封立平, 李洪林, 倪 新, 王 簡, 紀(jì) 瑛, 甘琴華

(1. 山東出入境檢驗檢疫局,青島 266002;2. 濱州出入境檢驗檢疫局， 濱州 256603;3. 臨沂出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心, 臨沂 276034)

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木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的LAMP 快速檢測方法

封立平1, 李洪林2, 倪 新3, 王 簡1, 紀(jì) 瑛1, 甘琴華1

(1. 山東出入境檢驗檢疫局,青島 266002;2. 濱州出入境檢驗檢疫局， 濱州 256603;3. 臨沂出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心, 臨沂 276034)

建立了一種木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增快速檢測方法,為木薯細(xì)菌性萎蔫病的快速檢測提供有力的技術(shù)支持。針對木薯細(xì)菌性萎蔫病菌TAL效應(yīng)器蛋白質(zhì)(pthBXam)靶序列的6個位點設(shè)計4條特異性引物,并對反應(yīng)溫度和內(nèi)引物濃度等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,設(shè)計的引物與試驗中提供的其他黃單胞近緣種都沒有擴(kuò)增反應(yīng),表現(xiàn)了較好的特異性。LAMP 方法對木薯細(xì)菌性萎蔫病菌菌株DNA的檢測下限為1 pg/μL,比常規(guī)PCR靈敏度高100倍。該方法采用SYBR Green I染料法對擴(kuò)增產(chǎn)物閉管檢測,裸眼觀察顏色變化判斷反應(yīng)結(jié)果，能快速、準(zhǔn)確地對田間樣品進(jìn)行檢測,沒有出現(xiàn)假陽性和假陰性。與其他檢測方法相比,LAMP 方法檢測時間短,效率高,降低了設(shè)備投入,易于操作,適合木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的現(xiàn)場檢疫和大規(guī)模監(jiān)測。

木薯細(xì)菌性萎蔫病菌; 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增; 檢測

木薯是重要的熱帶薯類作物,在保障全球糧食安全及發(fā)展生物質(zhì)能等方面具有重要的作用[1]。中國是世界上最大的木薯進(jìn)口國,而木薯細(xì)菌性萎蔫病是木薯上重要的檢疫性病害。該病具有高風(fēng)險、分布廣、可種傳的特點,是木薯繁育的重要限制因子[2]。該病害目前在除歐洲以外的許多國家都有報道,木薯感染此病后產(chǎn)量可下降12%～100%[3-4]。引起該病害的病原菌木薯細(xì)菌性萎蔫病菌(Xanthomonasaxonopodispv.manihotis)在我國新出臺的《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》中被列為檢疫性有害生物,也是國際上重要的植物檢疫對象。該病菌主要危害木薯的葉片、莖部,引起萎蔫和頂枯,屬維管束系統(tǒng)性侵染病害。木薯細(xì)菌性萎蔫病菌主要靠帶菌的種莖進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播,此外雨水、昆蟲、病土及帶菌工具也可傳播[5]。如何利用先進(jìn)的檢測技術(shù)有效地對進(jìn)境木薯繁殖材料進(jìn)行檢疫和對木薯產(chǎn)區(qū)的木薯細(xì)菌性萎蔫病菌進(jìn)行監(jiān)測,保護(hù)我國的木薯良種引種繁育和生產(chǎn)安全是亟待解決的問題。

目前一些分子檢測方法如各類PCR、雜交探針、RAPD、 AFLP等已被廣泛應(yīng)用于木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的檢測鑒定,并且在口岸檢疫中縮短了檢測周期,但其昂貴的儀器設(shè)備和較高的假陽性率,限制了其推廣[6-10]。環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)是Notomi等2000年開發(fā)的一種恒溫核酸擴(kuò)增方法[11]。其原理是針對靶基因的6個區(qū)域,設(shè)計4條特異性引物,利用一種鏈置換Bst DNA聚合酶,恒溫反應(yīng)1 h左右可合成109～1010拷貝的靶DNA序列,通過直接觀察產(chǎn)物顏色進(jìn)行結(jié)果判定。該技術(shù)從2003年開始首先被用于醫(yī)學(xué)的臨床檢測,取得了引人注目的效果[12]。目前許多學(xué)者利用LAMP 技術(shù)對難以培養(yǎng)的細(xì)菌、生化反應(yīng)不明顯及傳統(tǒng)表型方法不能鑒定的細(xì)菌進(jìn)行了快速準(zhǔn)確的鑒定[13]。但該技術(shù)目前在植物病原細(xì)菌檢測領(lǐng)域應(yīng)用較少,未見木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的LAMP 檢測方法的報道。

本研究建立了一種木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的LAMP 高通量檢測方法,適合木薯繁殖材料的大量、即時、現(xiàn)場的檢測,特異性、靈敏度比普通PCR方法高,同時不需高昂的儀器投入,便于基層推廣。該方法的建立可為進(jìn)境木薯繁殖材料的檢疫和大田監(jiān)測提供技術(shù)支持,保護(hù)我國木薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 供試材料

感染木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的木薯植株葉片由華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境與保護(hù)學(xué)院提供;其他供試菌株和來源：木薯細(xì)菌性萎蔫病菌(Xanthomonasaxonopodispv.manihotis)ATCC 51302;地毯草黃單胞菌檳榔致病變種(Xanthomonasaxonopodispv.arecae)ACCC 03534;野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonascampestrispv.campestris)ACCC 10491;甘藍(lán)黑腐病禾草類致病變種(Xanthomonascampestrispv.cerealis)ACCC 14146;水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)ACCC 11602;風(fēng)信子黃腐病菌(Xanthomonashyacinthi)ATCC 12612;地毯草黃單胞菌萬年青致病變種(Xanthomonasaxonopodispv.dieffenbachiae)ATCC 23379。ATCC為美國標(biāo)準(zhǔn)菌種庫,ACCC為中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

試劑：Bst DNA polymerase large fragment,購于New England Biolabs(NEB)公司;DNA marker,購于寶生物工程(大連)有限公司;dNTPs,購于上海生工生物工程有限公司;瓊脂糖,購于Promega公司;細(xì)菌DNA提取試劑盒,購于天根生化科技(北京)有限公司;營養(yǎng)肉湯,購于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;SYBR GreenⅠ,購于嘉美生物有限公司。

儀器：水浴鍋,購于上海森信實驗儀器有限公司; BioPhotometer Plus核酸蛋白測定儀,購于Eppendorf 中國有限公司;DYCP-32C型水平電泳儀,購于北京六一儀器廠;Vilber Lourmat凝膠成像系統(tǒng),購于法國Vilber Lourmat公司;WFH-201B紫外透射反射儀,購于上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司;LAMP Realtime Turbidimeter LA-320c,購于日本榮研化學(xué)株式會社。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)及DNA提取

根據(jù)天根細(xì)菌總DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行各病原菌總DNA的提取。所提樣品DNA的A260/A280在1.6～2.0范圍內(nèi),核酸濃度在40～100 ng/μL范圍內(nèi)。-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計與合成

以GenBank中木薯細(xì)菌性萎蔫病菌致病質(zhì)粒Pbsf2上的TAL效應(yīng)器蛋白質(zhì)(pthBXam)保守基因(GenBank 登錄號：HQ113297.1)為靶標(biāo),利用Primer Explorer Version 4.0在線設(shè)計4條LAMP 特異性引物。其中F3 (5′-CAGAACATCCCGAC-GCTG-3′)和B3(5′-GCCCTGTGGCCGTTGA-3′)為外側(cè)引物,FIP(5′-AGCGCGACCGCTTAAGTCAAGGTTCCGGCTTACATCCCCA-3′)和BIP(5′-GGCATTGCCGGCGATCACTTCGAGCTTCGGAAAGGACCA-3′)為內(nèi)側(cè)引物。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。設(shè)計的引物通過NCBI BLAST進(jìn)行比對后顯示該內(nèi)、外側(cè)引物擴(kuò)增的靶標(biāo)是木薯細(xì)菌性萎蔫病菌特有的TAL效應(yīng)器蛋白質(zhì)(pthBXam)保守基因序列。

1.2.3 常規(guī)PCR檢測

自行設(shè)計木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的常規(guī)PCR檢測體系。采用25 μL體系：10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5 μL,DNA 模板1 μL,2.5 mmol/L MgC12溶液1.5 μL,50 mmol/L上游引物(5′-GTCCTGCCCACGAACTTCTG-3′)和50 mmol/L下游引物(5′-TGACAGCGACGGTCCCTAA-3′)各1 μL,2.5 mmol/L dNTPs 1 μL,5 U/μLTaqDNA聚合酶0.5 μL。補(bǔ)水至25 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s,54 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,30個循環(huán);最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增片段大小為602 bp。該方法用于后續(xù)LAMP 和PCR的檢測靈敏度分析。

1.2.4 LAMP 反應(yīng)體系優(yōu)化及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

LAMP 反應(yīng)采用25 μL反應(yīng)體系：菌株DNA 2 μL,8 U/μL Bst DNA Polymerase 2 μL,10 mmol/L dNTPs 4 μL,基礎(chǔ)反應(yīng)液[10×Thermol buffer,20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8,25 ℃),10 mmol/L KCl,10 mmol/L (NH4)2SO4,8 mmol/L MgSO4,0.01% Triton X-100]12.5 μL,5 μmol/L的外引物(F3與B3)1 μL,10 μmol/L的內(nèi)引物(FIP與BIP)1 μL,補(bǔ)水至25 μL。其中各組分均為工作液濃度。反應(yīng)條件設(shè)定為62 ℃(根據(jù)Bst酶推薦的擴(kuò)增溫度60～65 ℃的特性確定)60 min，然后80 ℃ 10 min終止反應(yīng),降溫至4 ℃。LAMP 反應(yīng)前在PCR反應(yīng)管內(nèi)蓋上加入1 μL 1∶10倍稀釋的SYBR GreenⅠ熒光染料,待反應(yīng)結(jié)束后瞬時離心將SYBR GreenⅠ加入LAMP 反應(yīng)液中進(jìn)行顯色觀察,避免開蓋可能導(dǎo)致的氣溶膠污染。在此反應(yīng)體系基礎(chǔ)上,根據(jù)不同條件下擴(kuò)增的最短起始時間、擴(kuò)增產(chǎn)物量等確定反應(yīng)的最佳溫度和最佳內(nèi)外引物濃度。

溫度優(yōu)化：根據(jù)內(nèi)外引物組的Tm值,將反應(yīng)混合物分別在59、60、61、62、63、64和65 ℃反應(yīng)60 min然后80 ℃ 10 min終止反應(yīng)。用LAMP Realtime Turbidimeter LA-320c對反應(yīng)進(jìn)行實時監(jiān)控,收集擴(kuò)增起始時間信息,進(jìn)行顯著性分析,篩選出最佳反應(yīng)溫度。

內(nèi)引物濃度優(yōu)化：外引物F3、B3只在LAMP 反應(yīng)的最初階段起引導(dǎo)作用,用量很少,因此內(nèi)引物濃度的優(yōu)化比較重要。固定外引物F3、B3的用量為5 μmol,設(shè)置內(nèi)引物FIP、BIP的用量以10、20、30、40、50、60 μmol依次遞增,用LAMP Realtime Turbidimeter LA-320c對反應(yīng)進(jìn)行實時監(jiān)控,收集擴(kuò)增起始時間信息,進(jìn)行顯著性分析,篩選出最佳引物濃度。

擴(kuò)增產(chǎn)物通過熒光染料法或凝膠電泳法檢測。熒光染料法： LAMP 反應(yīng)前在PCR反應(yīng)管內(nèi)蓋上加入1 μL 1∶10倍稀釋的SYBR Green Ⅰ熒光染料，待反應(yīng)結(jié)束后瞬時離心將SYBR Green Ⅰ加入LAMP 反應(yīng)液中進(jìn)行顯色反應(yīng)。陽性擴(kuò)增產(chǎn)物(大量雙鏈DNA)的顏色為翠綠色,陰性擴(kuò)增產(chǎn)物為橙色。凝膠電泳法：將LAMP 反應(yīng)的產(chǎn)物,用含溴化乙錠(EB)的1.5%瓊脂糖凝膠電泳。在紫外透射儀下觀察核酸帶，陽性擴(kuò)增產(chǎn)物可見從點樣孔的拖尾現(xiàn)象以及很多不同擴(kuò)增長度的條帶；陰性則沒有條帶。

1.2.5 利用LAMP 方法特異性檢測木薯細(xì)菌性萎蔫病菌

以木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的近緣細(xì)菌為對照菌檢測LAMP 方法的特異性。對照菌包括地毯草黃單胞菌檳榔致病變種、野油菜黃單胞菌野油菜致病變種、甘藍(lán)黑腐病禾草類致病變種、水稻白葉枯病菌、風(fēng)信子黃腐病菌、地毯草黃單胞菌萬年青致病變種。分別以感染木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的葉片總DNA、木薯細(xì)菌性萎蔫病菌菌株DNA、上述6種對照菌的DNA為模板,采用已優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行LAMP 方法特異性檢測,檢測結(jié)果通過熒光染料法和1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

1.2.6 LAMP 方法靈敏度檢測

以感染木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的木薯葉片總DNA為模板進(jìn)行靈敏度分析。利用核酸蛋白儀測定DNA濃度并稀釋為100 ng/μL。取1 μL DNA按照10倍進(jìn)行梯度稀釋,用不同稀釋度的DNA為模板進(jìn)行LAMP 靈敏度檢測。同時以相同的模板進(jìn)行常規(guī)PCR試驗,以比較常規(guī)PCR與LAMP 方法靈敏度的差異。檢測結(jié)果通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

1.2.7 染病植株檢測

用建立的Xam-LAMP 檢測方法和常規(guī)PCR方法對廣西木薯研究所收集的已經(jīng)過致病性檢測的30份染病木薯葉片樣品和30份未染病的健康葉片樣品進(jìn)行檢測。以木薯細(xì)菌性萎蔫病菌菌株DNA為陽性對照。對比LAMP 檢測方法和常規(guī)PCR方法的檢出率,并比較與致病性結(jié)果是否一致。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化

2.1.1 LAMP 反應(yīng)溫度優(yōu)化結(jié)果

LAMP 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測表明,反應(yīng)在59、60、61、62、63、64和65 ℃下都有擴(kuò)增,特征電泳條帶均很亮,表明設(shè)計的引物好,反應(yīng)條件寬松(圖1a)。SYBR Green Ⅰ熒光染料檢測結(jié)果顯示,1～7號反應(yīng)管反應(yīng)液顏色變綠,表明有擴(kuò)增反應(yīng);8號反應(yīng)管內(nèi)的反應(yīng)液保持橙色不變,表明未發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)(圖1b)。用鄧肯氏新復(fù)極差測驗分析不同反應(yīng)溫度下的起始反應(yīng)時間統(tǒng)計結(jié)果表明,隨著溫度的上升,反應(yīng)時間呈現(xiàn)先降后升的趨勢,當(dāng)溫度為61 ℃時,28.16 min即開始擴(kuò)增,起始反應(yīng)時間最短,擴(kuò)增效率高(表1)。因此,將61 ℃確定為Xam-LAMP 檢測的最適溫度。

圖1 Xam-LAMP反應(yīng)溫度的優(yōu)化Fig.1 Optimization of reaction temperature of Xam-LAMP test

溫度/℃Temperature3個重復(fù)起始時間/minStartingtimeof3replicates123平均值/minMean5938.0038.5639.2038.59b6030.0230.7831.0030.60d6128.0227.6528.8028.16e6231.2532.2231.8531.77c6332.0033.0231.4532.16c6444.0044.5144.2044.23a6544.5044.3245.8044.87a

1) 表中不同字母表示經(jīng)鄧肯氏新復(fù)極差測驗，各處理間在0.05水平差異顯著。下同。

Different letters in the table indicate the significant difference between each treatment at 0.05 level by Duncan’s new multiple range test. The same below.

2.1.2 LAMP內(nèi)引物濃度優(yōu)化結(jié)果

采用LAMP Realtime Turbidimeter LA-320c設(shè)備,使用LAMP濁度法分析不同內(nèi)引物濃度下的起始反應(yīng)時間。設(shè)備自動生成擴(kuò)增速率和擴(kuò)增曲線圖(圖2)。用鄧肯氏新復(fù)極差測驗分析不同內(nèi)引物濃度下起始反應(yīng)時間。統(tǒng)計結(jié)果表明,相同反應(yīng)條件下,FIP/BIP引物為40 μmol時,起始反應(yīng)時間平均值為27.47 min,比其他用量的起始反應(yīng)時間都短,擴(kuò)增效率最高。增加或減少FIP/BIP用量,擴(kuò)增效率降低,起始反應(yīng)時間延遲(圖2和表2)。因此引物FIP、BIP、F3與B3的終濃度比為8∶8∶1∶1較適宜。

表2 不同F(xiàn)IP/BIP用量下起始反應(yīng)時間

2.2 LAMP方法特異性檢測

分別以感染木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的葉片總DNA、木薯細(xì)菌性萎蔫病菌菌株和其對照菌株的核酸DNA為模板,用優(yōu)化的反應(yīng)體系進(jìn)行LAMP特異性測試,瓊脂糖電泳結(jié)果顯示感染木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的葉片、木薯細(xì)菌性萎蔫病菌菌株均出現(xiàn)典型的梯狀特異性條帶,而其他6種對照近緣細(xì)菌都沒有擴(kuò)增。SYBR GreenⅠ熒光染料法顯示,染病木薯葉片、木薯細(xì)菌性萎蔫病菌菌株反應(yīng)管反應(yīng)液顏色變綠,表明有擴(kuò)增反應(yīng);其他對照菌反應(yīng)管內(nèi)的反應(yīng)液保持橙色不變,表明未發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)。兩種擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法結(jié)果一致,結(jié)果表明本方法設(shè)計的引物對木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的特異性強(qiáng),可以準(zhǔn)確鑒定木薯細(xì)菌性萎蔫病菌(圖3)。

圖2 不同F(xiàn)IP/BIP濃度下的擴(kuò)增速率和擴(kuò)增曲線Fig.2 The amplification rate and amplification curve at different concentrations of primer FIP/BIP

圖3 木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的LAMP特異性試驗Fig.3 Specificity test for Xam-LAMP assay

2.3 LAMP方法靈敏度檢測結(jié)果

將感染木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的木薯葉片DNA稀釋成不同濃度，用優(yōu)化的LAMP檢測方法擴(kuò)增,瓊脂糖電泳結(jié)果表明,隨著模板濃度的降低,梯狀特異性條帶逐漸變淡,至稀釋度10-6時沒有擴(kuò)增產(chǎn)物(圖4a)，與LAMP的SYBR Green Ⅰ的檢測結(jié)果(圖4b)一致。根據(jù)DNA濃度計算得出,本LAMP方法的檢測下限為1 pg/μL。用普通PCR方法擴(kuò)增不同稀釋濃度的模板,結(jié)果表明,當(dāng)稀釋度為10-4時沒有擴(kuò)增產(chǎn)物,PCR方法的檢測下限約為100 pg/μL(圖4c)。通過比較可以看出,LAMP方法的靈敏度是普通PCR的100倍左右。

2.4 染病植株檢測結(jié)果

染病植株檢測結(jié)果顯示,陽性樣品葉片Xam-LAMP的檢出率為 93.3%,普通PCR方法的檢出率為90%。2種方法對30份健康葉片的檢測結(jié)果均為陰性。由此可見運用Xam-LAMP方法能夠?qū)δ臼砘铙w植株樣品實施準(zhǔn)確檢測,電泳結(jié)果與致病性檢測結(jié)果一致,沒有出現(xiàn)假陰性和假陽性,且檢測的準(zhǔn)確性優(yōu)于PCR方法。

3 討論

木薯起源于熱帶美洲,是熱帶地區(qū)主要的塊根作物,目前已成為我國華南地區(qū)的一種重要的旱地經(jīng)濟(jì)作物。木薯可作為食品和飼料及食品、化工等產(chǎn)業(yè)的原料。由于中國木薯生產(chǎn)不能滿足國內(nèi)需求,近年來木薯進(jìn)口一直呈上升趨勢。木薯細(xì)菌性萎蔫病菌是我國的檢疫性病原細(xì)菌,也是國際上重要植物檢疫對象,由它引起的木薯細(xì)菌性萎蔫病是木薯生產(chǎn)上最嚴(yán)重的細(xì)菌病害。感染該病后可導(dǎo)致木薯產(chǎn)量的巨大損失,以及木薯繁殖材料品質(zhì)的下降。2007—2010年對我國廣西、海南、云南木薯主產(chǎn)區(qū)的病害普查發(fā)現(xiàn),該病害的發(fā)生面積較大,嚴(yán)重威脅到木薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。木薯細(xì)菌性萎蔫病菌主要通過感病的種質(zhì)材料傳播。此病菌可以在不引起病癥的情況下,潛伏侵染木薯。所以建立準(zhǔn)確、高效、快速的木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的檢測方法,可以有效提高該病害的檢疫和監(jiān)測質(zhì)量,為木薯的無病良種繁育提供技術(shù)支持,保護(hù)我國木薯生產(chǎn)安全。

圖4 Xam-LAMP的靈敏度試驗Fig.4 Sensitivity test for Xam-LAMP assay

目前木薯細(xì)菌性萎蔫病菌傳統(tǒng)的檢測主要是病菌的分離培養(yǎng)鑒定,但該方法檢測靈敏度低、耗時長,已不能滿足口岸快速檢測的需要。依托PCR儀的各種檢測方法已成為該病菌檢測的主要手段。1998年Verdier 等建立了一種木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的PCR檢測方法,可以實現(xiàn)對木薯葉片和莖組織的檢測,從染病組織中均可特異性地擴(kuò)增出898 bp的序列,檢測下限達(dá)到3×102cfu/mL[6]。隨后,Ojeda等采用巢式PCR實現(xiàn)了木薯種子中木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的檢測[7],Verdier 等建立了木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的雜交探針檢測方法等[8]。 指紋圖譜技術(shù)被運用到木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的鑒定中,如Ogunjobi等采用RAPD 和 AFLP技術(shù)對尼日利亞西部的木薯細(xì)菌性萎蔫病菌進(jìn)行了遺傳變異的比較分析[10]。但是這些技術(shù)操作起來非常繁瑣,實驗時間長,各類PCR檢測還需要瓊脂糖電泳結(jié)果,不能滿足快速檢測的要求。而實時熒光定量PCR所采用的檢測設(shè)備和耗材更加昂貴。因此PCR檢測技術(shù)和雜交探針等方法在田間即時檢測方面不具備優(yōu)勢。本試驗采用LAMP技術(shù)建立木薯細(xì)菌性萎蔫病菌快速檢測體系,由于LAMP技術(shù)采用4條引物(其中2條超過40 bp)來識別目的片段6個特異性區(qū)域,使得LAMP檢測方法比PCR方法具有更好的特異性、便捷性、靈敏性。在本研究中,LAMP檢測下限為1 pg/μL,靈敏度為普通PCR的100倍。LAMP產(chǎn)物通過SYBR GreenⅠ染料染色,肉眼觀察顏色變化來判斷,1 h即可得到結(jié)果,具有無可比擬的可視性、即時性的檢測優(yōu)勢。此外,LAMP檢測在恒溫下進(jìn)行,只需要一臺水浴鍋或者培養(yǎng)箱即可,容易在田間地頭及貨場進(jìn)行檢測,也更適合在農(nóng)技基層部門推廣使用。

木薯細(xì)菌性萎蔫病菌菌株中廣泛存在致病質(zhì)粒Pbsf2,該質(zhì)粒與木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的病理特性密切相關(guān)。pthBXam基因是木薯細(xì)菌性萎蔫病菌致病質(zhì)粒Pbsf2上重要的編碼致病蛋白的基因,該致病蛋白對于木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的強(qiáng)致病力具有重要作用[14-16]。本研究采用pthBXam的保守基因設(shè)計引物, 保證了檢測方法的特異性。我們使用的這個基因序列在數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)同源序列,根據(jù)設(shè)計的LAMP特異性引物進(jìn)行該病菌及其對照菌的LAMP檢測,發(fā)現(xiàn)僅木薯細(xì)菌性萎蔫病菌獲得了預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物,而黃單胞菌屬的其他近緣種均未檢測出相應(yīng)的DNA片段。Xam-LAMP實現(xiàn)了受侵染木薯活性植株中該病原菌的準(zhǔn)確檢測,沒有出現(xiàn)假陰性和假陽性。木薯細(xì)菌萎蔫病菌在分類上原劃歸為油菜黃單胞(Xanthomonascampestris),目前劃歸為地毯草黃單胞(X.axonopodis)。本研究收集了黃單胞菌屬內(nèi)油菜黃單胞和地毯草黃單胞的近緣種作為對照菌株,保證了檢測結(jié)果的可靠性。研究采用了不開蓋檢測,在LAMP反應(yīng)前在PCR管內(nèi)蓋上加入SYBR Green Ⅰ熒光染料，使其附在管蓋內(nèi)側(cè),待反應(yīng)結(jié)束后瞬時離心將SYBR Green Ⅰ加入LAMP反應(yīng)液中進(jìn)行顯色觀察,避免了開蓋造成氣溶膠污染。

綜合試驗結(jié)果可以看出,本研究建立的木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增(LAMP)檢測方法與其他分子生物學(xué)技術(shù)相比檢測時間短,效率高;檢測儀器簡單,無須昂貴的PCR儀,降低了設(shè)備投入,是一種適合口岸檢驗檢疫機(jī)構(gòu)和基層實驗室進(jìn)行檢疫和監(jiān)測的方法,具有較廣闊的應(yīng)用前景。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for rapid detection ofXanthomonasaxonopodispv.manihotis

Feng Liping1, Li Honglin2, Ni Xin3, Wang Jian1, Ji Ying1, Gan Qinhua1

(1. Shandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qingdao 266002, China; 2. Binzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Binzhou 256603, China; 3. Comprehensive Technical Service Center of Linyi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Linyi 276034, China)

A rapid loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method was established for quick detection ofXanthomonasaxonopodispv.manihotis. The target sequence pthBXam was amplified by a set of four specific primers that recognize six distinct target sequences. The parameters, including the reaction temperature and the inner primer concentrations， were optimized. The LAMP primers did not react with other closely relatedXanthomonasin this test. The lower limit of detection of this LAMP assay was about 1 pg/μL DNA,which was 100 times more sensitive than PCR method. The amplification products could be checked by naked-eye visualization by a closed-tube detection technique with SYBR Green I staining. The LAMP method is simple and rapid method for detection ofX.axonopodispv.manihotisfrom the infected cassava sampled in the field. The LAMP assay has advantage of short detection time, high efficiency and low cost, which provides a new tool for on-site quarantining and large-scale monitoring of this pathogen.

Xanthomonasaxonopodispv.manihotis; LAMP; detection

2014-12-17

2015-03-09

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目(2009IK254;2011IK286);“十二五”國家科技支撐計劃(2012BAK11B02);山東出入境檢驗檢疫局科研項目(2005SK09)

S 432.41;S 436.43

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.018

聯(lián)系方式 E-mail: fengciq@163. com