沈艷婷 劉進(jìn)鍇 闕任燁 陶智會 林柳兵 李勇

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院脾胃病科，上海 200071；2.中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院肝外一科，上海 200433）

柴胡皂苷d對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的HSC-T6活化細(xì)胞內(nèi)AP-1、NF-κB表達(dá)的影響及其雌激素受體機制

沈艷婷1劉進(jìn)鍇2闕任燁1陶智會1林柳兵1李勇1

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院脾胃病科，上海 200071；2.中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院肝外一科，上海 200433）

目的：研究柴胡皂苷d（SSd）對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞HSC-T6活化細(xì)胞內(nèi)AP-1、NF-κB表達(dá)的影響及其雌激素受體（ER）機制，探討植物雌激素對肝纖維化的作用機制，為臨床應(yīng)用植物雌激素提供理論依據(jù)。方法：體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6，采用免疫組化法，檢測SSd對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的HSC-T6活化細(xì)胞內(nèi)α-SMA蛋白表達(dá)的影響；采用Western blot法，觀察SSd對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的HSC-T6活化細(xì)胞內(nèi)AP-1、NF-κB表達(dá)的影響。結(jié)果：氧化應(yīng)激處理HSC-T6細(xì)胞后，α-SMA、AP-1和P65/NF-κB表達(dá)明顯增加。如使用雌二醇（E2）或SSd預(yù)處理HSC-T6細(xì)胞24h后再接受氧化應(yīng)激處理，三種蛋白表達(dá)明顯降低，這種作用可被雌激素受體（ER）完全拮抗劑ICI-182780和ERβ拮抗劑THC抑制。結(jié)論：E2、SSd可能通過調(diào)控ERβ，進(jìn)而抑制核轉(zhuǎn)錄因子AP-1和P65/NF-κB的表達(dá)起到抑制HSC-T6活化的作用。

柴胡皂苷d 肝 星狀細(xì)胞 HSC-T6細(xì)胞 體外實驗 大鼠

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是由于各種致病原因所致慢性肝損傷反復(fù)修復(fù)，經(jīng)過過度的創(chuàng)傷愈合應(yīng)答，導(dǎo)致瘢痕組織形成，引起細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）在肝臟內(nèi)過度增生與異常沉積所致肝臟結(jié)構(gòu)和肝功能異常改變的一種病理變化，其發(fā)生發(fā)展是一個連續(xù)的階段性過程。肝星狀細(xì)胞（Hepatic Stellate Cell，HSC）的活化在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中占據(jù)著重要地位，多種核轉(zhuǎn)錄因子如轉(zhuǎn)錄激活蛋白-1（Activator protein-1，AP-1）、核因子NF-κB（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）等表達(dá)增高與HSC的活化有關(guān)。由于肝纖維化是一個可逆性的病理過程，所以早期診斷、進(jìn)行藥物干預(yù)可防止肝硬化的發(fā)生，從而破壞“慢性肝?。卫w維化－肝硬化－肝癌”這條“死亡鏈”。

柴胡（Bupleurum）作為一種治療肝相關(guān)疾病的中藥材已經(jīng)有幾千年的歷史，但其主要起作用的成分及機制至今尚未完全揭示。目前研究發(fā)現(xiàn)柴胡主要的提取成分是柴胡皂苷a（SSa）、柴胡皂苷b（SSb）、柴胡皂苷c（SSc）和柴胡皂苷d（SSd）等，其中SSd是其活性最強的成分之一［1］。我們前期研究已初步證實SSd在體內(nèi)外有弱雌激素樣作用［2］，但其是否能通過雌激素受體作用于肝星狀細(xì)胞至今尚未明確。本實驗旨在研究SSd對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6活化細(xì)胞內(nèi)AP-1、NF-κB表達(dá)的影響及其雌激素受體機制。

1 實驗材料

1.1 主要試劑雌二醇（E2，Sigma公司），柴胡皂苷d（中國食品藥品檢定所），DMEM高糖培養(yǎng)基（Thermo Scientific公司），胎牛血清（奧地利PAA公司），二甲基亞砜（美國Amresco公司），牛血清白蛋白（美國Amresco公司），AP-1、NF-κB、α-SMA、β-actin抗體（CST公司），ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（Millipore公司），蛋白質(zhì)分子量預(yù)染Marker（Thermo公司），山羊抗兔HRP標(biāo)記二抗（CST公司），山羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗（CST公司），雌激素受體α選擇性拮抗劑MPP、雌激素受體β選擇性拮抗劑THC（TOCRIS公司），雌激素受體完全拮抗劑ICI-182780（sigma公司），即用型免疫組化試劑盒（福州邁新公司），蘇木素染液（福州邁新公司），DAB顯色試劑盒（福州邁新公司）。

1.2 主要儀器電泳儀（Bio-rad），離心機（Heal force），AIRTECH超凈工作臺（蘇州蘇凈集團(tuán)安泰公司），V-5060型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司），DM2500型正置熒光顯微鏡（Leica公司），ChemiDocTMXRS+自動顯影系統(tǒng)（Bio-Rad）。

1.3 細(xì)胞肝星狀細(xì)胞株HSC-T6，由SV40轉(zhuǎn)染SD大鼠肝星狀細(xì)胞獲得，其表型為活化肝星狀細(xì)胞，由第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院消化科提供。

2 實驗方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)HSC-T6細(xì)胞用含有10%熱滅活胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、完全飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，每48h更換培養(yǎng)基，細(xì)胞生長鋪滿培養(yǎng)瓶底80%后，用0.25%胰蛋白酶聯(lián)合0.02%EDTA消化傳代，實驗選用對數(shù)生長期細(xì)胞。

HSC-T6細(xì)胞用含有5%熱滅活胎牛血清的無酚紅DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種于6孔板，1.5×105/孔，24h貼壁后，分為DMEM組（Vehicle）、ICI-182780處理組、MPP處理組及THC處理組，提前處理0.5h。每組各加入SSd（5μmol/L）或E2（1μmol/L）或DMEM（空白對照組、模型組），3孔/組，24h后再用H2O2（0.01mol/L）或DMEM（空白對照組）處理4h。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 免疫組化將藥物處理后的細(xì)胞用PBS漂洗2×2min，4%多聚甲醛固定15min，PBS漂洗3× 2min，空氣干燥5min；PBS清洗3×2min，0.5%Triton X-100孵育20min，PBS清洗3×2min；3%H2O2孵育15min，PBS清洗3×2min；血清封閉，37℃，20min；一抗孵育（陰性對照用PBS代替一抗），4℃過夜；二抗孵育，37℃，30min；PBS清洗5×2min；DAB顯色（避光，鏡下觀察至棕色）約10～15min，蒸餾水沖洗1次5min，蘇木素復(fù)染10min，自來水洗5min，脫水及透明，樹膠封片。

應(yīng)用計算機圖像分析技術(shù)對免疫組化結(jié)果進(jìn)行定量分析。每張切片隨機選取10個高倍鏡視野（×200），使用Imagepro-IPP圖像系統(tǒng)，半定量測定α-SMA的表達(dá)。

2.2.2 Western blot將藥物處理后的細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞3次后，將6孔板置于冰上。向培養(yǎng)板中加入150μL細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑1∶100），置于搖床上30min（冰上），用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下后，將細(xì)胞懸液移入EP管內(nèi)，超聲，離心12000g，20min，取上清。按照1∶4體積比加入4×loading buffer，100℃水浴10min，使蛋白變性。分裝，-20℃保存?zhèn)溆?。配制PAGE膠，分離膠的濃度為8%，積層膠為5%。上樣10μL預(yù)染的SDSPAGE蛋白分子量marker，以確定所檢測蛋白帶的位置。初始電壓為60V，溴酚藍(lán)電泳至積層膠和分離膠分界面后加大至100V，至凝膠底部時停止電泳。

3 實驗結(jié)果

3.1 SSd對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)的影響空白對照組細(xì)胞中有少量α-SMA蛋白表達(dá)，氧化應(yīng)激處理細(xì)胞后α-SMA表達(dá)明顯增加，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。如使用E2或SSd預(yù)處理HSC-T6細(xì)胞24h后再接受氧化應(yīng)激處理，α-SMA蛋白表達(dá)則明顯降低（P＜0.01），此種作用可被ICI-182780和THC阻斷，提示E2和SSd可顯著抑制HSC-T6細(xì)胞活化標(biāo)志蛋白α－SMA的表達(dá)，此種作用可能是通過ERβ激活調(diào)控。見圖1。

圖1 SSd對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)的影響

3.2 SSd對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞中AP-1和P65/NF-κB活化的影響空白對照組細(xì)胞中可見少量AP-1和P65/NF-κB蛋白表達(dá)，氧化應(yīng)激處理細(xì)胞后AP-1和P65/NF-κB表達(dá)明顯增加，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。如使用E2或SSd預(yù)處理HSC-T6細(xì)胞24h后再接受氧化應(yīng)激處理，兩種蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01），此種作用可被ICI-182780和THC阻斷，提示AP-1和P65/NF-κB參與了HSC-T6細(xì)胞活化過程，E2、SSd處理細(xì)胞后，兩種信號通路作用可被抑制，此種作用可能是通過ERβ激活調(diào)控。見圖2、圖3。

圖2 SSd對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞中AP-1活化的影響

圖3 SSd對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞中P65/NF-κB活化的影響

4 討論

肝星狀細(xì)胞是肝臟Disse腔內(nèi)的一種間質(zhì)細(xì)胞，在生理狀態(tài)下，它主要參與維系著肝細(xì)胞的構(gòu)架以及生理功能。當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷時，釋放多種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物、細(xì)胞因子（轉(zhuǎn)化生長因子β、血小板源生長因子等）、炎癥介質(zhì)（腫瘤壞死因子α、白介素-1、白介素-6等）等刺激導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞活化，由靜止的低表達(dá)平滑肌α-肌動蛋白（α-SMA）的肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化成具有增殖性、成纖維性、收縮性、高表達(dá)平滑肌α-肌動蛋白的肌成纖維細(xì)胞，并合成大量細(xì)胞外基質(zhì)。因此，肝星狀細(xì)胞的活化在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用。

氧化應(yīng)激在HSC活化過程中起主導(dǎo)作用。目前研究還表明多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如MAPK、TGF-β/ Smad、Wnt/β-catenin、JAK/STAT、Rho-ROCK等及核轉(zhuǎn)錄因子AP-1、NF-κB等都參與了HSC的活化過程。研究表明，NF-κB的激活能啟動下游多種靶基因如環(huán)氧合酶-2（COX-2）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等的表達(dá)，最終誘導(dǎo)HSC α-SMA的表達(dá)和前膠原的合成，促使HSC增殖活化，減少其凋亡，促使肝纖維化發(fā)生及發(fā)展［3］。另外，AP-1可能是HSC活化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，多種與纖維化密切相關(guān)的細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)錄為AP-1依賴性的。與ECM密切相關(guān)的MMP-1和TIMP-1的啟動子區(qū)均含有AP-1結(jié)合位點。α1（I）型前膠原的基因轉(zhuǎn)錄是由依賴AP-1的BETB激活所介導(dǎo)的［4］。

大量臨床資料表明，除了原發(fā)性膽汁性肝硬化外，大多數(shù)肝硬化患者中，男性發(fā)病比例明顯高于女性［5］，男性患者肝纖維化進(jìn)展速度快、個體存活時間短，而女性患者恰恰相反，且多發(fā)生在閉經(jīng)后，育齡期婦女很少有肝硬化發(fā)生，提示肝纖維化與性別有關(guān)系。臨床上男性肝硬化患者絕大多數(shù)都會出現(xiàn)血清雌二醇（E2）水平升高，常伴有乳房發(fā)育、蜘蛛痣及肝掌等臨床表現(xiàn)，對此現(xiàn)象目前通常的解釋是由于肝功能減退導(dǎo)致雌激素滅活障礙所致。然而，我們認(rèn)為也可能存在其他機制：肝臟在纖維化進(jìn)程中機體的一種自我代償性保護(hù)作用［6］。一項臨床研究也發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎、肝硬化代償期、肝硬化失代償期患者性激素（包括雌激素）及其受體水平顯著升高，隨著病情發(fā)展，肝功能損傷越嚴(yán)重，這些指標(biāo)上升越顯著。另一方面，在動物水平實驗中，雌激素已被證實對二甲基亞硝胺（dimethyl nitrosamine）和四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的肝纖維化動物模型具有明顯的抗纖維化作用［7-8］。在細(xì)胞水平實驗中，雌激素可以抑制過氧化氫誘導(dǎo)的原代大鼠肝星狀細(xì)胞的增殖與活化，這種效應(yīng)可能是通過減少脂質(zhì)過氧化水平來實現(xiàn)的［9］。雖然雌激素的抗纖維化作用已有多種證據(jù)支持，但由于其各種副作用而在臨床上的應(yīng)用受到限制，所以我們需要尋找其他具有雌激素樣效應(yīng)的替代藥物。近年來很多研究表明一些植物雌激素具有抗肝纖維化效應(yīng)，對心血管、肝臟、生殖系統(tǒng)均具有顯著的保護(hù)作用，如白藜蘆醇、槲皮素等，由于其副作用小，可以考慮用于替代雌激素在臨床上治療肝纖維化的病人。

本研究結(jié)果表明，氧化應(yīng)激處理HSC-T6細(xì)胞后，α-SMA、AP-1和P65/NF-κB表達(dá)明顯增加，提示HSC-T6細(xì)胞被活化。如使用E2或SSd預(yù)處理HSC-T6細(xì)胞24h后再接受氧化應(yīng)激處理，三種蛋白表達(dá)均明顯降低，這種作用可被ER完全拮抗劑ICI-182780和ERβ特異性受體拮抗劑THC抑制。SSd可能通過調(diào)控ERβ，進(jìn)而抑制下游核轉(zhuǎn)錄因子AP-1和P65/NF-κB的表達(dá)起到抑制HSC-T6活化的作用。提示SSd可能是柴胡的調(diào)經(jīng)、改善絕經(jīng)前后諸癥、保肝、治療肝纖維化等多種藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。SSd具有多途徑防治肝病的藥理作用，但許多研究工作要進(jìn)一步深化，比如其他方面的藥理活性，有無長期的毒性作用，及其吸收、分布、代謝及排泄等各個環(huán)節(jié)均應(yīng)進(jìn)行深入細(xì)致的研究，以尋找活性代謝物，更好地揭示其發(fā)揮藥效的作用機制及物質(zhì)基礎(chǔ)，從而為其在臨床上的推廣應(yīng)用提供可靠的依據(jù)。

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R282.710.5

A

1672-397X（2015）12-0081-04

沈艷婷（1990—），女，碩士研究生，從事消化系統(tǒng)疾病的臨床與基礎(chǔ)研究。

李勇，博士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師。liyong8256@126.com

2015-08-06

編輯：吳寧

上海市自然科學(xué)基金資助項目（09ZR1429700）；第二批上海市衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀學(xué)科帶頭人和優(yōu)秀青年人才培養(yǎng)計劃基金資助項目（滬衛(wèi)計委科教［2013］9號-50）