌法接種于TB3再生培養(yǎng)基,原生質(zhì)體再生率可達到58.6%。禾谷絲核菌原生質(zhì)體制備和原生質(zhì)體再生條件的優(yōu)化,為深入研究禾谷絲核菌生長發(fā)育的分子遺傳學基礎(chǔ)和進一步探索小麥紋枯病的致病機理奠定了基礎(chǔ)。

禾谷絲核菌; 原生質(zhì)體; 制備; 再生

小麥紋枯病,又稱小麥尖眼斑病(wheat sharp eyespot),是由絲核菌屬(Rhizoctonia)真菌引起的土傳性真菌病害。早在20世紀70年代初我國就有報道[1]。近年來,隨著肥水條件的改良和耕作制度的調(diào)整,以及大面積推廣的小麥栽培品種對紋枯病的抗性普遍較差,小麥紋枯病已成為威脅我國小麥產(chǎn)量的主要病害之一。

目前我國小麥紋枯病的主要病原菌為禾谷絲核菌(Rhizoctoniacerealis),屬于AG-D融合群(即CAG-1融合群)[2-6]。目前對于R.cerealis致病機理的研究,主要集中在細胞組織學[7]和細胞壁降解酶的研究,Cooper等[8]對R.cerealis產(chǎn)生的多糖降解酶進行了系統(tǒng)研究,在接種R.cerealis的小麥活體內(nèi)外分別檢測到了阿拉伯聚糖酶、木聚糖酶、昆布多糖酶(即β-1,3-葡聚糖酶)等十多種酶的活性,認為R.cerealis產(chǎn)生的胞外酶能降解細胞壁使其釋放出阿拉伯糖和木糖。Chen 等[9]認為R.cerealis侵入小麥后,通過破壞小麥的維管束組織和其他組織導致營養(yǎng)物質(zhì)運輸受阻而發(fā)生病變。但由于R.cerealis的營養(yǎng)體為雙核菌絲,遺傳特性復雜,加之該菌在人工培養(yǎng)條件下難以產(chǎn)生有性和無性孢子,使得對該菌的分子遺傳學和致病機制的研究相對滯后。因此,應用原生質(zhì)體技術(shù),建立高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系,有利于了解R.cerealis的生長發(fā)育與致病過程的分子遺傳學基礎(chǔ),為進一步探索小麥紋枯病的致病機理奠定基礎(chǔ)。

國內(nèi)外對水稻紋枯病立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)原生質(zhì)體制備與轉(zhuǎn)化的研究較多[10-14],而對于小麥紋枯病禾谷絲核菌(R.cerealis)的相關(guān)研究報道較少。2013年任向榮等[15]建立了禾谷絲核菌高效、穩(wěn)定的原生質(zhì)體制備體系,并發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)體再生菌株和原始菌株之間的形態(tài)學、生長速率及致病性差異不顯著,但未能成功獲得禾谷絲核菌的遺傳轉(zhuǎn)化子。本文以R.cerealis菌株WK-206為研究對象,探索了R.cerealis原生質(zhì)體制備的方法并優(yōu)化了原生質(zhì)體再生的條件,為進一步建立有效的禾谷絲核菌遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

小麥紋枯病禾谷絲核菌(R.cerealis)菌株WK-206,由本實驗室從小麥紋枯病病株上分離、鑒定并保存。

1.1.2 細胞壁裂解酶

溶壁酶(lywallzyme)購自廣東碧德生物技術(shù)有限公司;Glucanex購自諾維信公司;纖維素酶(Cellulase-R-10)購自北京經(jīng)科宏達生物技術(shù)有限公司;裂解酶(lytic enzyme)購自Sigma-Aldrich公司;蝸牛酶(snailase)購自索萊寶生物科技有限公司。細胞壁裂解酶液用0.7 mol/L NaCl溶液配制,經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌,于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基

TB3培養(yǎng)基：蔗糖200 g,酵母提取物3 g,酸水解酪蛋白3 g,瓊脂15 g,水1 000 mL,pH自然;完全培養(yǎng)基：葡萄糖 60 g,蛋白胨20 g,酵母膏 10 g,瓊脂15 g,水1 000 mL,pH 6.0;OCM培養(yǎng)基：硝酸鈉6 g,微量元素混合液1 mL,復合維生素液1 mL,葡萄糖10 g,蛋白胨2 g,酵母提取物1 g,酪蛋白1 g,瓊脂15 g,蔗糖239.6 g,水1 000 mL, pH 6.5。

1.1.4 原生質(zhì)體滲透壓穩(wěn)定劑

STC緩沖液：山梨醇200 g,0.5 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)100 mL,CaCl2·2H2O 1.5 g,水1 000 mL,;SuTC緩沖液：蔗糖200 g,0.5 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)100 mL,CaCl2·2H2O 1.5 g,水1 000 mL;0.7 mol/L NaCl：NaCl 40.9 g,水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌絲體的收集與原生質(zhì)體的制備

經(jīng)活化的禾谷絲核菌WK-206,取其前端幼嫩菌絲接種于鋪有滅菌玻璃紙的PDA平板上,置于25 ℃恒溫培養(yǎng)4～5 d,將菌絲刮下?lián)v碎后,接種于100 mL PD液體培養(yǎng)基中,25 ℃下160 r/min振蕩培養(yǎng)6 d,用2層無菌紗布過濾收集菌絲,0.7 mol/L NaCl沖洗2～3次,5層濾紙吸干多余水分。

稱取菌絲,按5 mL酶解液裂解1 g菌絲(濕重)的比例添加酶液,30 ℃ 100 r/min振蕩酶解4 h,酶解液用4層擦鏡紙過濾,取濾液在顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù),試驗重復3次。采用DPS3.01軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和差異顯著性分析。

1.2.2 禾谷絲核菌原生質(zhì)體釋放及形態(tài)觀察

禾谷絲核菌WK-206菌絲在酶液中處理1 h后,吸取含菌絲的酶解液在Nikon-ECL IPSE90i顯微鏡下觀察原生質(zhì)體形態(tài)及其釋放過程,并拍照。

1.2.3 原生質(zhì)體接種方式

單層混菌法：將適量的原生質(zhì)體懸浮液加到冷卻至40～50 ℃的再生培養(yǎng)基中,混勻后倒入滅菌的培養(yǎng)皿中;單層涂菌法：將原生質(zhì)體懸浮液滴到已冷卻凝固的再生培養(yǎng)基平板上,用滅菌的涂布棒輕輕涂布均勻;雙層混菌法：將原生質(zhì)體懸浮液加入冷卻至40～50 ℃的再生培養(yǎng)基中,混勻后倒入已冷卻凝固的下層再生培養(yǎng)基平板上鋪平。

1.2.4 原生質(zhì)體再生條件的優(yōu)化

經(jīng)酶裂解并過濾的禾谷絲核菌原生質(zhì)體懸浮液于4 ℃、6 000 r/min離心8 min,用0.7 mol/L NaCl清洗原生質(zhì)體1～2次,用穩(wěn)滲劑重懸原生質(zhì)體并稀釋到濃度為1×103個/mL。按每皿0.1 mL(即每皿100個原生質(zhì)體)的接種量接種于原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基上,每處理接種3皿,25 ℃恒溫培養(yǎng)。自肉眼可見再生菌落出現(xiàn)開始,每天累加計數(shù)新產(chǎn)生的菌落,并在培養(yǎng)皿的底部標記，避免重復計數(shù),直至約7 d后菌落連成片,無法觀察到新生菌落為止。對照組以無菌水代替穩(wěn)滲劑重懸并稀釋原生質(zhì)體,可將已脫壁的原生質(zhì)體脹破而無法再生,因此對照組再生培養(yǎng)基上長出的菌落是原生質(zhì)體懸浮液中殘留的未脫壁的斷裂菌絲生長所產(chǎn)生。按以下公式計算小麥紋枯病菌原生質(zhì)體的再生率：

再生率(%)=(處理組菌落平均數(shù)-對照組菌落平均數(shù))/接種原生質(zhì)體總數(shù)×100。

采用L9(34)正交表,分析滲透壓穩(wěn)定劑種類(0.7 mol/L NaCl、STC和SuTC)、再生培養(yǎng)基種類和接種方式3個因素對禾谷絲核菌WK-206原生質(zhì)體再生的影響,對原生質(zhì)體再生條件進行優(yōu)化。試驗因素和水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 禾谷絲核菌原生質(zhì)體制備條件的確定

2.1.1 細胞壁降解酶及其組合對禾谷絲核菌原生質(zhì)體釋放的影響

5種細胞壁降解酶均在酶濃度20 mg/mL、反應溫度30 ℃的條件下裂解菌絲4 h,表2的結(jié)果顯示,在以0.7 mol/L NaCl為穩(wěn)滲劑的條件下,溶壁酶對禾谷絲核菌細胞壁的裂解效果最好,酶解液中原生質(zhì)體的濃度可達到2.56×106個/mL,且與其他4種酶之間的差異顯著。其次為蝸牛酶和Glucanex,原生質(zhì)體濃度分別為6.61×105個/mL和3.61×105個/mL,裂解酶產(chǎn)生的原生質(zhì)體較少,為2.22×104個/mL,而纖維素酶處理的菌絲未見原生質(zhì)體釋放。

1) 各種酶用量均為20 mg/mL,同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。下同。

The concentration of each enzyme is 20 mg/mL.Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level. The same below.

選擇單酶處理釋放原生質(zhì)體效果較好的溶壁酶和蝸牛酶,以不同濃度組合配制成混合酶液,進一步測定混合酶液對禾谷絲核菌細胞壁的降解效果,期望得到裂解效果更佳的混合酶液組合。表3結(jié)果顯示,在30 ℃下，混合酶液15 mg/mL溶壁酶+10 mg/mL蝸牛酶裂解4 h的降解效果最好,且原生質(zhì)體產(chǎn)量與20 mg/mL溶壁酶單酶液處于同一數(shù)量級。由于與蝸牛酶相比溶壁酶價格較高,而混合酶液可在保證原生質(zhì)體產(chǎn)量的基礎(chǔ)上降低溶壁酶的用量。同時考慮到降解效果和試驗成本,確定選擇15 mg/mL溶壁酶+10 mg/mL蝸牛酶組合為禾谷絲核菌原生質(zhì)體制備的最佳酶液。

表3 不同溶壁酶+蝸牛酶濃度組合對R.cerealis原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

2.1.2 酶解溫度對禾谷絲核菌原生質(zhì)體釋放的影響

以15 mg/mL溶壁酶+10 mg/mL蝸牛酶混合酶液分別在27、30、33和36 ℃下處理禾谷絲核菌的菌絲,保溫4 h后取酶解液進行原生質(zhì)體計數(shù),每個處理3個重復。由圖1可見,酶液在30 ℃條件下可以達到最佳的催化裂解禾谷絲核菌細胞壁的效果,釋放的原生質(zhì)體數(shù)量最多,且與其他3組處理比較差異顯著。

圖1 不同酶解溫度對R.cerealis原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of different treatment temperatures on the yield of R.cerealis protoplasts

2.1.3 酶解時間對禾谷絲核菌(R.cerealis)原生質(zhì)體釋放的影響

用15 mg/mL溶壁酶+10 mg/mL蝸牛酶混合酶液制備R.cerealis原生質(zhì)體,30 ℃下處理1 h,即有原生質(zhì)體開始釋放,處理4 h,原生質(zhì)體釋放量可達到3.04×106個/mL。隨著酶解時間的延長,原生

質(zhì)體的濃度開始下降,推測可能是由于酶解時間過長,導致已釋放的原生質(zhì)體開始破裂死亡,從而造成原生質(zhì)體產(chǎn)量的下降。由圖2可確定在本試驗條件下,酶解4 h是獲得原生質(zhì)體較理想的時間。

圖2 不同酶解時間對R.cerealis原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of different digestion times on the yield of R.cerealis protoplasts

2.2 禾谷絲核菌R.cerealis原生質(zhì)體的形成

在禾谷絲核菌原生質(zhì)體的制備過程中發(fā)現(xiàn),經(jīng)酶液處理1 h后,原生質(zhì)體開始釋放。禾谷絲核菌原生質(zhì)體主要從菌絲尖端吐出和從菌絲側(cè)面溢出兩種方式進行釋放(圖3a～b)。完全脫壁的原生質(zhì)體呈球狀(圖3c)。

圖3 R.cerealis原生質(zhì)體釋放過程Fig.3 The modes and morphology of protoplasts releasing from R.cerealis

2.3 影響禾谷絲核菌原生質(zhì)體再生因素的分析

采用L9(34)正交表,安排試驗,分析滲透壓穩(wěn)定劑(0.7 mol/L NaCl、STC和SuTC)、再生培養(yǎng)基和原生質(zhì)體接種方式3個因素對禾谷絲核菌原生質(zhì)體再生的影響,每個處理3個重復,取3個重復的平均值進行方差分析。

在表4中,極差(R值)分析可以看出,各因素對原生質(zhì)體再生率的影響主次順序依次為：再生培養(yǎng)基(C)>接種方式(B)>滲透壓穩(wěn)定劑(A),再生培養(yǎng)基(因素C)是影響原生質(zhì)體再生率的主要因素。方差分析結(jié)果表明,3種再生培養(yǎng)基對原生質(zhì)體再生的影響差異顯著,其中以C1,即TB3再生培養(yǎng)基再生效果最好。接種方式(因素B)的1水平和2、3水平之間也存在顯著差異,以第一種接種方式即單層混菌法效果最好。穩(wěn)滲劑(因素A)的3個不同水平對原生質(zhì)體再生作用的影響較小,三者間差異不顯著,但以SuTC穩(wěn)滲劑(A2)的效果較好。結(jié)合后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化條件的需要進行綜合分析,選擇原生質(zhì)體再生的優(yōu)化條件組合為A2B1C1,即以SuTC緩沖液為穩(wěn)滲劑,采用單層混菌法接種于TB3再生培養(yǎng)基。后續(xù)試驗證明,在這種條件下,禾谷絲核菌原生質(zhì)體再生率可達58.6%。圖4為禾谷絲核菌原生質(zhì)體在PDA平板上再生菌落的形態(tài)。

表4 R.cerealis原生質(zhì)體再生結(jié)果分析表1)

1) 同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著;R為同一列中不同水平所得平均結(jié)果的極差;K表示每列中同一水平對應的試驗結(jié)果之和;k為每列水平對應試驗結(jié)果總和的平均數(shù);D為空白列。

Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level；Rindicates the range of average results in the same column obtained from different levels;Krepresents the summation of results from the same level in each column；krepresents the average value of the results from the same level in each column;Drepresents blank column.

圖4 禾谷絲核菌原生質(zhì)體再生菌落培養(yǎng)不同時間后形態(tài)Fig.4 The morphologies of protoplast-regenerated colonies of R.cerealis cultured for different days

3 討論

本研究優(yōu)化了禾谷絲核菌(R.cerealis)原生質(zhì)體制備及再生的方法,確定原生質(zhì)體再生條件為：收集液體培養(yǎng)6 d的禾谷絲核菌菌絲,采用15 mg/mL溶壁酶+10 mg/mL蝸牛酶組成的混合酶液,按酶液∶菌絲(濕重)=5∶1的質(zhì)量比混合,在30 ℃,100 r/min的條件下,酶解4 h,原生質(zhì)體釋放量可達到3.04×106個/mL;禾谷絲核菌原生質(zhì)體再生的優(yōu)化條件為：以SuTC為穩(wěn)滲劑懸浮原生質(zhì)體,單層混菌法接種于TB3再生培養(yǎng)基,于25 ℃培養(yǎng)5～10 d,這種條件下,禾谷絲核菌原生質(zhì)體的再生率較高,可達58.6%。

有關(guān)酶的種類和濃度、酶解溫度與時間、菌齡、滲透壓穩(wěn)定劑、pH等因素對水稻紋枯病立枯絲核菌R.solani原生質(zhì)體制備與再生影響的研究已有一些報道,而很少見到針對禾谷絲核菌R.cerealis原生質(zhì)體制備與再生的相關(guān)報道。Robinson等[10]比較了14種單酶和10種混合酶的酶解效果,發(fā)現(xiàn)Novozyme 234對R.solaniAG 3的酶解效果最佳,原生質(zhì)體產(chǎn)量可達2.02×106個/mL。楊迎青等[14]發(fā)現(xiàn)纖維素酶、溶菌酶、崩潰酶3種酶以1∶1∶1的比例組合,混合酶液終濃度為10 mg/mL時對R.solani菌絲細胞壁的酶解效果最佳,原生質(zhì)體產(chǎn)量可達4×107個/g菌絲。孔丹丹等[13]研究發(fā)現(xiàn)用15 mg/mL Glucanex和10 mg/mL溶壁酶組成的混合酶處理,可高效降解水稻紋枯病菌細胞壁,原生質(zhì)體產(chǎn)量達3.09×107個/g菌絲,原生質(zhì)體再生率可達58%。在本研究的單酶裂解試驗中,在酶濃度均為20 mg/mL的條件下,以溶壁酶的細胞壁降解效果最好,這與任向榮等[15]的結(jié)果一致。溶菌酶實質(zhì)上是一種復合酶,研究表明,針對特定的真菌,多種酶的組合共同作用可以促進細胞壁的裂解和增加原生質(zhì)體的產(chǎn)量[16-18],因此推測這可能是溶壁酶裂解R.cerealis細胞壁效果較好的一個重要原因。

張卉等[19]在選擇適宜姬松茸原生質(zhì)體制備的酶系統(tǒng)時發(fā)現(xiàn),與單酶液處理相比,以1.5 %溶壁酶與0.5 %蝸牛酶和0.5 %纖維素酶組成的酶系統(tǒng)效果最好,本試驗也進行了混合酶液試驗,旨在尋找裂解效果更佳的組合,結(jié)果顯示混合酶液與溶壁酶單酶液均可高效降解禾谷絲核菌細胞壁并可獲得大量原生質(zhì)體,而兩者的裂解效果差異不大,考慮到混合酶液減少了溶壁酶的使用量,相較于使用20 mg/mL溶壁酶可有效降低試驗成本,因此在本試驗條件下,最終確定了選用混合酶液,并以15 mg/mL溶壁酶+10 mg/mL蝸牛酶為最佳混合酶液的配比濃度。

不同種屬微生物原生質(zhì)體的制備對菌齡的要求不同。前人研究表明,生長旺盛的菌體原生質(zhì)體產(chǎn)量較大[20-22],為使菌體細胞易于原生質(zhì)體化,一般選擇對數(shù)生長期的菌體制備原生質(zhì)體[23]。菌齡也會影響原生質(zhì)體的生理狀況,只有從成熟菌絲中釋放的原生質(zhì)體,才具有較完善的生理功能和較強的自我恢復能力,更有利于細胞壁的再生[24]。楊迎青等[14]、孔丹丹等[13]的研究中,Rhizoctoniasolani(屬于AG-1-ⅠA融合群)以液體培養(yǎng)36 h為最適菌齡。R.cerealis屬于AG-D融合群,由于自身遺傳特性的原因,菌絲生長速度較慢,本試驗采用PD液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)R.cerealis,6 d達到對數(shù)生長期,可以獲得足量的菌絲,菌絲產(chǎn)量大大高于固體平板培養(yǎng)。并且菌絲球直徑相對較小(直徑約1 mm),有利于酶解液的滲透和裂解。原生質(zhì)體再生試驗也表明,6 d菌齡也適于原生質(zhì)體的再生。

在酶解時間方面,任向榮等[15]用2%的溶壁酶處理培養(yǎng)44 h的禾谷絲核菌幼嫩菌絲,1.5 h是收獲原生質(zhì)體的最佳時間。陳孝仁等[25]用Driselase和Lysing酶的混合液消解大豆疫霉(PhytophthorasojaeKaufmann & Gerdemann)細胞壁時,處理3 h效果最好,周慶新等[26]在利用0.15 mol/L溶壁酶制備疏綿狀嗜熱絲孢菌原生質(zhì)體時需酶解4 h,Hashiba等[27]和張?zhí)鞎缘萚28]認為酶解立枯絲核菌3 h后原生質(zhì)體的產(chǎn)率幾乎保持穩(wěn)定。不同報道之間的差異可能是由于試驗中所用酶的種類、滲透穩(wěn)壓劑或供試菌株種類和菌齡的不同所致。本試驗中酶解開始1 h即有原生質(zhì)體通過菌絲頂端吐出和側(cè)面溢出兩種方式釋放出來,4 h時原生質(zhì)體釋放量達到最大,酶解時間超過4 h,原生質(zhì)體產(chǎn)量下降,這可能由于酶長時間作用于已釋放的原生質(zhì)體,影響了質(zhì)膜的穩(wěn)定性,破壞了膜系統(tǒng),導致原生質(zhì)體破裂,數(shù)量減少。

在影響原生質(zhì)體再生的諸多因素中,很少見到關(guān)于接種方式對原生質(zhì)體再生影響的討論。本研究中,單層混菌法接種原生質(zhì)體的再生率最高,且與另外兩種接種方式差異顯著。同時作為遺傳轉(zhuǎn)化的試驗基礎(chǔ),單層混菌法也是操作上相對簡便的一種原生質(zhì)體接種方式。在原生質(zhì)體再生的過程中,滲透壓穩(wěn)定劑主要起維持質(zhì)膜系統(tǒng)滲透壓的作用,本文測定的3種穩(wěn)滲劑對禾谷絲核菌原生質(zhì)體再生率的影響差異不顯著,考慮到后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化試驗的需要[29],最終確定以SuTC緩沖液為最適的滲透壓穩(wěn)定劑。再生培養(yǎng)基除了需要具備豐富的營養(yǎng)之外,也要維持穩(wěn)定的滲透壓,與滲透壓穩(wěn)定劑共同對原生質(zhì)體的形態(tài)起到保護作用,以維持原生質(zhì)體的正常生理狀態(tài)。綜合以上因素,經(jīng)正交試驗和方差分析,確定以SuTC緩沖液為穩(wěn)滲劑懸浮R.cerealis原生質(zhì)體,并采用單層混菌法接種于TB3再生培養(yǎng)基,經(jīng)后續(xù)試驗驗證,通過這種方法原生質(zhì)體的再生率較高,可達58.6%。

原生質(zhì)體技術(shù)的發(fā)展,促進了絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化研究和分子生物學研究的進步。目前,已可以從幾乎所有的真菌類群中獲得原生質(zhì)體,但由于各種微生物細胞壁組成的差異,制備原生質(zhì)體的條件也各不相同。對小麥紋枯病菌R.cerealis原生質(zhì)體的制備和再生影響因素的探討與研究,為后期遺傳轉(zhuǎn)化體系建立以及對該菌的分子遺傳學和致病機制的研究創(chuàng)造了必要條件。

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(責任編輯：楊明麗)

Protoplast preparation and regeneration ofRhizoctoniacerealis

Zhang Dezhen1,2, Chen Xiaoxia1, Gao Xianyue1, Yu Jinfeng1

(1. Department of Plant Pathology, College of Plant Protection,Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China; 2. Weifang University of Science and Technology, Shouguang 262700, China)

Rhizoctoniacerealisis the main pathogen of wheat sharp eyespot in China. In order to obtain high-quality protoplasts for the transformation ofRhizoctoniacerealis, the factors influencing preparation ofR.cerealisprotoplasts were studied. The results showed that the suitable conditions for protoplast preparation were as followed: mycelia of 6 d, a mixture of 15 mg/mL lywallzyme and 10 mg/mL snailase, digested at 30 ℃ for 4 h The protoplast yield reached 3.0×106cell/mL.The optimal regeneration conditions forR.cerealisprotoplasts were as followed: SuTC as osmotic stabilizer, TB3 medium, inoculating by mixing the protoplasts with unsolidified medium. The protoplast regeneration rate could reach 58.6%. This study is an important foundation for exploring the molecular genetics of the development and pathogenic mechanism of this pathogen.

Rhizoctoniacerealis; protoplast; preparation; regeneration

2014-09-25

2014-12-11

國家自然科學基金(30870007)；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團隊建設(shè)專項資金(SDAIT-04-022-06)

S 435.121.49

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.016

* 通信作者 E-mail: jfyu@sdau.edu.cn