尹翠紅，車雅敏

復(fù)方甘草酸苷對(duì)HaCaT細(xì)胞表達(dá)IL-2、IL-4的影響

尹翠紅，車雅敏△

目的觀察復(fù)方甘草酸苷（CG）對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞增殖的抑制作用及其表達(dá)白細(xì)胞介素（IL）-2、IL-4的影響，探討CG治療銀屑病的作用機(jī)制。方法將培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞分為4組：空白對(duì)照組（不加CG）；低濃度組（1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液中加入50 μL CG）；中濃度組（1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液中加入100 μL CG）；高濃度組（1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液中加入200 μL CG）。采用噻唑藍(lán)（MTT）方法檢測(cè)24 h后不同濃度CG對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的抑制作用；雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）分析不同濃度CG處理后的HaCaT細(xì)胞上清液中IL-2及IL-4的表達(dá)水平。結(jié)果低、中、高濃度CG干預(yù)HaCaT細(xì)胞24 h后均可見(jiàn)到明顯的增殖抑制作用。不同濃度CG干預(yù)HaCaT細(xì)胞24 h后，低濃度組上清液中IL-2的濃度與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異（ng/L：234.51±17.98 vs 225.31±16.23，P＞0.05）；中、高濃度組的IL-2濃度明顯低于空白對(duì)照組及低濃度組，且高濃度組低于中濃度組（ng/L：188.99±19.22 vs 208.49±18.40，P＜0.05）；高濃度組培養(yǎng)上清液中IL-4的濃度較其余3組明顯升高（ng/L：45.67±10.29 vs 37.62±3.90、39.68±6.08、43.85± 10.26，P＜0.05）。結(jié)論CG可能是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-2與IL-4的分泌而抑制皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。

復(fù)方甘草酸苷；HaCaT細(xì)胞；白細(xì)胞介素-2；白細(xì)胞介素-4；細(xì)胞增殖

復(fù)方甘草酸苷（compound glycyrrhizin，CG）因具有抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫、抑制病毒增殖等作用，臨床上一直被廣泛應(yīng)用于病毒性肝炎、肝硬化等疾病的治療，其療效已被公認(rèn)［1］。近十幾年來(lái)，臨床有報(bào)道用CG治療T細(xì)胞相關(guān)性炎癥性皮膚病，如銀屑病、斑禿、扁平苔蘚等，效果較好［2］，進(jìn)一步研究發(fā)

現(xiàn)CG可降低T細(xì)胞群的活性，幫助恢復(fù)淋巴細(xì)胞功能［3］?，F(xiàn)已證實(shí)，T細(xì)胞異?；罨菍?dǎo)致銀屑病發(fā)生的重要因素，在銀屑病皮損和外周血中，Th1細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（IL）-2、腫瘤壞死因子（TNF）-α高表達(dá)而Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-10低表達(dá)［4-5］，包括T淋巴細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞和不同的免疫相關(guān)細(xì)胞因子的活化形成復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的過(guò)度增殖。近年研究發(fā)現(xiàn)CG可能通過(guò)調(diào)節(jié)IL-8、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β等細(xì)胞因子的分泌來(lái)達(dá)到治療銀屑病的目的［6］。但是，關(guān)于CG對(duì)Th1、Th2主要細(xì)胞因子IL-2、IL-4的作用情況尚不清楚。本研究采用不同濃度CG體外干預(yù)HaCaT細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)HaCaT細(xì)胞增殖變化及培養(yǎng)上清液中IL-2、IL-4的變化，以期為CG治療銀屑病等免疫性疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自北京賽默飛生物有限公司；PBS、胰酶-EDTA消化酶、胎牛血清、二甲基亞砜（DMSO）均購(gòu)自北京索萊寶公司；噻唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自美國(guó)sigma公司；IL-2、IL-4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒均購(gòu)自上海慧穎生物科技有限公司。CG注射液是由甘草甜素、甘氨酸及鹽酸半胱氨酸組成的復(fù)方制劑（商品名：美能，SNMC），購(gòu)自日本米諾發(fā)源制藥株氏會(huì)社，每2 mL復(fù)方制劑中分別含甘草甜素、甘氨酸及鹽酸半胱氨酸分別為4、40及2 mg；人永生角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞株由我科實(shí)驗(yàn)室保存；Synergy MX型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek公司）。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測(cè)不同濃度CG對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖活性的影響HaCaT細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液于37℃、5%CO2飽和濕度下貼壁培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)進(jìn)行傳代，傳代時(shí)去除培養(yǎng)液，使用PBS潤(rùn)洗細(xì)胞2次，加入0.25%胰蛋白酶消化后，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的單細(xì)胞懸液以1×104個(gè)/mL的密度接種在96孔板上，200 μL/孔，次日細(xì)胞貼壁后換培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，分為空白對(duì)照組、低濃度組、中濃度組與高濃度組，后3組分別加入不同濃度CG（甘草酸苷體積比分別為0.05、0.1、0.2），繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 g/L MTT 20 μL，37℃孵育4 h，棄上清，每孔加150 μL DMSO，于搖床上輕微振蕩10 min，酶聯(lián)免疫儀測(cè)定各孔在波長(zhǎng)490 nm處光密度（OD）值。

1.2.2 ELISA法檢測(cè)不同濃度CG作用HaCaT細(xì)胞上清液中IL-2、IL-4的分泌水平取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔板，加入不同濃度的CG，培養(yǎng)24 h后，收集上清液，離心，采用雙抗夾心ELISA法檢測(cè)上清液中IL-2、IL-4水平，嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取樣品濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以表示，多組比較用F檢驗(yàn)，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度CG對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖活性的影響低、中、高濃度CG對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖能力的抑制作用均較空白對(duì)照組明顯增強(qiáng)（P＜0.05），見(jiàn)表1。

Tab.1Comparison of proliferation and relative contents of IL-2，IL-4 in HaCaT cells between four groups表1 各組HaCaT細(xì)胞增殖活性及IL-2、IL-4相對(duì)含量比較（n=10，）

Tab.1Comparison of proliferation and relative contents of IL-2，IL-4 in HaCaT cells between four groups表1 各組HaCaT細(xì)胞增殖活性及IL-2、IL-4相對(duì)含量比較（n=10，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與空白對(duì)照組比較，b與低濃度組比較，c與中濃度組比較，P＜0.05

組別空白對(duì)照組低濃度組中濃度組高濃度組F O D值0 . 5 0 ± 0 . 0 2 0 . 4 8 ± 0 . 0 2 a 0 . 4 7 ± 0 . 0 3 a 0 . 4 5 ± 0 . 0 3 a 7 . 8 2＊＊I L -2（n g / L）2 3 4 . 5 1 ± 1 7 . 9 8 2 2 5 . 3 1 ± 1 6 . 2 3 2 0 8 . 4 9 ± 1 8 . 4 0 a b 1 8 8 . 9 9 ± 1 9 . 2 2 a b c 1 2 . 4 0＊＊I L -4（n g / L）3 7 . 6 2 ± 3 . 9 0 3 9 . 6 8 ± 6 . 0 8 4 3 . 8 5 ± 1 0 . 2 6 4 5 . 6 7 ± 1 0 . 2 9 a 2 . 8 8＊

2.2 不同濃度CG處理HaCaT細(xì)胞對(duì)上清液中IL-2、IL-4相對(duì)含量的影響低濃度組上清液中IL-2的濃度與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異（P＞0.05）；中、高濃度組IL-2濃度明顯低于空白對(duì)照組及低濃度組，且高濃度組低于中濃度組（均P＜0.05）。高濃度組CG作用HaCaT細(xì)胞后24 h，培養(yǎng)上清液中IL-4的濃度高于空白對(duì)照組（P＜0.05），其余3組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

3 討論

CG提純以β體甘草酸為主要成分，輔以甘草酸苷、甘氨酸、半胱氨酸等成分，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與可的松或醛固酮的類固醇環(huán)相似，作用類似于糖皮質(zhì)激素，但又無(wú)糖皮質(zhì)激素的不良反應(yīng)，具有藥理作用強(qiáng)、毒性小的優(yōu)點(diǎn)。研究已證實(shí)CG對(duì)肝臟類固醇代謝酶△4-5β還原酶有強(qiáng)親和力，阻止可的松和醛固酮的滅活，從而發(fā)揮類固醇樣作用，可誘生γ-干擾素（IFN-γ），增強(qiáng)自然殺傷（NK）細(xì)胞活性，降低天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶與丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶，抑制肝細(xì)胞變性壞死與肝原纖維增生，促進(jìn)肝臟膽紅素代謝，提高解毒能力［7］，因此過(guò)去的幾十年一直廣泛用于肝損傷相關(guān)疾病的治療。后來(lái)有些學(xué)者發(fā)現(xiàn)CG可直接與磷脂酶A2結(jié)合，還可作用于花生四烯酸使其產(chǎn)生炎性介質(zhì)，選擇性阻斷酶的磷酸化，從而抑制前列腺素和白三烯等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，抑制補(bǔ)體系統(tǒng)的激活途徑，直接發(fā)揮抗炎作用［8］。此外，CG還可活化T細(xì)胞，誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生，調(diào)節(jié)Th1/Th2比值動(dòng)態(tài)平衡，激活

NK細(xì)胞，調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性，因此臨床上大量應(yīng)用于T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥性皮膚病，如銀屑病、天皰瘡等［3］。大量研究已證實(shí)銀屑病是一種多基因遺傳背景下，由多種免疫相關(guān)性細(xì)胞、細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)相互作用的免疫相關(guān)性疾?。灰越琴|(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖和異常分化及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為主要特征［9］。銀屑病受累皮損的發(fā)生、發(fā)展和活化T細(xì)胞的歸巢受體表達(dá)有關(guān)，它可以促進(jìn)活化T細(xì)胞向皮膚遷移［10］，在銀屑病皮膚受損處受到了活化T細(xì)胞及其釋放的細(xì)胞因子網(wǎng)的復(fù)雜作用，包括IFN-γ、TNF-α、細(xì)胞因子（IL-1、IL-2、IL-6等）與多種趨化因子水平的升高［11］，共同影響角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖狀態(tài)。為研究CG治療銀屑病的作用機(jī)制，張汝芝等［12］用不同濃度CG作用于體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)50～200 μL/mL濃度的CG抑制HaCaT細(xì)胞增殖的同時(shí)，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)CXCR2和TGF-β1分泌。郭波等［13］研究CG對(duì)HaCaT細(xì)胞表達(dá)AQP3的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)62.5～125 μL/mL CG可抑制HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)促進(jìn)HaCaT細(xì)胞表達(dá)AQP3。宋璐璐［14］探討CG對(duì)體外銀屑病皮損模型的作用及機(jī)制，結(jié)果顯示CG可以減少銀屑病皮損組織細(xì)胞IL-17的含量，同時(shí)增加IL-10的含量。銀屑病患者Th1細(xì)胞的細(xì)胞因子（IL-2、TNF-α、IL-8等）升高導(dǎo)致Th1/Th2細(xì)胞因子失衡，因此多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，銀屑病是Th1細(xì)胞為主的免疫性疾病。其中IL-2是重要的促炎癥性細(xì)胞因子，能促進(jìn)Th1型的免疫反應(yīng)，其可以通過(guò)與IL-2受體的結(jié)合，活化T細(xì)胞，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，產(chǎn)生炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)而加重銀屑病。它亦能增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，誘導(dǎo)IL-2受體表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞移動(dòng)，增強(qiáng)細(xì)胞間的接觸和誘導(dǎo)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。IL-4是Th2型細(xì)胞主要的細(xì)胞因子，是一種免疫負(fù)調(diào)節(jié)因子，可抑制微環(huán)境中的Th1細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-22、IFN-γ等，誘導(dǎo)免疫耐受的作用［15］。但國(guó)內(nèi)外尚鮮見(jiàn)CG對(duì)HaCaT細(xì)胞分泌IL-2、IL-4影響的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同濃度CG體外干預(yù)HaCaT細(xì)胞后檢測(cè)上清液IL-2、IL-4的分泌水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低至高濃度CG對(duì)HaCaT細(xì)胞相對(duì)活性有一定影響，抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，并且隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞的相對(duì)活性逐漸降低，抑制作用更明顯；在檢測(cè)濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，IL-2分泌量明顯降低，IL-4分泌量逐漸升高。結(jié)合CG的藥理作用，筆者推測(cè)CG治療銀屑病的作用機(jī)制是通過(guò)調(diào)節(jié)作用于活化T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，主要是調(diào)節(jié)Th1型細(xì)胞因子的分泌來(lái)糾正外周血Th1/Th2平衡失調(diào)，減少炎癥介質(zhì)釋放，達(dá)到改善銀屑病癥狀的效果。

細(xì)胞因子在銀屑病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要的作用，抑制某些細(xì)胞因子的合成或阻斷其生物活性是生物制劑治療銀屑病的重要研究?jī)?nèi)容。由于我們的工作僅限于CG對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞部分細(xì)胞因子影響的研究，至于各細(xì)胞因子之間、角質(zhì)形成細(xì)胞與T細(xì)胞之間的相互影響和相互作用機(jī)制，還需要進(jìn)一步全面、系統(tǒng)地探討。

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（2015-04-01收稿 2015-06-10修回）

（本文編輯 閆娟）

Effects of glycyrrhizin on the expressions of IL-2 and IL-4 in HaCaT cells

YIN Cuihong，CHE Yamin△
Department of Dermatology，Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China△

ObjectiveTo observe the effect of glycyrrhizin（CG）on the proliferation and the expressions of interleukin（IL）-2，IL-4 in human keratinocytes cell line HaCaT cells，and to investigate the therapeutic mechanism of CG in the patients with psoriasis.MethodsThe HaCaT cells were divided into four groups:blank group（without CG），low concentration group（50 μL CG/mL cell supernatant），medium concentration group（100 μL CG/mL cell supernatant）and high concentration group（200 μL CG/mL cell supernatant）.Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay was performed to evaluate the proliferation of HaCaT cells that were treated with CG at different concentrations respectively for 24 hours.The contents of IL-2 and IL-4 in HaCaT cells were examined by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.ResultsCompared with the blank group，there were obviously inhibitory effects in the proliferation of HaCaT cells treated by low，medium and high concentrations of CG for 24 hours.There was no significant difference in IL-2 level between low concentration CG group and blank group（ng/L：234.51±17.98 vs 225.31±16.23，P＞0.05）.After 24 hours of intervention with CG of medium and high concentrations，the expression levels of IL-2 was significantly lower in HaCaT cells than that in blank group and low concentration group.The IL-2 level was significantly lower in high concentration group than that in medium concentration group（ng/L: 188.99±19.22 vs 208.49±18.40，P＜0.05）.At the same condition，the secretion of IL-4 in HaCaT cells was significantly upregulated in high concentration group than that in other three groups（ng/L:45.67±10.29 vs 37.62±3.90，39.68±6.08，43.85± 10.26，P＜0.05）.ConclusionGlycyrrhizin may suppress the proliferation of human skin keratinocytes by regulating secretion of cytokines IL-2 and IL-4.

compound glycyrrhizin；HaCaT cell；interleukin-2；interleukin-4；cell proliferation

R751

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.12.005

中華醫(yī)學(xué)會(huì)皮膚性病學(xué)分會(huì)美能皮膚病學(xué)研究基金（SNMC-201201）

天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院皮膚科（郵編300052）

尹翠紅（1981），女，碩士在讀，主要從事銀屑病的發(fā)病機(jī)制與治療的研究

△通訊作者E-mail：lily_alan@sohu.com