徐廣增, 李 偉, 王新紅, 劉守柱, 王桂清

(聊城大學農(nóng)學院, 聊城 252059)

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斜紋夜蛾酚氧化酶酶學特性研究

徐廣增, 李 偉, 王新紅, 劉守柱*, 王桂清

(聊城大學農(nóng)學院, 聊城 252059)

以鄰苯二酚為底物,研究了斜紋夜蛾幼蟲酚氧化酶的酶學特性。結(jié)果表明：斜紋夜蛾幼蟲酚氧化酶的最適pH在6.7～7.0之間,pH 6.8時,穩(wěn)定性最好;最適溫度為30 ℃,20～35 ℃之間,穩(wěn)定性較好;在3 mL的測活體系中,當酶量為0.1 mL時,酶促反應速度隨底物濃度升高而增大,當?shù)孜餄舛葹?0 mmol/L時,酶促反應最快,超過10 mmol/L時,酶促反應趨于平衡;以鄰苯二酚為底物時,斜紋夜蛾酚氧化酶的Km值為7.980 mmol/L,Vm為204.082ΔA/mg·10 s。

斜紋夜蛾; 酚氧化酶; 酶學特性; 穩(wěn)定性; 酶活性

酚氧化酶(phenoloxidase,PO)廣泛存在于動物、植物、微生物等有機體內(nèi),又稱為酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase)或酪氨酸酶(tyrosinase),是生物體內(nèi)黑色素合成的關鍵酶[1]。酚氧化酶在昆蟲體內(nèi)一般以無活性的酚氧化酶原(prophenoloxidase,proPO,PPO)的形式存在,PPO及其激活因子便構(gòu)成了一個復雜的酶級聯(lián)反應系統(tǒng),即酚氧化酶原激活系統(tǒng)(prophenoloxidase-activated system,proPO-AS)。該系統(tǒng)由PO、酶蛋白、模式識別蛋白和蛋白酶的抑制劑構(gòu)成[2]。對于昆蟲的生化研究表明,PO主要存在于昆蟲的血細胞、血漿中,在中腸、表皮等組織中也有分布。通過對東亞飛蝗[Locustamigratoriamanilensis(Meyen)][3]、棉鈴蟲[Helicoverpaarmigera(Hübner)][4]、亞洲玉米螟[Ostriniafurnacalis(Guenée)][5]等昆蟲研究發(fā)現(xiàn)PO既存在于血細胞中,也存在于血漿中;在美洲大蠊[Periplanetaamericana(Linnaeus)]中,PO主要存在于血細胞中[6],但在家蠶(BombyxmoriLinnaeus)[7]和麻蠅(Sarcophagabullata)[8]中,PO多存在于血漿中,另外,Asano和Ashida還證實在家蠶(B.mori)表皮中存在兩種PO形式(F型和S型),由血細胞中釋放出來,經(jīng)修飾轉(zhuǎn)運至整個表皮,但轉(zhuǎn)運的機理尚未清楚[9]。Binnington和Barrett以多巴胺為底物,利用超微結(jié)構(gòu)細胞技術(shù)在銅綠蠅[Luciliacuprina(Wiedemann)]角質(zhì)的原表皮和上表皮中也發(fā)現(xiàn)了PO,且只有在人為角質(zhì)損傷的激活過程中才能檢測到原表皮中PO的活性[10]。雖然PO在不同昆蟲體內(nèi)分布的主要組織有所差異,但均對昆蟲的生長有重要的作用,主要參與昆蟲生長過程中黑色素的合成、體壁的鞣化和硬化、傷口的愈合、體液免疫等。正是由于PO在昆蟲的免疫、防御系統(tǒng)中起著重要的作用,因而可以作為害蟲控制的一個重要的作用靶標[1]。鑒于PO重要的生理功能和潛在的應用價值,已有很多學者研究了多種昆蟲PO的生物學特性和理化性質(zhì),如：劉春英等以鄰苯二酚為底物,研究了棗尺蠖酚氧化酶的酶學特性,測得其在pH 7.0、 37 ℃時活性最高,且酶的熱穩(wěn)定性較差[11];薛超彬等比較了菜青蟲不同蟲態(tài)及蟲齡的酚氧化酶性質(zhì),其中5齡幼蟲的酶活力最高,蛹的酶活力最低,且不同蟲態(tài)及蟲齡的PO催化底物氧化的最適pH基本相同,但最適溫度相差較大[12];高興祥等測得甜菜夜蛾酚氧化酶反應的最佳條件是：pH 6.5,最適溫度40 ℃,米氏常數(shù)Km=10.73 mmol/L[13]。

斜紋夜蛾[Spodopteralitura(Fabricius)]屬鱗翅目夜蛾科,是世界性分布的大害蟲,除南極洲外,其余六大洲都有其分布;國內(nèi)廣泛分布于各個農(nóng)區(qū)。斜紋夜蛾為雜食性害蟲,對糧食作物、經(jīng)濟作物、果樹、蔬菜、花卉、牧草、草坪草及林木等都能危害,大發(fā)生時給農(nóng)、林、牧業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境綠化造成巨大的經(jīng)濟損失。其寄主范圍十分廣泛：秦厚國等報道,該蟲的寄主涉及雙子葉植物、單子葉植物、蕨類植物和裸子植物共計109科389種(變種)[14]。鑒于斜紋夜蛾危害的嚴重性且對普通化學農(nóng)藥產(chǎn)生了較強的抗性[15],研發(fā)作用機制新穎、對環(huán)境友好的新型化合物十分必要,而酚氧化酶即是非常有希望的作用靶標之一。本文以斜紋夜蛾為材料,研究其體內(nèi)PO的酶活特性,包括最適溫度、pH和米氏常數(shù)等,旨在為尋找和開發(fā)以PO為靶標的新型害蟲控制劑提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 斜紋夜蛾飼養(yǎng)

斜紋夜蛾蟲源由華南農(nóng)業(yè)大學提供,在人工氣候養(yǎng)蟲室內(nèi)參照涂業(yè)茍等[16]方法使用人工飼料繼代飼養(yǎng)：室內(nèi)溫度(25±1)℃,相對濕度60%±5%,光周期L∥D=14 h∥10 h。收集2～3日齡的5齡幼蟲供試驗用。

1.2 試劑及儀器

本試驗所用的試劑均為國產(chǎn)分析純試劑,紫外分光光度計為UV-1700;冷凍離心機為D-37520,美國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品。

1.3 酶液的制備

取斜紋夜蛾5齡幼蟲,按1 g∶5 mL的比例加入預冷處理的0.2 mol/L磷酸緩沖液,冰浴勻漿,在4 ℃冰箱中靜置30 min后,4 ℃,8 000 r/min離心30 min,取上清液即為粗酶液。在制備的粗酶液中加入固體硫酸銨,邊加邊攪拌,使其飽和度達到30%,冰浴靜置30 min后,4 ℃,8 000 r/min離心30 min,收集鹽析后的沉淀物,將沉淀物用0.2 mol/L磷酸緩沖液溶解,得到待測酶液。

為測定提取過程中勻漿緩沖液pH對酶活力的影響,配制pH 6.1、6.5、6.8、7.0的磷酸緩沖液,分別按上述步驟提取酶液,并進行酶活力測定。

1.4 酚氧化酶酶學特征測定

1.4.1 酚氧化酶活力的測定

采用紫外分光光度計法[17]進行測定。在3 mL測活體系中含有：0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.0),終濃度0.01 mol/L鄰苯二酚溶液,0.1 mL酶制劑。然后在420 nm波長處測定2 min內(nèi)光密度隨時間的增長曲線,每隔10 s記錄1次,從直線的斜率求得酶活力。酶活力單位U定義為每mg蛋白每10 s催化底物氧化光密度增加0.001為1個活力單位。每組試驗均重復3次。

1.4.2 蛋白質(zhì)含量的測定

蛋白質(zhì)含量的測定采用G-250考馬斯亮藍法[18]進行。

1.4.3 不同pH反應體系對酚氧化酶活力及穩(wěn)定性的影響

分別以pH 6.1、6.5、6.8和7.0的勻漿緩沖液提取的斜紋夜蛾酚氧化酶作為酶源,測定PO在不同pH環(huán)境中的活性。測活體系pH設置為4.6、5.0、5.4、5.8、6.1、6.4、6.5、6.7、6.8、7.0、7.3、7.6、7.9,其中pH 4.6、5.0、5.4采用檸檬酸緩沖液(以0.1 mol/L檸檬酸 + 0.02 mol/L Na2HPO4制備),其他pH采用磷酸緩沖液(以0.2 mol/L NaH2PO4+0.2 mol/L Na2HPO4制備),以終濃度為10 mmol/L鄰苯二酚為底物,測定斜紋夜蛾酚氧化酶的最適pH。

分別吸取0.3 mL酶液(pH 7.0緩沖液提取),分別加入4.2 mL pH為5.8、6.1、6.4、6.5、6.7、6.8、7.0、7.3、7.6、7.9的緩沖液中,冰浴30、60、90 min后取出1.5 mL,加入1.5 mL終濃度10 mmol/L的鄰苯二酚,測定PO的殘留活性。以未曾與緩沖液冰浴、包含對應pH的測活體系的酶活力作為對照,其活力定義為100%,各pH處理的殘留活性與對照比較,求得相對活性,根據(jù)活性降低的程度確定PO在不同pH緩沖液中的穩(wěn)定性。

1.4.4 溫度對酚氧化酶活力及穩(wěn)定性的影響

將不含酶液的測活體系分別置于20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃水浴中保溫10 min,然后加入0.1 mL酶液,立即測定酶活力,根據(jù)活力的大小確定最適溫度。

再將0.3 mL酶液分別放置在上述不同溫度的水浴中保溫90 min,每隔30 min取出一次酶液(0.1 mL),以終濃度10 mmol/L鄰苯二酚為底物,測定PO的殘留活性。以最適溫度下測定的PO活力作為對照,其活力定義為100%,各溫度處理后的殘留活性與對照比較,求得相對活性,根據(jù)活性降低程度確定PO對溫度的穩(wěn)定性。

1.4.5 底物濃度對酚氧化酶酶促反應速率的影響

將1.4 mL、pH 7.0的磷酸緩沖液和0.1 mL酶液加入終濃度分別為1.0、1.25、2.5、5、10、15、20、25、30 mmol/L的鄰苯二酚中,測定不同底物濃度下的酶促反應速率,以酶促反應速率對底物濃度作圖,得酶促反應速率與底物濃度的關系。

1.4.6 動力學特征參數(shù)的測定

以鄰苯二酚為底物,在溫度30 ℃,pH 7.0、0.2 mol/L磷酸緩沖液測活體系中,設定底物終濃度分別為0.8、1.2、1.6、2.4、3.2 mmol/L,加入0.1 mL酶液,測定酶促反應的初速度(Vo),采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法作圖,求出該酶催化底物氧化的米氏常數(shù)(Km)和最大速度(Vm)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行單因素方差分析,計算標準誤(standard error,SE)后,在圖中以平均值±SE來表示試驗數(shù)據(jù),顯著水平0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH反應體系對酶活力及穩(wěn)定性的影響

以鄰苯二酚為底物,分別測定了用pH 6.1、6.5、6.8和7.0的磷酸緩沖液提取的斜紋夜蛾酚氧化酶的活性。結(jié)果表明：不同pH緩沖液提取對酶的活力有明顯的影響(圖1),pH 6.1緩沖液提取的酶活力最低,pH 7.0提取的酶活力最高,pH 6.5和6.8緩沖液提取的酶活力相近,因而在提取PO時宜采用pH 7.0的磷酸緩沖液。試驗表明,4種緩沖液提取的酶具有相同的酶活變化趨勢(圖1)：pH在4.6～6.7之間,酚氧化酶活性隨pH升高而增加;pH大于7時,酶活性隨pH升高下降,且下降的速率明顯高于上升的速率;不同pH的磷酸緩沖液提取的斜紋夜蛾酚氧化酶的最適pH均在6.7～7.0之間,其中以pH 7.0緩沖液提取的酶的活性最高。

以pH 7.0提取的斜紋夜蛾酚氧化酶進行穩(wěn)定性試驗,結(jié)果表明：在pH 6.8時,酶活力降低的幅度最小,穩(wěn)定性最好;同一pH處理下,隨處理時間的延長,酶的活性逐漸降低(圖2)。

圖1 pH對不同酸堿度緩沖液提取的斜紋夜蛾幼蟲酚氧化酶活力的影響Fig.1 Effects of pH on the activity of phenoloxidase extracted with different pH buffers from Spodoptera litura larvae

圖2 pH對斜紋夜蛾幼蟲酚氧化酶穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effects of pH on the stability of phenoloxidase from Spodoptera litura larvae

2.2 溫度對酚氧化酶活力及穩(wěn)定性的影響

由圖3可以看出,斜紋夜蛾幼蟲酚氧化酶活性受溫度影響比較大。以鄰苯二酚為底物,在20～30 ℃之間,酚氧化酶活性隨溫度的升高而增加;在30～60 ℃之間,酶活性隨溫度的升高而降低;斜紋夜蛾幼蟲酚氧化酶的最適溫度為30 ℃。穩(wěn)定性試驗表明：在20～35 ℃之間,酚氧化酶的穩(wěn)定性較好,30 ℃時酶的活性保持在最高;當溫度大于50 ℃時酶的活性迅速降低：如在55 ℃時保溫30 min,酶活力僅為原活力的27.7%,保溫60 min,酶活力僅為原活力的13.4%;同一溫度處理下,隨處理時間的延長,酶的活性有逐漸降低的趨勢(圖4)。

圖3 溫度對斜紋夜蛾幼蟲酚氧化酶活力的影響Fig.3 Effects of temperature on the activity of phenoloxidase from Spodoptera litura larvae

圖4 溫度對斜紋夜蛾幼蟲酚氧化酶穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effects of temperature on the stability of phenoloxidase from Spodoptera litura larvae

2.3 底物濃度對酚氧化酶酶促反應速率的影響

在3 mL的測活體系中,當酶含量為0.1 mL時,改變底物鄰苯二酚的濃度,可以獲得不同的酶促反應速率。結(jié)果表明：當?shù)孜餄舛仍?～10 mmol/L之間時,酶促反應隨底物濃度的增加而加快,且增加幅度基本成正比關系;當?shù)孜餄舛却笥?0 mmol/L時,隨底物濃度的增加,酶促反應速率不再增加,而趨于穩(wěn)定的狀態(tài);當?shù)孜餄舛葹?0 mmol/L時,酶促反應最快(圖5)。

2.4 動力學特征參數(shù)的測定

在3 mL的測活體系中,當酶含量為0.1 mL,溫度30 ℃,pH 7.0時,以鄰苯二酚為底物,測定斜紋夜蛾酚氧化酶的動力學特征參數(shù),可知其米氏常數(shù)Km為7.980 mmol/L,最大反應速度Vm為204.082ΔA/mg·10 s (圖6)。

圖5 鄰苯二酚對斜紋夜蛾幼蟲酚氧化酶活力的影響Fig.5 Effects of catechol concentration on the activity of phenoloxidase from Spodoptera litura larvae

圖6 斜紋夜蛾酚氧化酶雙倒數(shù)曲線Fig.6 Lineweaver-Burk plot for the determination of Kmof phenoloxidase from Spodoptera litura larvae

3 討論

本試驗以鄰苯二酚為底物,研究了斜紋夜蛾幼蟲酚氧化酶的酶學特性。結(jié)果表明,斜紋夜蛾幼蟲酚氧化酶的最適pH為6.7～7.0,在pH 6.8時,穩(wěn)定性最好,此研究結(jié)果與焦艷艷等報道的斜紋夜蛾酚氧化酶最適pH 6.5[19],舞毒蛾酚氧化酶最適pH 6.5[20],桑尺蠖最適pH 7.0[21]有一定差異。由于昆蟲種類的不同,飼養(yǎng)方式的不同,昆蟲取食食物的不同,使得體內(nèi)的酚氧化酶的性質(zhì)存在一定差異。酚氧化酶是一種含銅酶,活性中心具有雙核銅中心結(jié)構(gòu),兩個銅離子之間通過氧原子結(jié)合,形成相應的電子通路,活性中心含有許多酸性或堿性的氨基酸側(cè)鏈基團,pH的改變能影響酶活性中心上必須基團的解離程度,直接影響到酶和底物的親和力,進而影響酶的活性[22]。

斜紋夜蛾酚氧化酶的最適溫度為30 ℃,在20～35 ℃之間,酚氧化酶的穩(wěn)定性較好,當溫度大于50 ℃時酶的活性迅速降低,如在55 ℃時保溫30 min,酶活力僅為原活力的27.7%,保溫60 min,酶活力僅為原活力的13.4%,保溫90 min后酶基本失活,說明斜紋夜蛾酚氧化酶的熱穩(wěn)定性比較差。酶本身也是一種蛋白質(zhì),較高的溫度會對酶蛋白的三維結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性造成一定的破壞,甚至使其變性失活,進而引起酶活性的迅速降低。不同來源的酚氧化酶之間也存在一定的差異。

以鄰苯二酚為底物,測得的不同底物濃度與酶促反應的關系,當?shù)孜餄舛仍?～10 mmol/L之間時,酶促反應增加與底物濃度的增加量成正相關,超過10 mmol/L時,隨底物濃度的繼續(xù)增加,酶促反應不再增加而趨于平衡。在反應過程中,酶的量為定值,起始時底物濃度較低,酶促反應速度與底物濃度成正比,而當?shù)孜餄舛鹊竭_一定程度,使得所有的酶分子和底物分子結(jié)合生成中間產(chǎn)物,酶促反應達到最大值,即使再增加底物的濃度,由于沒有足夠的酶再去結(jié)合底物,酶促反應的速度也就不會再增加。

以鄰苯二酚為底物,測得斜紋夜蛾幼蟲酚氧化酶的米氏常數(shù)Km為8.5 mmol/L,Km值反映了相關酶與底物的親和能力。張永亮等報道：桑尺蠖酚氧化酶與L-多巴、鄰苯二酚和焦性沒食子酸作用的Km值分別為4.30、6.82和9.64 mmol/L,表明該酶對3種底物的親和能力存在差異,其中,對L-多巴的親和能力最強,其次為鄰苯二酚,而對焦性沒食子酸的親和力最低[21];趙燕等也曾報道,舞毒蛾酚氧化酶與L-多巴、鄰苯二酚和焦性沒食子酸作用的Km值分別為3.19、10.74和19.26 mmol/L[20],說明其對三種底物的親和能力強弱趨勢與桑尺蠖相似。但不同昆蟲的酚氧化酶與同一底物的親和能力存在差異,即使在同一種昆蟲中,不同部位的酚氧化酶與同一底物的親和能力也存在差異,劉守柱等測得黃粉蟲血淋巴源和體壁源酚氧化酶與L-多巴作用的Km值分別為1.176和0.881 mmol/L,表明黃粉蟲體壁源酚氧化酶與L-多巴的親和力大于血淋巴源酚氧化酶的親和力[23];Aso等也報道過煙草天蛾體壁和血淋巴中的酚氧化酶對同一底物具有不同的Km值[24]。我們認為酚氧化酶與底物表現(xiàn)的不同親和能力與許多因素有關：一方面,來源不同的酚氧化酶的活性中心上連接的氨基酸側(cè)鏈基團可能存在一定的差異,在酶蛋白形成過程中螺旋化、折疊化的程度也不完全相同、造成酶蛋白結(jié)構(gòu)存在一定的差異;另一方面,不同來源的酚氧化酶發(fā)揮其催化功能所需的條件不同,都具有各自的最適環(huán)境,這也是不同昆蟲能夠適應不同環(huán)境的一個因素。

酚氧化酶在昆蟲體內(nèi)是一種重要的免疫因子,在防御反應中具有重要的作用,同時能促進傷口的愈合,參與表皮的鞣化、硬化和黑化,對昆蟲正常的生長發(fā)育具有不可替代的重要作用,因而研究不同昆蟲酚氧化酶的酶學特性,深入了解其生理功能,對于篩選和開發(fā)以酚氧化酶為靶標的新型害蟲控制劑,探索新的無公害害蟲治理方法具有重要的科學意義。在此研究基礎之上,我們將進一步進行植物源抑制劑的篩選和抑制機理研究。

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(責任編輯：田 喆)

Characteristics of phenoloxidase fromSpodopteralitura

Xu Guangzeng, Li Wei, Wang Xinhong, Liu Shouzhu, Wang Guiqing

(College of Agriculture, Liaocheng University, Liaocheng 252059, China)

The properties of phenoloxidase (PO) fromSpodopteralitura(Fabricius) were determined with catechol as substrate. The results showed that the optimum pH for PO fromS.liturawas 6.7-7.0, and the enzyme had the maximum stability at pH 6.8. PO showed the highest activity at 30 ℃, while it had the best thermal stability at 20-35 ℃. When the amount of enzyme was limited to 0.1 mL in a total of 3 mL assay mixture, the reaction velocity increased with the concentration of substrate, and when the final concentration of catechol was 10 mmol/L, the velocity reached the highest, and then kept constant; theKmandVmvalues were 7.980 mmol/L and 204.082ΔA/mg·10 s, respectively, with catechol as substrate.

Spodopteralitura; phenoloxidase; enzyme characteristics; stability; enzyme activity

2014-04-18

2014-05-29

聊城大學博士科研啟動基金(31805)；聊城大學“園藝植物病蟲害控制技術(shù)研究”重點建設項目

S 433.4

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.03.009

* 通信作者 E-mail:liushouzhu@lcu.edu.cn