于曉霞，李燕，王婷婷，宋星

（上海海洋大學食品學院，上海 201306）

響應曲面法優(yōu)化酸性電解水對鮮切蘋果殺菌效果的影響

于曉霞，李燕*，王婷婷，宋星

（上海海洋大學食品學院，上海 201306）

以微生物減菌率為評價指標，在單因素試驗的基礎上，采用中心組合設計法，研究NaCl質(zhì)量濃度、處理溫度、處理時間，以及料液比對接種金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌和單增細胞李斯特菌的鮮切蘋果殺菌效果的影響。響應面分析結(jié)果表明，鮮切蘋果減菌工藝最優(yōu)條件為：NaCl質(zhì)量濃度4.5 g/L，處理溫度25℃，處理時間6.45 min，液料比6∶1（mL/g），在此條件下經(jīng)處理后細菌總數(shù)由1.14×105CFU/g降為9.3×103CFU/g，減菌率可達91.84%。同時，該處理對鮮切蘋果的pH值和可溶性固形物影響不大，且能較好地抑制維生素C的降解及其表面的褐變。

鮮切蘋果；響應曲面法；中心組合設計；工藝優(yōu)化

鮮切果蔬又名半處理果蔬或輕度加工果蔬，是對新鮮果蔬進行分級、整理、清洗、切分、保鮮、包裝等處理，并使產(chǎn)品保持生鮮狀態(tài)的制品。消費者購買這類產(chǎn)品后，不需要作進一步的處理，可直接食用或烹飪。隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快和生活水平的提高，人們對果蔬消費的需求越來越高，鮮切果蔬以其新鮮、方便、營養(yǎng)豐富和無公害等特點，近年來在歐美和日本等一些國家發(fā)展很快，在我國也開始受到關(guān)注［1］。然而，由于果蔬組織內(nèi)的營養(yǎng)汁液大量外流，給微生物的生長與繁殖提供了良好的環(huán)境條件，以致鮮切果蔬表面微生物大量滋生而引起腐?。?］。近年來，鮮切水果常與大腸桿菌O157∶H7和沙門氏菌等引起的食源性疾病聯(lián)系起來［3-5］。有研究表明，在未冷藏或10℃以上的儲存環(huán)境下，大腸桿菌O157∶H7、沙門氏菌和單增細胞李斯特菌能在水果組織中生長，比如蘋果［3，6-7］。因此，如何在加工過程中有效減少微生物污染，最大限度保持產(chǎn)品的安全性與品質(zhì)，延長貨架期，一直是鮮切果蔬加工中的關(guān)鍵性難題［8］。用消毒劑清洗產(chǎn)品是鮮切果蔬生產(chǎn)鏈中減少腐敗菌以及潛在病原菌的唯一途徑［9-10］。目前，鮮切果蔬加工過程中常用的消毒劑有臭氧［11］、雙氧水［12］和含氯制劑［13］等。雙氧水屬于低毒殺菌劑，使用量如果不當會對人體產(chǎn)生潛在的致癌性；臭氧雖能有效殺菌，但因為存在著殘留物發(fā)生氧化反應產(chǎn)生副產(chǎn)物的可能，其使用一直存在質(zhì)疑；含氯制劑因其對設備的腐蝕性及存在余氯殘留的危害，使用也受到一定限制［14］。

酸性電解水（acidic electrolyzed water，AEW）是由電解法產(chǎn)生的一種新型殺菌劑，相較于傳統(tǒng)的消毒劑，具有殺菌能力強、殺菌范圍廣、無污染、無殘留、對人體安全、制取方便、價格低廉等特點，近年來得到了越來越廣泛的關(guān)注［15］。至今，酸性電解水作為消毒劑已廣泛應用于研究以及實際生產(chǎn)中［16］。已有不少研究表明，酸性電解水能有效地減少或消除鮮切果蔬中的食源性病菌［17-21］。響應曲面法（response surface methodology，RSM）是統(tǒng)計、設計、試驗技術(shù)的合成，采用合理的試驗設計，能以最經(jīng)濟的方式，以很少的試驗數(shù)量和時間對實驗進行全面研究，它可以有效快速地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件，該法已經(jīng)廣泛地應用于各類條件優(yōu)化實踐中［22-23］。

本文主要報道的是酸性電解水對鮮切蘋果的殺菌工藝。在單因子試驗的基礎上，對影響減菌率的各因子NaCl質(zhì)量濃度、處理時間、處理溫度、液料比等進行了初步探究，再借助試驗設計軟件Design Expert（version 8.0.6），采用響應曲面法的中心組合設計（Central composite design，CCD），對各影響因子間的單一和交互作用等進行了較深入的研究，并優(yōu)化出最佳的減菌工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種金黃色葡萄球菌ATCC 6538、大腸桿菌ATCC 25922、沙門氏菌ATCC14028和單增李斯特菌ATCC 19115，菌株均為上海海洋大學食品學院保存菌株。以該4種常見的食源性致病菌的混合菌懸液模擬鮮切蘋果在流通過程中可能存在的細菌殘留情況。

1.1.2 培養(yǎng)基、試劑和設備胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA），購自北京陸橋技術(shù)有限責任公司；NaCl為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

FW-200型強AEW生成器，日本AMANO公司制造；SW-CJ-2F超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司制造；pH/ORP測定儀，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司制造；JT-B勻漿儀，漯河市金田實驗設備研究所研制；SX-500型高壓滅菌鍋，上海田源生物技術(shù)有限公司制造；QYC-2102C全溫培養(yǎng)搖床，上海滬粵明科學儀器有限公司制造；PYX-DHS恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠制造；還有移液槍等日常用工具。

1.2 方法

1.2.1 微生物總數(shù)測定采用GB 4789.2-2010《食品衛(wèi)生微生物學檢驗：菌落總數(shù)測定》方法進行測定［24］。

式（1）中：Y為減菌率/%；V為空白處理的蘋果切片微生物菌落總數(shù)/（CFU/g）；V1為酸性電解水浸泡處理的蘋果切片微生物菌落總數(shù)/（CFU/g）。

1.2.2 酸性電解水的制備采用二槽隔膜電解水裝置，通過調(diào)解電壓、電流、電解時間、電解液濃度等參數(shù)制得電解水。本實驗通過配置不同質(zhì)量濃度NaCl溶液電解15 min制得不同濃度酸性電解水。酸性電解水的物理指標包括：pH、氧化還原電位（ORP）和有效氯質(zhì)量濃度（ACC）。其中pH和ORP由pH/ORP測定儀測得，ACC采用碘量法滴定。本實驗所用酸性電解水的指標范圍為pH 2.32～2.57，ORP 1125～1188 mV，ACC 58～134 mg/L。

1.2.3 菌液的制備將50 μL甘油保藏的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌和單增李斯特菌分別接種到5 mL滅菌TSB上，（36±1）℃和150 r/min搖床培養(yǎng)（24±1）h活化，活化后取4種菌各1 mL于試管中混合，即為混合菌懸液，菌液濃度為8～9 lg CFU/mL。

1.2.4 樣品制備及樣品表面接種蘋果購自上海海洋大學共享區(qū)，品種為紅富士，使用前于4℃下貯藏。使用時去皮去核，用無菌刀于超凈工作臺內(nèi)切?。?0±1）g蘋果，待其溫度恢復至室溫后，正反面紫外照射殺菌各15 min。將上述菌懸液用1 mL移液槍滴加到蘋果切片表面0.5 mL，15 min后再滴加到另一側(cè)0.5 mL，于超凈臺放置30 min使細菌吸附在蘋果切片表面。蘋果切片最終菌落數(shù)約為4～5 lg CFU/g。

1.2.5 NaCl質(zhì)量濃度單因素試驗取上述接種過的蘋果切片，分別于8倍體積預熱至30℃的1、2、3、4、5 g/L和6 g/L NaCl產(chǎn)生的酸性電解水中浸泡5 min后取出，放入含質(zhì)量分數(shù)0.85%無菌生理鹽水90 mL的無菌勻漿儀中均質(zhì)1 min，然后選擇合適稀釋度用質(zhì)量分數(shù)0.85%無菌生理鹽水進行稀釋。取1 mL的稀釋液于無菌平皿內(nèi)，并將15～20 mL冷卻至46℃的TSA培養(yǎng)基傾注平皿，混合均勻，于（36±1）℃培養(yǎng)（24±1）h后計算菌落數(shù)。每個處理均做2個平行樣本，每個稀釋度重復2次。同時以不經(jīng)任何處理的蘋果切片作為減菌試驗的空白對照，計算減菌率。

1.2.6 處理溫度單因素試驗取上述接種過的蘋果切片，分別于8倍體積預熱至10、20、30、40、50℃和60℃的1 g/L NaCl產(chǎn)生的酸性電解水中，浸泡5 min后取出，然后分別進行菌落總數(shù)測定（方法同2.2.4），同時以不經(jīng)任何處理的蘋果切片作為減菌試驗的空白對照，計算減菌率。

1.2.7 處理時間單因素試驗取上述接種過的蘋果切片，分別于8倍體積預熱至30℃的1g/L NaCl產(chǎn)生的酸性電解水中，分別處理3、5、7、9、11、13 min后取出，然后分別進行菌落總數(shù)測定，同時以不經(jīng)任何處理的蘋果切片作為減菌試驗的空白對照，計算減菌率。

1.2.8 液料比單因素試驗取上述接種過的蘋果切片，分別于4、8、12、16、20和24倍體積預熱至30℃的由1 g/L NaCl產(chǎn)生的酸性電解水中浸泡5 min后取出，然后分別進行菌落總數(shù)測定，同時以不經(jīng)任何處理的蘋果切片作為減菌試驗的空白對照，計算減菌率。

1.2.9 響應曲面法試驗設計在單因素試驗的基礎上，根據(jù)Design Expert軟件中的中心組合試驗設計原理，對NaCl質(zhì)量濃度、處理時間、處理溫度和液料比4個因素設計響應曲面試驗以確定最優(yōu)的減菌工藝。以減菌率為響應值，自變量為NaCl質(zhì)量濃度、處理時間、處理溫度、液料比，分別以X1、X2、X3和X4來表示，并以+1、0、-1分別代表變量的水平，按方程

對自變量進行編碼，式（2）中xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實值，X0為實驗中心點處自變量的真實值，ΔX為自變量的變化步長。因素編碼及各自變量水平見表1。

表1 試驗因素水平及編碼Table 1Variables and experimental design levels for response surface

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 NaCl質(zhì)量濃度的選擇由圖1可見，隨著NaCl質(zhì)量濃度增加，蘋果切片減菌率逐漸增大，當NaCl質(zhì)量濃度大到4 g/L后，減菌率增加緩慢且曲線趨于平坦。由于高質(zhì)量濃度NaCl所產(chǎn)生的酸性電解水具有較高的ACC，從而可能會對蘋果切片的品質(zhì)造成一定的影響。綜合考慮成本、減菌效果和產(chǎn)品品質(zhì)，選擇NaCl溶液質(zhì)量濃度為4 g/L。

圖1 NaCl溶液質(zhì)量濃度對減菌率的影響Fig.1Effects of bacteria reduction of NaCl mass concentration

2.1.2 處理溫度的選擇由圖2可見，隨著處理溫度的增加，蘋果切片減菌率迅速增加，當溫度大于20℃后，減菌率稍微下降，但當溫度大于40℃后減菌率又有所上升，這可能是溫度過高導致細菌部分失活，從而導致減菌率增加?？紤]到高溫會影響到蘋果本身的感官品質(zhì)，因而選擇處理溫度20℃比較合適。

圖2 處理溫度對減菌率的影響Fig.2Effects of bacteria reduction of treatment temperature

2.1.3 處理時間的選擇由圖3可知，在處理時間7 min內(nèi)，蘋果切片減菌率增加明顯，但隨著處理時間繼續(xù)延長，蘋果切片減菌率增加趨于平緩。因此，選擇浸泡時間7 min比較合適。

圖3 處理時間對減菌率的影響Fig.3Effects of bacteria reduction of treatment time

2.1.4 液料比的選擇由圖4可以看出，液料比的增加對蘋果減菌率有明顯的效果，在液料比為8∶1（mL/g）時減菌率基本上達到最大值，之后隨著液料比的繼續(xù)增加，減菌率又略有下降，但不明顯，這可能是蘋果切片與酸性電解水的接觸面積有限，從而一定程度上限制了減菌的效果。

2.2 響應面試驗結(jié)果與分析

2.2.1 試驗結(jié)果綜合考慮各種因素對減菌率的影響，采用中心組合設計（CCD）對減菌工藝進行四因素優(yōu)化試驗設計，試驗結(jié)果見表2。

圖4 液料比對減菌率的影響Fig.4Effects of bacteria reduction of solid-liquid ratio

表2 CCD試驗設計及響應值的實測和預測值Table 2CCD design matrix along with the experimental and predicted values of Y

2.2.2 模型的建立及其顯著性檢驗利用Design Expert軟件，通過表2中試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得減菌率對編碼自變量NaCl質(zhì)量濃度、處理溫度、處理時間、液料比的二次多元回歸方程：

從該模型的方差分析（表3）可見，本試驗所選用的二次多項模型具有高度的顯著性（Pmodel＜0.01），而失擬項不顯著（P=0.219 8＞0.05）。且模型的復相關(guān)系數(shù)R2為96.59%，大于90%，說明回歸方程的擬合程度很好，試驗誤差小，不存在模型擬合不足的情況，因此該響應面能夠較真實地反映試驗結(jié)果。

表3 二次回歸模型的方差分析結(jié)果Table3Varianceanalysisforthefittedquadraticpolynomial

2.2.3 蘋果切片減菌率的響應面分析與優(yōu)化根據(jù)回歸模型作出相應的響應面和等高線，見圖5—7。當處理時間為7 min，液料比為8∶1（mL/g）時，NaCl溶液質(zhì)量濃度和處理溫度對減菌率的影響見圖5?？梢钥闯?，隨著NaCl溶液質(zhì)量濃度、處理溫度的增大，減菌率也不斷增加。當溫度為20℃，液料比為8∶1（mL/g）時，NaCl溶液質(zhì)量濃度和處理時間對減菌率的影響見圖6?？芍S著NaCl溶液質(zhì)量濃度的增加，減菌率不斷增加。在處理時間5～7 min的范圍內(nèi)，減菌率不斷增加，之后隨著處理時間的延長，減菌率有下降的趨勢。

當NaCl溶液質(zhì)量濃度為4 g/L，處理時間為7 min時，處理溫度和液料比對減菌率的影響見圖7。從圖7可以看出，處理溫度15～25℃的范圍內(nèi)減菌率變化不太明顯。而液料比6∶1～10∶1（mL/g）的范圍內(nèi)，減菌率則是逐漸較少。

通過軟件分析，得到蘋果切片殺菌的最佳條件為NaCl溶液質(zhì)量濃度4.5 g/L，處理溫度25℃，處理時間6.45 min，液料比6∶1（mL/g），在此條件下減菌率的理論值為93.54%。在此優(yōu)化條件下進行3次平行實驗，得到的實際平均減菌率為91.84%，其相對誤差不到1%，因此基于響應曲面法所得的優(yōu)化減菌工藝參數(shù)準確可靠，得到的鮮切蘋果減菌條件具有實際應用價值。

2.3 酸性電解水處理對鮮切蘋果品質(zhì)的影響

將4.5 g/L NaCl電解得到的AEW與自來水對樣品的處理結(jié)果作比較，同時以未處理組為空白，于25℃下，以6∶1（mL/g）的液料比浸泡鮮切蘋果6.45 min，測定各處理后鮮切蘋果的pH值、可溶性固形物含量和維生素C含量，其結(jié)果見表4。

圖5 NaCl溶液質(zhì)量濃度和處理溫度對減菌率影響的響應面圖和等高線圖Fig.5Response surface plot and contour plot describing the interactive effect of NaCl mass concentration and treatment temperature on bacteria deduction

圖6 NaCl溶液質(zhì)量濃度和處理時間對減菌率影響的響應面圖和等高線圖Fig.6Respons e surface plot and contour plot describing the interactive effect of NaCl mass concentration and treatment time on bacteria deduction

圖7 處理溫度和液料比對減菌率影響的響應面圖和等高線圖Fig.7Respons e surface plot and contour plot describing the interactive effect of treatment temperature and solid-liquid ratio on bacteria deduction

表4 不同清洗方式對蘋果品質(zhì)的影響Table 4Effects of different washing methods on the quality of fresh-cut apples

由表4可知，AEW處理后，鮮切蘋果的pH值與空白組相差不大，雖然可溶性固形物含量較空白組有所下降，但與自來水處理組相近，同時AEW處理能更好地抑制維生素C的降解。比較3 h內(nèi)鮮切蘋果的褐變情況，樣品處理后空白組已顯示輕微褐變，自來水組與AEW組均無褐變；3 h時，空白組已嚴重褐變，自來水組輕微褐變，而AEW組仍具有良好的色澤，故而推測AEW處理可以有效地抑制鮮切蘋果的褐變。

3 結(jié)語

在單因素試驗的基礎上，運用響應面分析法對蘋果切片減菌工藝進行優(yōu)化。得到最優(yōu)工藝條件為：NaCl溶液質(zhì)量濃度4.5 g/L，處理溫度25℃，處理時間6.45 min，液料比6∶1（mL/g），在此條件下經(jīng)處理后細菌總數(shù)由1.14×105CFU/g降為9.3×103CFU/g，減菌率可達91.84%。同時，該處理對鮮切蘋果的pH值和可溶性固形物影響不大，且能較好地抑制維生素C的降解及其表面的褐變。

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Response Surface Methodology for Optimization of Sterilization Effect on Fresh-Cut Apple Treated with Acidic Electrolyzed Water

YU Xiaoxia，LI Yan，WANG Tingting，SONG Xing
（College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

The sterilization effect of acidic electrolyzed water on fresh-cut apple against Staphylococcus aureus，Escherichia coli，salmonella and Listeria monocytogenes cells was studied by response surface methodology and a central composite design with one-factor-at-a-time.Studied variables of NaCl concentration，time，temperature and solid-liquid ratio were selected for the determination of optimal conditions with bactericidal ability evaluated.The optimal conditions were found to be as follows：6：1 liquid-solid ratio（mL/g）and 4.5 g/L NaCl treated under 25℃for 6.45 min.Under these conditions，the total bacteria count was reduced from 1.14×105CFU/g to 9.3×103CFU/g and the reduction rate of bacteria was up to 91.84%.Moreover，this treatment slightly affected the pH value and the soluble solid contents of fresh-cut apples，while effectively inhibited the degradation of vitamin c and provided surface browning control.

fresh-cut apple，response surface methodology，central composite design，optimization

TS201.6

A

1673—1689（2015）06—0653—07

2014-05-28

上海市科委工程中心建設項目（11DZ2280300）

*通訊作者：李燕（1965-），女，天津人，工學碩士，教授，主要從事生物活性物質(zhì)的提取及應用，以及食品應用化學的研究。E-mail：liyan@shou.edu.cn