陳顯群，羊 悅，楊勝利*

（1.溫州市食品研究所，浙江溫州325000；2.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310014）

中藥蟬花菌株篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化研究

陳顯群1，羊 悅2，楊勝利2*

（1.溫州市食品研究所，浙江溫州325000；2.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州310014）

目的：從蟬花中分離真菌，并采用液體培養(yǎng)考察菌絲收率。方法：在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對蟬花菌液態(tài)深層發(fā)酵條件如搖床轉(zhuǎn)速、接種量、pH等進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果：最優(yōu)的發(fā)酵工藝為初始pH 7.0、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min、發(fā)酵溫度25℃。結(jié)論：優(yōu)化發(fā)酵工藝條件下蟬花菌發(fā)酵生物量為6.57 g/L。

蟬花；液態(tài)深層發(fā)酵；分離

0 引言

蟬花屬蟲生性藥用真菌，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材，又名蟬蛹草、蟬茸、胡蟬、蜩等，與冬蟲夏草同屬于菌物界、真菌門、子囊菌綱、麥角菌目、麥角菌科、蟲草屬，具有廣泛的生物活性。中醫(yī)藥學(xué)家認(rèn)為，蟬花具有疏散風(fēng)熱、透疹、熄風(fēng)止痙、明目退翳之功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，它具有免疫調(diào)節(jié)[1-3]、抗疲勞抗衰老[4-5]、抗腫瘤[6-8]、改善腎功能[9]、促進(jìn)造血功能[10]、鎮(zhèn)靜催眠[11]、滋補(bǔ)強(qiáng)壯[12]等作用。由于蟬花與冬蟲夏草同屬蟲菌復(fù)合體，且具有相近的藥用價(jià)值，所以醫(yī)家常將蟬花作為冬蟲夏草的代用品。由于蟬花生長需要特定的生態(tài)環(huán)境和寄主昆蟲，資源稀少，再加上長期采挖，資源日趨枯竭。開展人工分離、培養(yǎng)及液體發(fā)酵培養(yǎng)菌絲體的研究是未來的一個發(fā)展方向。近些年對冬蟲夏草的研究較多，而對蟬花的研究甚少，蟬花具有與冬蟲夏草相似的化學(xué)成分，故蟬花可能具有與冬蟲夏草相似的藥用價(jià)值，從而為蟬花作為冬蟲夏草的替代品提供了理論依據(jù)[13-16]。

1 材料與方法

1.1 蟬花采自浙江安吉竹博園

1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基:馬鈴薯20%，葡萄糖4%，蛋白胨0.2%，酵母膏0.2%，K2HPO40.1%，MgSO40.05%，瓊脂粉2%。121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基:馬鈴薯20%，葡萄糖4%，蛋白胨0.2%，酵母膏0.2%，K2HPO40.1%，MgSO40.05%。121℃滅菌20 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基:馬鈴薯提取液20%，葡萄糖4%，蛋白胨0.4%，MgSO40.05%，K2HPO40.1%，酵母膏0.2%，維生素B1 0.002%。121℃滅菌20 min。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離

稱取5 g天然蟬花樣品，分別取自僵蟲體、子座芽和孢子，加入到45 mL無菌生理鹽水中，振蕩30 min。梯度稀釋，從各稀釋液中吸取0.1 mL到篩選平板并涂布，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。挑選單個典型的菌落，接種到PDA斜面培養(yǎng)基中，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌種鑒定

用點(diǎn)接法將蟬花真菌接種到PDA平板上進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，通過顯微鏡作個體形態(tài)觀察。

1.3.3 種子培養(yǎng)

250 mL搖瓶裝液量50 mL，接種斜面菌塊，置于搖床中，轉(zhuǎn)速160 r/min，25℃培養(yǎng)4 d。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)條件的影響

經(jīng)初步試驗(yàn)選定pH值、發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速作為主要影響因素，以發(fā)酵后菌絲體生物量為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用三因素三水平正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對蟬花菌株發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化研究。

1.3.4.1 pH值的影響

在250 mL錐形瓶中裝入100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，按5%種子液接種，pH值分別調(diào)至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，25℃培養(yǎng)5 d，發(fā)酵結(jié)束后，4000 r/min離心，測定菌絲體量。

1.3.4.2 溫度的影響

固定其他條件，考查發(fā)酵培養(yǎng)溫度分別為20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃時(shí)對蟬花發(fā)酵生物量的影響。

1.3.4.3 搖床轉(zhuǎn)速的影響

固定其他條件，考查搖床轉(zhuǎn)速分別為120、140、160、180、200 r/min時(shí)對蟬花發(fā)酵生物量的影響。

1.3.4.4 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化

針對發(fā)酵過程中pH值、溫度和轉(zhuǎn)速對菌絲體生長的影響，選定這3個因素，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)L9（33），其因素和水平見表1。

表1 發(fā)酵條件因素水平表Table 1 Factors and levels of fermentation condition

1.3.5 生物量測定

采用干重法。發(fā)酵液經(jīng)4000 r/min離心15 min去除上清液，菌絲體用去離子水洗滌3次后離心，置于烘箱內(nèi)60℃烘干至恒重后稱重。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的分離與鑒定

按照1.3.1方法分離出多株菌株，其中在子座芽中分離的一株長勢良好。經(jīng)分離純化后，點(diǎn)接在PDA平板中觀察該菌落形態(tài)。發(fā)現(xiàn)剛開始菌落圓形呈白色，起初星狀放射生長、菌絲平伏，與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，不易挑取，繼續(xù)培養(yǎng)顏色逐漸加深，最終呈紫色。在顯微鏡下觀察該菌個體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)菌絲有隔，基部無足細(xì)胞。分生孢子梗生于氣生菌絲上，具簡單分枝，由單側(cè)生、對生的瓶狀小梗組成。瓶梗較短，基部膨大和具管狀的頸部，可初步判定其為蟬擬青霉。

2.2 發(fā)酵條件對蟬花菌絲體生長的影響

2.2.1 pH值對蟬花發(fā)酵生物量的影響

一般來講，pH值過低菌體易衰老，pH值過高易使菌體自溶。本實(shí)驗(yàn)研究了不同的培養(yǎng)基pH值對菌體生長的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，就生物量而言，出發(fā)菌株隨著初始pH值的升高出現(xiàn)先上升后下降的變化，在初始pH為7.0時(shí)，達(dá)到最大值；在初始pH為6.5和pH為7.0時(shí)生物量變化不明顯，分別是6.24 g/L和6.27 g/L。

圖1 培養(yǎng)初始pH值對生物量的影響Fig.1 Effects of initial pH on biomass

圖2 培養(yǎng)溫度對生物量的影響Fig.2 Effects of culture temperature on biomas

2.2.2 培養(yǎng)溫度對蟬花發(fā)酵生物量的影響

對微生物發(fā)酵培養(yǎng)來說，溫度的影響是雙方面的:溫度升高，可以加快微生物的生長，但是隨著溫度的上升，細(xì)胞中對溫度敏感的酶可能會遭到破壞，而且溫度過高，菌體易老化，影響到菌絲體生長及其他代謝產(chǎn)物的積累。一般的較適于真菌生長的溫度范圍為25℃～30℃，據(jù)報(bào)道菌絲在10℃～30℃下均能生長。本實(shí)驗(yàn)選擇溫度范圍在20℃～30℃之間，考察對菌絲體的生長影響。由圖2可以看出，在26℃時(shí)的生物量最大，而低于20℃或高于30℃對菌絲體的生物量影響較大，由于長勢肉眼便可直觀辨別，因此沒有進(jìn)一步研究的必要。因此選定蟬花菌絲生長的最適合的發(fā)酵溫度為26℃，菌株生物量達(dá)到最大值6.42 g/L。

2.2.3 搖床轉(zhuǎn)速對蟬花發(fā)酵生物量的影響

由表3可以看出，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min時(shí)蟬花菌絲生物量達(dá)到最大，菌絲在液體中生長需要消耗氧氣，隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高，液面接觸空氣的面積增大，利于溶解氧水平的增加；搖床轉(zhuǎn)速繼續(xù)增加，剪切力增加，菌絲不斷被切斷，形成新的菌絲球萌發(fā)點(diǎn)，從而生長出新的菌絲球；但搖床轉(zhuǎn)速過大，菌絲難以在高速振蕩情況下會導(dǎo)致菌絲損傷嚴(yán)重，難以維持正常的生長，因而影響整個生物量，所以搖床轉(zhuǎn)速以160 r/min左右為宜。

圖3 藥瓶轉(zhuǎn)速對生物量的影響Fig.3Effects of shaking speed on biomass

2.2.4 pH值、溫度、搖床轉(zhuǎn)速正交試驗(yàn)

為考察不同發(fā)酵條件對菌絲體生長的影響，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，試驗(yàn)選pH值、溫度、轉(zhuǎn)速等3因素，進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)，在參考已知文獻(xiàn)及前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以生物量為評價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化液態(tài)深層發(fā)酵工藝。按照表1設(shè)計(jì)的正交實(shí)驗(yàn)，考察了不同發(fā)酵條件對蟬花菌絲體的生長的影響，結(jié)果示于表2。由此得出優(yōu)選實(shí)驗(yàn)方案為A2B2C2。搖床轉(zhuǎn)速與溶氧濃度有關(guān)。溶氧對菌絲體生長有影響。由于氧在水中的溶解度很小，因此氧往往成為發(fā)酵過程的限制性因素。搖床轉(zhuǎn)速慢，氧在發(fā)酵液中的溶解度就小，在發(fā)酵進(jìn)入對數(shù)期后，易造成溶氧不足，影響了菌絲體的生長；搖床轉(zhuǎn)速快，增加了溶氧量。溫度對菌絲體的生長具有重要影響，25℃時(shí)菌絲體生長迅速，最后得到的生物量高。pH影響代謝過程中各種酶的活性，pH=7.0有利于菌體的生長。

表2 冬蟲夏草液態(tài)深層發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment design in submerged fermentation conditions of Cordyceps sinensis

表3 方差分析Table 3Analysis of variance

從以上的方差分析可知，各因素對蟬花菌絲體生成量的影響大小順序?yàn)锳（溫度）＞B（pH）＞C（轉(zhuǎn)速），三個因素對結(jié)果的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。最終確定冬蟲夏草菌絲體的富硒量的最佳工藝條件為A2B2C2，即pH值為7，溫度25℃，轉(zhuǎn)速為160 r/min。

2.3 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

在單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果表明，在培養(yǎng)5 d的條件下，蟬花菌液態(tài)深層發(fā)酵最優(yōu)工藝參數(shù)：裝液量100 mL，pH值7.0，搖床頻率為160 r／min，溫度25℃。此時(shí)蟬花發(fā)酵生物量為6.57 g／L。

3 結(jié)論

通過對蟬花菌絲體發(fā)酵條件的優(yōu)化研究，發(fā)現(xiàn)其工藝的優(yōu)化是一個非常復(fù)雜的動態(tài)過程，影響其結(jié)果的因素也很多，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)取得了較好的效果，結(jié)合方差分析得到反應(yīng)條件的最佳點(diǎn)，在此條件下，蟬花發(fā)酵生物量為6.57 g／L。本試驗(yàn)找出了蟬花菌絲的最佳發(fā)酵條件，為以后的研究提供了一定的基礎(chǔ)，今后可進(jìn)一步選育出優(yōu)良的蟬花菌株應(yīng)用到發(fā)酵生產(chǎn)中。

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Study on Separation and Fermentation Culture of Strain of Cordyceps Cicadae

CHEN Xian-qun1,YANG Yue2,YANG Sheng-li2
（Wenzhou Food Research Institute,Wenzhou，Zhejiang 325000,China；The College of Pharmaceutical Science,Zhejiang University of Technology,Hangzhou，Zhejiang 310014,China）

Objective:The strain isolated from Cordyceps cicadae and its fermentation culture were studied,mycelia yield was investigated by submerge fermentation.Methods:Single factor examination and orthogonal experiment design were used to investigate the effects of pH,temperature,shaking speed on the biomass of the Cordyceps cicadae.Results:The optimal fermentation conditions:initial pH 6.0,shaking speed 160 r/min,fermentation temperature 25℃.Conclusion:The biomass of Cordyceps cicadae is 34.98 g/L under the optimized fermentation process.

Cordyceps cicadae;submerged fermentation;isolation

1006-4184（2015）2-0018-04

2014-07-04

陳顯群（1965-）,男，高級工程師，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)。E-mail：wzspyjs@163.com。

*通訊作者：楊勝利（1972-）,男，副教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸镏扑?。E-mail：yangshengli01@zjut.edu.cn。