孫紀(jì)三，張建軍，高偉，楊濤，郭慶軍，馬楠，王洪海，蔣文濤

肝細(xì)胞癌組織HBXIP和GRIM-19表達(dá)及意義的探討

孫紀(jì)三，張建軍，高偉，楊濤，郭慶軍，馬楠，王洪海，蔣文濤△

目的探討乙肝病毒X蛋白結(jié)合蛋白HBXIP和細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子GRIM-19在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及意義。方法收集42例肝細(xì)胞癌組織和28例正常肝臟組織，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)兩種組織中HBXIP和GRIM-19的表達(dá)。結(jié)果在肝細(xì)胞癌組織和正常肝臟組織中，HBXIP陽(yáng)性表達(dá)率分別為80.95%（34/42）和42.86%（12/28）；而GRIM-19陽(yáng)性表達(dá)率分別為40.48%（17/42）和75.00%（21/28），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。肝細(xì)胞癌組織中HBXIP的陽(yáng)性表達(dá)率在低、未分化和Ⅲ～Ⅳ期的表達(dá)水平高于高、中分化和Ⅰ～Ⅱ期組織；而GRIM-19的陽(yáng)性表達(dá)率與之相反，且無(wú)門(mén)脈癌栓組織中GRIM-19的陽(yáng)性表達(dá)率高于有門(mén)脈癌栓組織。HBXIP與GRIM-19表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.400，P＜0.01）。結(jié)論HBXIP和GRIM-19的異常表達(dá)可能與肝細(xì)胞癌的發(fā)生及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。

癌，肝細(xì)胞；腫瘤轉(zhuǎn)移；免疫組織化學(xué)；乙肝病毒X蛋白結(jié)合蛋白；GRIM-19

長(zhǎng)期的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染容易導(dǎo)致原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的發(fā)生［1］。研究表明，乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，參與肝癌的發(fā)生與發(fā)展［2］。乙型肝炎病毒X蛋白結(jié)合蛋白（hepatitis B virus X-interactingprotein，HBXIP）是由91個(gè)氨基酸組成的蛋白，具有重要的生物活性［3］；HBXIP可與HBx的C端特異性結(jié)合，降低HBx的活性［4］；而細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)基因19（genes associated with retinoid interferon induced mortality 19，GRIM-19）是一種調(diào)亡基因，受維甲酸和干擾素的共同誘導(dǎo)［5］。但HBXIP和GRIM-19在HCC中的表達(dá)、分布及兩者在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用尚鮮見(jiàn)報(bào)道。本文采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)人肝細(xì)胞癌組織中HBXIP和GRIM-19蛋白的表達(dá)，以探討HBXIP和GRIM-19在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)與腫瘤的生成、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源收集2011年1月—2013年9月天津市第一中心醫(yī)院接受HCC手術(shù)治療患者術(shù)后存檔的石蠟標(biāo)本42例，年齡31～73歲，平均（50.7±17.5）歲，均經(jīng)我院病理科確診，且病史資料完整，術(shù)前均未行放療、化療及生物劑治療。組織學(xué)分級(jí)按2003年國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）和美國(guó)腫瘤聯(lián)合會(huì)（AJCC）聯(lián)合制定的TNM分期法，高、中分化29例，低、未分化13例；TNM分期按2010年美國(guó)癌癥研究聯(lián)合會(huì)癌癥分期手冊(cè)第7版標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ～Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期27例；有門(mén)靜脈血栓14例，無(wú)門(mén)靜脈血栓28例。所有患者均有完整臨床資料。另取同時(shí)期正常肝臟存檔石蠟標(biāo)本28例。

1.2 主要試劑HBXIP鼠抗人抗體和GRIM-19鼠抗人抗體均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，工作濃度均為1∶200；SP-0023免疫組化試劑盒（美國(guó)ZYMED公司）；DAB顯色試劑盒（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司）。其他試劑均為分析純。

1.3 方法收集病理科登記的HCC患者及肝臟正常的患者的臨床資料與存檔肝臟石蠟標(biāo)本，統(tǒng)計(jì)HCC病因、甲胎蛋白（AFP）水平、腫瘤大小、門(mén)靜脈癌栓情況、組織分型、TMN分期等臨床病理學(xué)參數(shù)。每例蠟塊4μm厚連續(xù)切片3張，其中1張進(jìn)行HE染色，另2張進(jìn)行免疫組化染色。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水化，微波抗原修復(fù)15 min，3%H2O2室溫孵育。加封閉血清，滴加一抗，4℃過(guò)夜，滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30 min，DAB顯色。蘇木素復(fù)染2 min，鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定選用試劑盒中的陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS取代一抗作為陰性對(duì)照。HBXIP、GRIM-19表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，染色呈棕黃色視為陽(yáng)性。每張切片隨機(jī)讀取5個(gè)高倍視野（×200），每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，采用半定量積分法依據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分率判斷染色結(jié)果［6-7］。所有切片均由2位病理科醫(yī)師在雙盲情況下獨(dú)立觀察判斷，對(duì)判斷不一致的病例，共同進(jìn)行觀察后得出一致結(jié)論。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用例表示，樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.12 組肝臟組織中HBXIP的表達(dá)與分布HBXIP染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，在癌細(xì)胞中可見(jiàn)大量棕黃色染色，在正常肝細(xì)胞中呈弱陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖1。肝癌組織HBXIP的陽(yáng)性表達(dá)率高于正常肝組織（P＜0.01），見(jiàn)表1。

Fig.1The expression of HBXIP in normal liver tissues and in hepatocellular carcinoma（IHC，×200）圖1 HBXIP在正常肝臟組織和肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)（IHC，×200）

Tab.1The expression of HBXIP in normal liver tissues and in hepatocellular carcinoma表1 HBXIP在正常肝臟組織和肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)

2.22 組肝臟組織中GRIM-19的表達(dá)與分布GRIM-19染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，見(jiàn)圖2。在肝細(xì)胞癌組織的陽(yáng)性表達(dá)率低于正常肝組織（P＜0.01），見(jiàn)表2。

Fig.2The expression of GRIM-19 in normal liver tissues and in hepatocellular carcinoma（IHC，×200）圖2 GRIM-19在正常肝臟組織和肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)（IHC，×200）

2.3 HBXIP和GRIM-19在不同臨床特征下陽(yáng)性表達(dá)率比較HBXIP在低、未分化肝癌中的陽(yáng)性率明

顯高于高、中分化者，Ⅲ～Ⅳ期肝癌組織中HBXIP的陽(yáng)性表達(dá)率高于Ⅰ～Ⅱ期；而HBXIP在HCC病因、門(mén)靜脈栓塞情況、AFP水平、腫瘤大小等方面的陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。GRIM-19在高、中分化肝癌中的陽(yáng)性率高于低、未分化者；Ⅰ～Ⅱ期肝癌組織中HBXIP的陽(yáng)性表達(dá)率率高于Ⅲ～Ⅳ期；無(wú)門(mén)靜脈栓塞者的陽(yáng)性率高于有門(mén)靜脈栓塞者；而在HCC病因、AFP水平、腫瘤大小等方面陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表3。

Tab.2The expression of GRIM-19 in normal liver tissues and in hepatocellular carcinoma表2 GRIM-19在正常肝臟組織和肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)

Tab.3Correlation between expressions of HBXIP and GRIM-19 with pathological features in hepatocellular carcinoma表3 肝細(xì)胞癌中HBXIP與GRIM-19陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系例（%）

2.4 HBXIP和GRIM-19在肝細(xì)胞癌中表達(dá)的關(guān)系HBXIP和GRIM-19兩種蛋白在肝細(xì)胞癌中的陽(yáng)性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01），見(jiàn)表4。

Tab.4Relationship of HBXIP and GRIM-19 expression in hepatocellular carcinoma表4 HBXIP和GRIM-19在肝細(xì)胞癌中表達(dá)的關(guān)系（例）

3 討論

3.1 HBXIP在腫瘤中的作用HBXIP基因定位于人染色體1p13.3，其表達(dá)的蛋白首次于肝癌細(xì)胞株HepG2中被發(fā)現(xiàn)，為乙肝病毒編碼的蛋白HBx的相互作用的因子。研究發(fā)現(xiàn)，HBXIP為具有多功能的調(diào)節(jié)蛋白，可通過(guò)不同的分子途徑發(fā)揮調(diào)控作用［8］。HBXIP可與凋亡抑制因子survivin形成復(fù)合物，同時(shí)結(jié)合pro-caspase-9，使survivin通過(guò)細(xì)胞色素C介導(dǎo)的凋亡途徑抑制細(xì)胞凋亡，從而使得HBXIP對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，因此推測(cè)HBXIP與肝細(xì)胞癌的發(fā)生與發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)［9］。為了進(jìn)一步闡明其分子機(jī)制，王鳳澤等［4］通過(guò)基因共轉(zhuǎn)染將核因子（NF）-κB報(bào)告基因質(zhì)粒pNF-κB-Luc和HBXIP真核表達(dá)載體pcDNA3-hbxip導(dǎo)入人肝癌H7402細(xì)胞系中，進(jìn)行熒光素酶活性分析，研究顯示HBXIP可增加細(xì)胞核內(nèi)NF-κB蛋白水平，進(jìn)而發(fā)揮NF-κB促轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。因此，HBXIP可通過(guò)調(diào)控NF-κB信號(hào)途徑而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖；同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)HBXIP在乳腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)［10］，HBXIP通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子Spl激活Skp2的啟動(dòng)子活性［11］，上調(diào)S期激酶相關(guān)蛋白（Skp2）、乳腺腫瘤自身抗原（LMO4）的表達(dá)，而HBXIP通過(guò)上調(diào)Skp2、LMO4可促進(jìn)乳腺癌癌細(xì)胞的遷移［12］。

3.2 GRIM-19蛋白在腫瘤中的作用GRIM-19是GRIM家族一員，其定位于19p13.2，它包含著一個(gè)開(kāi)放讀碼框，其編碼的蛋白質(zhì)含有144個(gè)氨基酸殘基。GRIM-19主要定位于胞質(zhì)中的線粒體內(nèi)膜上，在受到外界刺激后表達(dá)量增多，并能從線粒體中釋放而進(jìn)入細(xì)胞核。GRIM-19被認(rèn)為是一種調(diào)亡基因，受維甲酸和干擾素的共同誘導(dǎo)［13］；同時(shí)GRIM-19為線粒體中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）脫氫酶Ⅰ復(fù)合物的亞單位，在線粒體Ⅰ型呼吸過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。多項(xiàng)研究表明，GRIM-19參與細(xì)胞的增殖、凋亡的調(diào)控過(guò)程［14］，其表達(dá)降低或位點(diǎn)突變可以導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化［15］，在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用［5，16］。

3.3 HBXIP與GRIM-19蛋白在肝細(xì)胞癌組織和正常肝臟組織中的表達(dá)本研究顯示，HBXIP在正常肝組織表達(dá)水平較低，而在肝細(xì)胞癌組織中呈過(guò)量表達(dá)，兩組相比具有明顯的差異性；而GRIM-19在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平相對(duì)正常肝組織明顯減少。通過(guò)統(tǒng)計(jì)肝細(xì)胞癌中HBXIP和GRIM-19表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞分化程度越高，HBXIP陽(yáng)性表達(dá)率越低；Ⅰ～Ⅱ期肝癌組織中HBXIP的表達(dá)水平比Ⅲ～Ⅳ期低；有門(mén)靜脈癌栓肝癌組織中的陽(yáng)性率與無(wú)門(mén)靜脈栓塞者無(wú)差異；而GRIM-19在低、未分化、Ⅲ～Ⅳ期、有門(mén)靜脈栓塞肝癌組表達(dá)均降低，且2種蛋白在AFP水平、腫瘤大小等方面的表達(dá)無(wú)差異。本研究提示HBXIP、GRIM-19在肝細(xì)胞癌組織中的異常表達(dá)可能與肝癌細(xì)胞發(fā)生、進(jìn)展，以及腫瘤向周?chē)M織的侵襲、遷移之間有著高度的關(guān)聯(lián)性，從而為癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的研究提供理論依據(jù)。此外，本研究顯示2種蛋白在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，因此推測(cè)HBXIP蛋白表達(dá)增加和GRIM-19表達(dá)減少在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中存在拮抗作用。

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（2015-05-08收稿 2015-08-08修回）

（本文編輯 李鵬）

Expressions of HBXIP and GRIM-19 in hepatocellular carcinoma and their clinic significance

SUN Jisan，ZHANG Jianjun，GAO Wei，YANG Tao，GUO Qingjun，MA Nan，WANG Honghai，JIANG Wentao△
Tianjin First Central Hospital of Oriental OrganTransplant Center，Tianjin 300192，China△

ObjectiveTo investigate the expressions of HBXIP and GRIM-19 in hepatocellular carcinoma tissues and their clinic significance.MethodsHepatocellular carcinoma tissue（n=42）and normal liver tissue（n=28）were collected from Tianjin First Central Hospital，immunohistochemistry was used to detect the expressions of HBXIP and GRIM-19 in these two groups.ResultsRate of cells with positive expressions of HBXIP in hepatocellular carcinoma and normal liver tissues were 80.95%（34/42）and 42.86%（12/28）respectively；Rate of cells with positive expression of GRIM-19 in hepatocellular carcinoma tissues and normal liver tissues was 40.48%（17/42）and 75.00%（21/28）respectively，and the difference between these two groups was statistically significant（P＜0.05）；The expression of HBXIP was higher but the expression of GRIM-19 was lower in poor differentiated and stageⅢ-IV cells than those in well and moderate differentiated cells and in stage I-II，cells.What′s more，the expression of GRIM-19 is higher in tissue without portal thrombosis than that in tissue with portal thrombosis.The expression of HBXIP was negatively correlated with GRIM-19 expression（rS=-0.400，P＜0.01）. ConclusionThe abnormal expressions of HBXIP and GRIM-19 may play important roles in the process of development and metastasis of hepatocellular carcinoma.

carcinoma，hepatocellular；neoplasm metastasis；immunohistochemistry；HBXIP；GRIM-19

R735.7

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.12.006

天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（10ZCGYSF00500）

天津市第一中心醫(yī)院東方器官移植中心（郵編300192）

孫紀(jì)三（1980），男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事肝臟移植方面研究

△通訊作者E-mail：jiang-wentao@medmail.com.cn