趙鵬，陳俊卯，曹文斌，楊光華，虞向陽，劉春輝，鄭陽

TNF-α在結(jié)腸癌細胞侵襲和遷移中的作用探討

趙鵬，陳俊卯，曹文斌，楊光華，虞向陽，劉春輝，鄭陽

目的探討腫瘤壞死因子（TNF）-α對腫瘤相關(guān)鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白（TROP）-2表達的影響及其對細胞侵襲和遷移能力的影響。方法以0、10、20、30、50、100、200 μg/L的TNF-α處理人結(jié)腸癌HCT-116細胞，采用噻唑藍（MTT）實驗檢測細胞存活率。采用Western blot檢測TROP-2的表達量。采用劃痕實驗和Transwell實驗檢測20 μg/L TNF-α處理前后細胞侵襲和遷移能力。借助脂質(zhì)體Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染TROP-2 siRNA，實時熒光定量PCR和Western blot驗證轉(zhuǎn)染后TROP-2的mRNA和蛋白水平。劃痕實驗和Transwell實驗再次檢測TNF-α對轉(zhuǎn)染TROP-2 siRNA細胞的侵襲和遷移能力的影響。結(jié)果0、10、20、30、50 μg/L的TNF-α處理24 h和48 h時細胞存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。100、200 μg/L與0 μg/L比較，細胞存活率下降（P＜0.05）。與TNF-α濃度為0 μg/L比較，10、20、30、50 μg/L時TROP-2的表達量均升高，20 μg/L時TROP-2的表達量最高（P＜0.05）；而TNF-α濃度為100、200 μg/L時TROP-2的表達量下降（P＜0.05）。劃痕實驗和Transwell實驗中，TNF-α組24 h時的細胞劃痕愈合率和穿膜細胞數(shù)均較對照組增加（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染TROP-2 siRNA后siRNA組中TROP-2的mRNA和蛋白水平均低于正常對照組和陰性對照組（P＜0.05）。此外，siRNA組24 h時的細胞劃痕愈合率和穿膜細胞數(shù)均較正常對照組下降（P＜0.05）。結(jié)論低濃度炎癥因子TNF-α可能通過上調(diào)TROP-2的表達來促進結(jié)腸癌HCT-116細胞的侵襲和遷移。

結(jié)腸腫瘤；腫瘤壞死因子α；腫瘤侵潤；細胞運動；腫瘤相關(guān)鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白-2

慢性炎癥在腫瘤的發(fā)生和進展過程中起重要作用。研究認為，腫瘤壞死因子（TNF）-α主要由腫瘤相關(guān)巨噬細胞分泌，可以啟動慢性炎癥［1］。最新的研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α具有雙重作用，大劑量的TNF-α可以誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，殺傷腫瘤細胞；而持續(xù)低劑量的TNF-α可以作為炎癥因子，促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［2］。研究認為，將腫瘤細胞與巨噬細胞共培養(yǎng)后，腫瘤細胞的侵襲能力增強，主要是由巨噬細胞分泌的TNF-α介導(dǎo)［3］。目前TNF-α促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的機制尚不清楚。腫瘤相關(guān)鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白（TROP）-2在多種人類上皮源性腫瘤中均存在高表達［4］；而其在正常組織中不表達或低表達，可能與腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［5］。本研究旨在探討TNF-α對結(jié)腸癌HCT-116細胞中TROP-2表達的調(diào)控及其對結(jié)腸癌細胞侵襲和遷移能力的影響，分析炎癥促進結(jié)腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的可能機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料人類結(jié)腸癌細胞株HCT-116由河北醫(yī)科大學(xué)病理教研室申海濤教授惠贈，細胞凍存于液氮。鼠抗人TROP-2單克隆抗體購自美國Abcam公司，重組人TNF-α購自美國Sigma公司，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，McCoy’s 5A培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，TROP-2 siRNA和陰性對照siRNA購自上海拜沃生物技術(shù)有限公司，基底膜基質(zhì)Matrigel購自美國becton Dickinson公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG購自Cell Signaling Technology。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)人結(jié)腸癌HCT-116細胞采用McCoy’s 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)，使用前加入10%胎牛血清和1%雙抗，置入含5%CO2、37℃的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測不同濃度TNF-α對結(jié)腸癌細胞增殖的影響取對數(shù)生長期的HCT-116細胞，接種于96孔培養(yǎng)板，分別加入含不同的濃度TNF-α（0、10、20、30、50、100、200 μg/L）的培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h和48 h時，每孔中加MTT標記混合液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO，振蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定波長490 nm各孔吸光度值，參照文獻［6］計算細胞存活率，繪制曲線。

1.2.3 Western blot檢測TNF-α對結(jié)腸癌HCT-116細胞中TROP-2表達的影響取對數(shù)生長期的結(jié)腸癌HCT-116細胞，分別加入不同濃度的TNF-α（0、10、20、30、50、100、200 μg/L），作用24 h后，提取細胞總蛋白。蛋白定量后行SDSPAGE凝膠電泳，每孔上樣量為50 μg蛋白，電泳并轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，抗TROP-2一抗4℃孵育過夜。TBST漂洗3次，加山羊抗兔二抗室溫孵育2 h，增強化學(xué)發(fā)光法顯色。以β-tubulin為內(nèi)參。

1.2.4 細胞遷移（劃痕）實驗選取對數(shù)生長期的HCT-116細胞，接種于6孔培養(yǎng)板，融合度達80%時，用一次性100μL移液器槍尖在6孔板上劃出一條直線，用無菌PBS液洗去刮下的脫離細胞，更換無血清培養(yǎng)基。實驗中分設(shè)TNF-α組和對照組，每組設(shè)3個平行孔，實驗共重復(fù)3次。TNF-α組加入終濃度為20 μg/L的TNF-α，對照組加PBS代替TNF-α，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于劃痕后0 h、24 h給細胞拍照，隨機取5個不同位置測量細胞劃痕寬度，取其平均值，利用Image J 2.1圖像分析軟件計算劃痕愈合率。

1.2.5 細胞侵襲（Transwell）實驗選取對數(shù)生長期的HCT-116細胞，分設(shè)TNF-α組和對照組，TNF-α組Transwell上室中加入含20 μg/L TNF-α的單細胞懸液100μL，培養(yǎng)箱孵育24 h后用棉簽擦去Transwell上室面的細胞，下室面的細胞使用預(yù)冷甲醇4℃固定20～30 min，放入0.1%結(jié)晶紫溶液內(nèi)，37℃溫箱內(nèi)染色30 min，PBS液洗去多余染料，倒置顯微鏡（×200）下隨機讀取5個視野，計數(shù)下室面的細胞數(shù)，即為穿過小室的細胞數(shù)（穿膜細胞數(shù)），實驗共重復(fù)3次，取其平均數(shù)。

1.2.6 RNA干擾技術(shù)沉默TROP-2基因本部分實驗借助脂質(zhì)體Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染TROP-2 siRNA，沉默結(jié)腸癌HCT-116細胞中TROP-2基因，抑制TROP-2的表達。實驗共分3組：正常對照組、陰性對照組和siRNA組。TROP-2siNRA序列：上游5′-CGTGGACA ACGATGGCCTCTA-3′，下游5′-GGTACGCGAGGCACACGTAC-3′，產(chǎn)物片段大小160 bp。siRNA control序列：上游5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游5′-ACGUGACACG UUCGGAGAATT-3′，產(chǎn)物片段大小198 bp。β-actin序列：上游5′-CACGAAACTACCT TCAACTCC-3′，下游5′-CATACTCCTGCTTGCTGATC-3′，產(chǎn)物片段大小262 bp。按脂質(zhì)體Lipofectamine?2000說明書將TROP-2 siRNA和陰性對照siRNA進行轉(zhuǎn)染，48 h后進行后續(xù)實驗。

1.2.7 TROP-2 siRNA轉(zhuǎn)染后TROP-2的mRNA及蛋白水平的測定（1）正常對照組、陰性對照組和siRNA組中TROP-2的mRNA水平檢測。采用實時熒光定量PCR法，TROP-2 siRNA轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，提取細胞總RNA。取滅菌無RNA酶的EP管，首先配制MixⅠ（Total RNA 5μL，50μmol/L oligodt 0.5μL，Random primer 0.5μL，10 mmol/L dNTP Mix 1μL，DEPC-treated water 5μL）。把MixⅠ置于65℃溫浴中5 min，然后立即放入冰水中1 min。在MixⅠ里加入（5×First-Strand Buffer 4μL，0.1 mol/L Dtt 2μL，40 U/μL RNase OUT 1μL，Super ScripⅢRT 1μL，MixⅠ12μL），得到反應(yīng)體系MixⅡ共20μL。混勻后進行下一步反應(yīng)：5℃處理5 min；50℃處理60 min；70℃處理15 min；立即放到冰上。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)50℃30 min，PCR初始變性95℃2 min，40個循環(huán)，95℃10 s，60℃30 s，70℃延伸30 s。實驗中每個樣品重復(fù)3次，基因的相對表達量采用2-△△Ct表示。（2）正常對照組、陰性對照組和siRNA組中TROP-2水平的檢測，基本方法同1.2.3。

1.2.8 轉(zhuǎn)染TROP-2 siRNA對結(jié)腸癌HCT-116細胞遷移和侵襲能力的影響分設(shè)正常對照組和TROP-2 siRNA組，培養(yǎng)24 h，方法同1.2.1。采用劃痕和Transwell實驗檢測2組細胞的遷移和侵襲能力，方法同1.2.4和1.2.5。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，2組樣本均數(shù)比較采用t檢驗；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度TNF-α對結(jié)腸癌HCT-116細胞增殖的影響不同濃度TNF-α處理24 h和48 h時細胞存活率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），其中低濃度TNF-α（10、20、30、50 μg/L）處理24 h和48 h時細胞存活率與0 μg/L比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。高濃度TNF-α（100、200 μg/L）較0 μg/L存活率下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

Fig.1The proliferative change of HCT-116 cells with TNF-α treatment for 24 h or 48 h圖1 不同作用時間，不同濃度TNF-α對結(jié)腸癌HCT-116細胞存活率的影響

2.2 TNF-α對結(jié)腸癌HCT-116細胞TROP-2表達的影響不同濃度的TNF-α（0、10、20、30、50、100及200 μg/L）處理后結(jié)腸癌HCT-116細胞中TROP-2的相對表達量分別為1.12±0.31、1.83±0.28、2.16± 0.48、1.92±0.18、1.55±0.26、0.80±0.18及0.52±0.15（F=17.28，P＜0.05），其中低濃度（10、20、30及50 μg/L）TNF-α處理時，TROP-2的表達量較0 μg/L均升高，以濃度20 μg/L時TROP-2表達量最高；而高濃度（100、200 μg/L）TNF-α處理時TROP-2的表達量較0 μg/L下降（均P＜0.05），見圖2。

2.3 TNF-α對結(jié)腸癌HCT-116細胞遷移和侵襲能力的影響TNF-α組24 h時的劃痕愈合率高于對照組［（55.35±4.16）%vs（15.28±2.37）%，t=12.43，P＜ 0.01］，見圖3。TNF-α組中結(jié)腸癌HCT-116細胞的穿膜細胞數(shù)高于對照組［（237.2±28.4）個vs（85.8± 14.3）個，t=8.642，P＜0.05］，見圖4。

Fig.2The expression of TROP-2 in HCT-116 cells with addition of different concentration of TNF-α圖2 不同濃度TNF-α處理后結(jié)腸癌HCT-116細胞中TROP-2的表達情況

Fig.3The migratory capability of HCT-116 cells upon TNF-α treatment（×100）圖3 TNF-α對結(jié)腸癌HCT-116細胞遷移能力的影響（×100）

Fig.4The invasive capability of HCT-116 cells upon TNF-α treatment（Crystal violet，×200）圖4 TNF-α對結(jié)腸癌HCT-116細胞侵襲能力的影響（結(jié)晶紫染色，×200）

2.4 TROP-2 siRNA對HCT-116細胞TROP-2的mRNA和蛋白的影響siRNA組TROP-2的mRNA和TROP-2蛋白表達水平均低于陰性對照組和正常對照組（P＜0.05），見表1、圖5。

2.5 TNF-α對轉(zhuǎn)染TROP-2 siRNA的結(jié)腸癌HCT-116細胞遷移和侵襲能力的影響對照組24 h時的細胞劃痕愈合率（48.58±4.39）%高于TROP-2 siRNA組的（19.34±5.18）%（t=9.63，P＜0.01），見圖6。TROP-2 siRNA組的穿膜細胞數(shù)（106.4±17.6）個低于對照組的穿膜細胞數(shù)（266±25.4）個（t=22.64，P＜0.05），見圖7。

Tab.1Comparison of TROP-2 expression and transcription levels in three groups表1 3組中TROP-2的mRNA和蛋白表達水平的比較（n=3）

Tab.1Comparison of TROP-2 expression and transcription levels in three groups表1 3組中TROP-2的mRNA和蛋白表達水平的比較（n=3）

＊P＜0.05；a與siRNA組比較，P＜0.05

組別正常對照組陰性對照組s i R N A組F T R O P -2 m R N A 6 . 4 8 ± 1 . 2 4a4 . 9 3 ± 0 . 5 6a1 . 5 4 ± 0 . 2 8 1 5 . 6 2＊T R O P -2 1 . 3 2 ± 0 . 2 6a1 . 1 6 ± 0 . 1 5a0 . 5 5 ± 0 . 1 8 9 . 1 8＊

Fig.5The expression of TROP-2 protein in HCT-116 cells transfected with TROP-2siRNA圖5 轉(zhuǎn)染TROP-2 siRNA后HCT-116細胞中TROP-2的表達情況

Fig.6The migratory capability of HCT-116 cells upon TNF-α treatment after silencing TROP-2（×100）圖6 TNF-α對沉默TROP-2的結(jié)腸癌HCT-116細胞遷移能力的影響（×100）

3 討論

TROP-2是一種跨膜糖蛋白。最新研究表明，卵巢癌、結(jié)腸癌及膀胱癌等多種人類上皮源性腫瘤（如胃癌、胰腺癌等）中存在TROP-2的高表達，TROP-2與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其高表達往往與不良預(yù)后相關(guān)［7-8］。然而，腫瘤中TROP-2高表達的機制目前尚不清楚，揭示TROP-2高表達的機制有望為腫瘤的早期診斷和治療提供新方向。

目前，腫瘤炎癥微環(huán)境為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點。有學(xué)者把腫瘤相關(guān)性炎癥稱為腫瘤的第七種特征［9］。炎癥微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切，但有關(guān)其在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的具體機制仍不清楚。TNF-α是腫瘤炎癥微環(huán)境中的一種重要炎癥細胞因子，其促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的具體機制目前仍不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中TNF-α能夠激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1，上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子的表達，促進腫瘤新生血管的形成，從而促進腫瘤轉(zhuǎn)移［10］。TNF-α還能夠通過上調(diào)口腔癌細胞的基質(zhì)金屬蛋白酶的表達來促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［11］。Szlosarek等［12］研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α能夠通過調(diào)節(jié)CD44的表達來促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，筆者推測在結(jié)腸癌中炎癥因子TNF-α有可能通過上調(diào)TROP-2的表達，進而促進結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。本實驗旨在從細胞水平對這一假設(shè)進行驗證。

MTT實驗結(jié)果顯示，低濃度TNF-α（10、20、30、50 μg/L）處理24 h和48 h時細胞存活率與0 μg/L比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，高濃度TNF-α（100、200 μg/L）較0 μg/L存活率下降；Western blot實驗結(jié)果顯示，低濃度（10、20、30及50 μg/L）TNF-α處理時，TROP-2的表達量較0 μg/L均升高，以濃度20 μg/L時TROP-2表達量最高；而高濃度（100、200 μg/L）TNF-α處理時TROP-2的表達量較0 μg/L下降，證實了TNF-α對結(jié)腸癌細胞有雙重作用，低濃度TNF-α可以上調(diào)結(jié)腸癌細胞TROP-2的表達，而高濃度TNF-α可以下調(diào)TROP-2的表達，這與Colotta等［9］的研究相一致，考慮可能機制為高濃度TNF-α可以產(chǎn)生細胞毒性作用，抑制了結(jié)腸癌HCT-116細胞的增殖，導(dǎo)致細胞存活率下降，從而導(dǎo)致TROP-2表達下降。

Fig.7The invasive capability of HCT-116 cells upon TNF-α treatment after silencing TROP-2（Crystal violet，×200）圖7 TNF-α對沉默TROP-2的結(jié)腸癌HCT-116細胞侵襲能力的影響（結(jié)晶紫染色，×200）

細胞劃痕實驗和Transwell實驗結(jié)果顯示，給予低濃度（20 μg/L）TNF-α處理后結(jié)腸癌HCT-116細胞的劃痕愈合率較對照組升高，穿膜遷移細胞數(shù)亦增加，表明低濃度TNF-α增強了結(jié)腸癌HCT-116細胞的侵襲和遷移能力。為了進一步驗證低濃度TNF-α是否通過上調(diào)TROP-2的表達來促進結(jié)腸癌

細胞的侵襲和遷移，本實驗中又采用RNA干擾技術(shù)，轉(zhuǎn)染TROP-2 siRNA沉默TROP-2基因，從而抑制TROP-2的表達。實時熒光定量PCR和Western blot結(jié)果顯示，TROP-2 siRNA組TROP-2的mRNA及蛋白水平較對照組均降低，表明實驗轉(zhuǎn)染成功。用同樣濃度（20 μg/L）TNF-α處理TROP-2 siRNA組的HCT-116細胞，細胞劃痕及Transwell實驗結(jié)果顯示，與正常對照組相比，TROP-2 siRNA組的細胞劃痕愈合率和穿膜遷移細胞數(shù)均減少，表明沉默TROP-2基因，抑制TROP-2表達后，TNF-α則不能增強HCT-116細胞的侵襲和遷移能力，提示低濃度炎癥因子TNF-α是通過上調(diào)TROP-2的表達，進而增強結(jié)腸癌HCT-116細胞的侵襲和遷移能力的。

綜上所述，炎癥因子TNF-α通過上調(diào)腫瘤細胞中TROP-2的表達來促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，這為進一步研究結(jié)腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機制提供了理論基礎(chǔ)，也為結(jié)腸癌的臨床治療提供了新的靶點和理論依據(jù)。

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（2015-05-21收稿 2015-08-07修回）

（本文編輯 陸榮展）

Role of TNF-α in promoting migration and invasion of colon cancer cells

ZHAO Peng，CHEN Junmao，CAO Wenbin，YANG Guanghua，YU Xiangyang，LIU Chunhui，ZHENG Yang
Department of General Surgery，North China University of Science and Technology Affiliated Hospital，Tangshan 063000，China

ObjectiveTo explore the effect of TNF-α on expression of TROP-2 and to explore the role of TROP-2 in the metastasis and invasion of colon cancer HCT-116 cells.MethodsHCT-116 cells were cultured and treated with 0，10，20，30，50，100 and 200 μg/L TNF-α.Cell viability was assessed by MTT.The expression of TROP-2 was determined by western blot.The effects of 20 μg/L TNF-α on cell migration and invasion were investigated by wound healing assay and Transwell method.Small interfering RNA（siRNA）was used to knock down endogenous TROP-2 expression.The transcription and translation levels of TROP-2 were detected by qPCR and Western blot respectively.The migratory and invasive capability of HCT-116 cells transfected with TROP-2 siRNA were checked by wound healing assay and Transwell method respectively.ResultsThere is no significant change of cell viability between HCT-116 cells treated with 0，10，20，30 and 50 μg/L TNF-α，but cell viability of HCT-116 decreased significantly with treatment of 100 μg/L and 200 μg/L TNF-α.Low concentration of TNF-α（≤50 μg/L）led to increase of TROP-2 protein expression that peaks when 20 μg/L TNF-α was added.High concentration of TNF-α（100，200 μg/L）result in decrease of TROP-2 protein.TROP-2 siRNA significantly downregulated the expression of TROP-2 at both mRNA and protein levels in colon cancer HCT-116 cells.Compared with control group，silencing TROP-2 by TROP-2 siRNA inhibited the migratory and invasive capability of HCT-116 cells.Wound healing rate and the number of transwell cell both decreased in siRNA group compared with those of control group（P＜0.05）.ConclusionThe mechanism that low concentration of TNF-α promoted HCT-116 cells migration and invasion might be through up-regulating the expression of TROP-2.

colonic neoplasms；tumor necrosis factor-alpha；neoplasm invasiveness；cell movement；TROP-2

R735.3

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.12.007

河北唐山，華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院普外科（郵編063000）

趙鵬（1977），男，副主任醫(yī)師，博士，主要從事消化道腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究