羅 偉，周云龍，孫振毅，馬堅(jiān)妹

（1山東省龍口市中醫(yī)院，山東龍口265701；2大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧大連116000）

坐骨神經(jīng)損傷端端吻合術(shù)后配合川穹嗪注射液治療的實(shí)驗(yàn)研究

羅 偉1，周云龍2，孫振毅2，馬堅(jiān)妹2

（1山東省龍口市中醫(yī)院，山東龍口265701；2大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧大連116000）

目的：探討坐骨神經(jīng)損傷端端吻合術(shù)后配合川穹嗪注射液治療的實(shí)驗(yàn)效果．方法：選取健康SD大鼠12只，制備大鼠左側(cè)坐骨神經(jīng)切斷后端端吻合模型．實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為兩組，每組6只，給藥組：腹腔注射川穹嗪注射液，0．3 mg／d，共4周；對照組注射同體積的生理鹽水．術(shù)后第1～4周分別進(jìn)行行為學(xué)分析及坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（SFI）測定，術(shù)后第4周檢測小腿三頭肌濕重，并進(jìn)一步截取吻合近側(cè)段和遠(yuǎn)側(cè)段的坐骨神經(jīng)，利用免疫組化MBP髓鞘染色方法，采用Image J軟件對吻合近側(cè)段和遠(yuǎn)側(cè)段陽性信號灰度值進(jìn)行比較分析，以觀察神經(jīng)再生情況．結(jié)果：第4周末，給藥組有部分個(gè)體足跡變短，對照組仍有個(gè)別自噬發(fā)生，兩組SFI評分比較具有顯著性差異（P＜0．05）；術(shù)后4周給藥組小腿三頭肌殘存率明顯高于對照組，具有顯著性差異（P＜0．05）；給藥組和對照組吻合口遠(yuǎn)側(cè)段和近側(cè)段MBP信號灰度值的比值比較無顯著差異（P＞0．05）．結(jié)論：川穹嗪注射液對周圍神經(jīng)損傷端端吻合術(shù)后恢復(fù)具有一定的促進(jìn)作用．

坐骨神經(jīng)損傷；端端吻合術(shù)；川穹嗪注射液

0 引言

周圍神經(jīng)損傷是常見的創(chuàng)傷并發(fā)癥，具有病程長、對患者健康損害大、治療困難等特點(diǎn)．周圍神經(jīng)損傷后常用的手術(shù)方式有端端吻合、端側(cè)吻合、神經(jīng)移植等，端端吻合術(shù)為周圍神經(jīng)損傷修復(fù)的金標(biāo)準(zhǔn)．中醫(yī)藥在治療周圍神經(jīng)損傷方面也取得了一定的成績，川穹嗪注射液可以抗血小板凝聚和解聚已凝集的血小板，抗凝血，抗血酸形成及溶解血栓，擴(kuò)張小動脈和增加心肌收縮率［1］．另外，川芎嗪可以降低血液粘稠度，減少血漿纖維蛋白原，改善血液高凝狀態(tài)，增加心腦腎等重要器官的血流量作用［2］．本研究利用大鼠制作單側(cè)坐骨神經(jīng)切斷端端吻合術(shù)模型，對比分析川穹嗪治療組和對照組行為學(xué)恢復(fù)過程、坐骨神經(jīng)評分、小腿三頭肌濕重和軸突再生情況，探討川穹嗪在促進(jìn)外周神經(jīng)損傷后再生中的作用．

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)儀器 CM3050冰凍切片機(jī)（德國LEI- CA）；Nikon 80i圖像分析儀（日本Nikon）；BT-100B數(shù)顯恒流泵（上海青浦西儀器廠）；FA2004電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；PHS-3C型數(shù)字式pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；MS-3 basic漩渦混合器（德國IKA）；RCT basic磁力加熱攪拌器（德國IKA）；LX-100手掌型離心機(jī)（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；SIM-F140AY65型制冰機(jī)（日本SANYO）；電熱恒溫干燥箱、SHZ-C型水浴恒溫振蕩器（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；通風(fēng)柜（寧美加力有限公司）；MINI MR型攪拌器（德國IKA）．

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 健康成年Sprague-Dawley大鼠，性別隨機(jī)，體質(zhì)量200～220 g（由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供），共12只，大鼠稱重后隨機(jī)分配為兩組：給藥組：單側(cè)坐骨神經(jīng)切斷行端端吻合術(shù)后使用川穹嗪治療；對照組：單側(cè)坐骨神經(jīng)切斷行端端吻合術(shù)后使用等量生理鹽水腹腔內(nèi)．手術(shù)均在左側(cè)后肢進(jìn)行，右側(cè)后肢作為健康空白對照．

1．2．2 手術(shù)步驟 大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后取俯臥位，常規(guī)備皮、消毒、固定四肢．取左側(cè)股后斜切口，切開皮膚，于肌肉深面用小號眼科剪沿肌肉方向鈍性分離暴露左側(cè)坐骨神經(jīng)，在10倍顯微鏡下于坐骨神經(jīng)距梨狀肌下緣1 cm處用顯微剪剪斷坐骨神經(jīng)，以神經(jīng)表面營養(yǎng)血管為解剖標(biāo)志對位，即刻采用9-0無創(chuàng)尼龍縫合線外膜縫合4針，盡可能地保證斷端對合整齊、縫線打結(jié)松緊度一致．在神經(jīng)吻合處周圍組織縫合一針，保留縫合線作為吻合處標(biāo)記，以備二次取用坐骨神經(jīng)，縫合傷口．術(shù)后肢體不固定．術(shù)后大鼠給予保暖直至麻醉蘇醒．以上手術(shù)操作均在無菌條件下進(jìn)行，大鼠均未給予抗生素治療．

1．2．3 給藥方法和劑量 給藥組自術(shù)后第1日起，根據(jù)大鼠體重與人體比例，每天腹腔注射以2 mL蒸餾水稀釋的鹽酸川穹嗪約0．3 mg，每日上午一次，術(shù)后連續(xù)給藥4周；對照組使用生理鹽水替代．

1．3 觀察指標(biāo)

1．3．1 行為學(xué)分析

1．3．1．1 大體觀察情況 于術(shù)后每日給藥時(shí)觀察大鼠傷口愈合情況，下肢活動情況，肢體末端有無破潰，傷側(cè)足的自噬情況，對刺激的反應(yīng)情況．

1．3．1．2 坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（SFI）測定 所有動物的坐骨神經(jīng)功能指數(shù)在術(shù)后7、14、21、28 d進(jìn)行測定．坐骨神經(jīng)功能指數(shù)SFI＝0為正常，-100為完全損傷，測量足跡給藥組與對照組同一天進(jìn)行，每次每只大鼠測量6次，選取最清晰3次足跡作為統(tǒng)計(jì)資料．傷側(cè)以爪背拖行者及足跡無法辨認(rèn)者，SFI記為-100．

1．3．2 小腿三頭肌濕重 大鼠給藥4周后，水合氯醛過量麻醉處死大鼠．手術(shù)切開皮膚、去除皮下組織，顯露兩側(cè)小腿三頭肌全長，自肌肉近側(cè)切開，完整剝離雙側(cè)坐骨神經(jīng)，于腱止點(diǎn)處完整取下小腿三頭肌，立即用電子天平測定肌濕重、記錄．用手術(shù)側(cè)肌肉濕重與正常側(cè)肌肉濕重之比表示肌肉殘存率，即殘存率＝術(shù)側(cè)腓腸肌濕重／正常側(cè)腓腸肌濕重×100%．給藥組與對照組同一天進(jìn)行取材，肌肉切取后稱重3次，取3次平均值作為數(shù)據(jù)記錄．

1．3．3 神經(jīng)再生 體式顯微鏡下將大鼠左側(cè)坐骨神經(jīng)從周圍組織中分離，僅保留神經(jīng)外膜，以手術(shù)所留縫合線頭為標(biāo)志確定坐骨神經(jīng)吻合口，分別在距吻合部位的近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)端各1．0 cm處切取坐骨神經(jīng)，切取段約長5 mm，每段神經(jīng)標(biāo)記近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)端，將大鼠皮膚做縫合后統(tǒng)一收集銷毀．取上述兩段坐骨神經(jīng)干，于4%多聚甲醛溶液中后固定過夜，20%DEPC蔗糖水內(nèi)置換過夜后，OCT包埋，神經(jīng)組織采用連續(xù)冰凍矢狀切片，片厚16 μm，每段神經(jīng)選取3張近中間部分的完整切片用于免疫組織化學(xué)染色．免疫組化染色在切片中間部位選取3個(gè)40倍視野拍照，利用免疫組化MBP髓鞘染色方法，采用ImageJ軟件對吻合近側(cè)段和遠(yuǎn)側(cè)段陽性信號灰度值行進(jìn)比較分析，以觀察神經(jīng)再生情況．

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11．5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用±s表示，采用配對比較的t檢驗(yàn)，P＜0．05作為統(tǒng)計(jì)結(jié)果有顯著性意義的判定標(biāo)準(zhǔn)．

2 結(jié)果

2．1 行為學(xué)分析

2．1．1 一般觀察 大鼠手術(shù)后第1日即出現(xiàn)顯著的坐骨神經(jīng)功能喪失的表現(xiàn)，可見受損側(cè)腳印明顯變長，受損側(cè)后腿完全麻痹而用后爪背行走的拖行步態(tài)．自第3日發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)左足自噬情況．術(shù)后1、2、3周，手術(shù)側(cè)足趾、足跟出現(xiàn)紅腫、潰瘍等失神經(jīng)表現(xiàn)，給藥組與對照組基本相同．自第4周開始，給藥組大鼠自噬及潰瘍情況有所減輕，活動增加，足印變短，給藥組已無自噬情況，對照組仍有個(gè)別自噬發(fā)生．

2．1．2 坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（SFI） 在術(shù)后第1、2、3周末有明顯的坐骨神經(jīng)功能喪失表現(xiàn)，因大鼠患足無法足掌觸地行走致傷足足印無法測出，故給藥組和對照組SFI分?jǐn)?shù)均為-100，兩組無差異．第4周末，給藥組有部分個(gè)體足跡變短，SFI評分為（-44．4± 16．3）分，對照組仍有個(gè)別自噬發(fā)生，說明動物感覺功能尚未恢復(fù)，SFI評分為（-99．9±8．1）分．經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩組間比較具有顯著性差異（P＜0．05）．

2．2 小腿三頭肌濕重 術(shù)后4周給藥組小腿三頭肌殘存率為（0．72±0．03）%，鹽水對照組為（0．67± 0．05）%，兩組間具有顯著性差異（P＜0．05）．

2．3 神經(jīng)纖維恢復(fù)情況 術(shù)后4周，對吻合口近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)段坐骨神經(jīng)行MBP免疫組化髓鞘染色．結(jié)果可見，無論是對照組還是給藥組，其近側(cè)段髓鞘均均勻一致，染色致密（圖1A和1B）．而在遠(yuǎn)側(cè)段，對照組僅見少量MBP陽性信號（圖1D），給藥組（圖1C）雖然MBP信號較比近側(cè)段稀疏，但是優(yōu)于對照組（圖1D）．為了解成功再生并通過吻合口的神經(jīng)纖維數(shù)量，我們進(jìn)一步將給藥組和對照組吻合口遠(yuǎn)側(cè)段和近側(cè)段MBP信號灰度值的比值進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示給藥組為（0．97±0．02），對照組為（0．96±0．01）．給藥組優(yōu)于對照組，但無顯著性差異（P＞0．05）．

圖1 免疫組化染色大鼠坐骨神經(jīng)髓鞘丟失情況

3 討論

周圍神經(jīng)損傷是臨床上比較常見的創(chuàng)傷并發(fā)癥，雖然有多種藥物及物理治療方法，但術(shù)后神經(jīng)再生速度仍舊緩慢．除手術(shù)吻合外尋找新的藥物治療方法，有效提高神經(jīng)再生速度，對周圍神經(jīng)損傷的臨床治療具有極其重要的意義［3］．目前結(jié)合神經(jīng)吻合術(shù)后使用的臨床藥物有西藥、中藥和中藥復(fù)方等［4］．中藥提取物作為一種新的研究方向，異軍突起，具有效果確切、價(jià)格低廉、臨床易推廣等特點(diǎn)［5］．

川穹在中醫(yī)中被稱為血中之氣藥，具有活血行氣、消散淤血、祛風(fēng)止痛之功效［6］，其主要活性成分為川穹嗪，已有研究表明，川穹嗪具有活血化瘀，抗血小板凝集，擴(kuò)張小動脈，改善微循環(huán)，抗氧化，拮抗鈣離子及抗纖維化等作用［7］．川穹嗪作用機(jī)制比較復(fù)雜，目前在臨床上主要應(yīng)用于治療和預(yù)防各種血管性疾病，效果較好［8］．近年來，關(guān)于川穹嗪在神經(jīng)系統(tǒng)的損傷保護(hù)尤其是缺血／再灌注損傷中的保護(hù)作用及其機(jī)制逐漸成為熱點(diǎn)問題而被廣泛研究．研究表明，川穹嗪對神經(jīng)系統(tǒng)缺血損傷保護(hù)治療的作用機(jī)制主要集中以下幾個(gè)方面：①改善腦血流；②抗氧化作用；③抗炎作用；④抗神經(jīng)元凋亡作用［9-10］．

本研究發(fā)現(xiàn)川穹嗪注射液對周圍神經(jīng)損傷端端吻合術(shù)后再生有一定的促進(jìn)作用．由于坐骨神經(jīng)完全切斷端端吻合后的恢復(fù)相對緩慢，并且模型所做吻合為神經(jīng)外膜吻合，即對包裹在神經(jīng)最外面的疏松結(jié)締組織進(jìn)行縫合，并沒有進(jìn)行神經(jīng)束膜的吻合，因此恢復(fù)較慢，表現(xiàn)在最初的術(shù)后3周內(nèi)，無論是對照組還是給藥組SFI均為-100．術(shù)后4周開始，從行為學(xué)分析來看，給藥組大鼠開始恢復(fù)，已無自噬，并且潰瘍情況也有所減輕，活動增加，足印變短，而對照組仍有個(gè)別自噬發(fā)生，說明其感覺功能尚未恢復(fù)．從小腿三頭肌殘存率來看，術(shù)后4周給藥組與對照組比具有顯著性差異，說明在術(shù)后4周，給藥組肌肉的萎縮程度小于對照組．根據(jù)以上結(jié)果，川穹嗪的作用似乎并不是直接作用于神經(jīng)再生，而是通過保護(hù)軸突，增強(qiáng)雪旺細(xì)胞活性，促進(jìn)吻合口周圍組織的血運(yùn)，改善微循環(huán)，保護(hù)運(yùn)動終板、緩解感覺終器的退變和肌肉萎縮起作用．從髓鞘免疫組化染色數(shù)據(jù)分析來看，給藥組與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這一結(jié)果也在一定程度上印證了我們的猜測．以上結(jié)果表明，川穹嗪注射液對周圍神經(jīng)損傷端端吻合術(shù)后功能恢復(fù)具有一定的促進(jìn)作用，其作用可能是通過促進(jìn)血管內(nèi)皮的修復(fù)，擴(kuò)張小動脈，改善局部的微循環(huán)來實(shí)現(xiàn)的．

綜上所述，川穹嗪注射液對周圍神經(jīng)損傷端端吻合術(shù)后恢復(fù)具有一定的促進(jìn)作用．

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R651．3

A

2095-6894（2015）05-006-03

2015-03-22；接受日期：2015-04-08

羅 偉．碩士，主治醫(yī)師．Tel：0535-8549708 E-mail：lwszwk＠163．com