李文媛++劉艷翠++尹國華++馮克儉++王瑩

[摘要]目的探討膠質(zhì)和鈣結(jié)合EGF區(qū)域l（Collagen and calcium binding EGF domains 1，Ccbel）病毒對人喉癌細胞系Hep-2細胞增殖及血管內(nèi)皮生長因子-C（vessel endothelium growth factor C，VEGF-C）表達的影響。方法用lxl02，lxl04，lxl0⁶pfu/mL的Ccbel腺病毒作用喉癌Hep-2細胞，細胞分為對照組（PBS），Ccbel病毒高、中、低劑量組。觀察各組細胞增殖情況，采用PCR檢測各組細胞VEGF-C mRNA的表達水平。結(jié)果與對照組比較，Ccbel病毒各劑量組細胞增殖顯著增高，VEGF-CmRNA表達水平顯著上升，且均有顯著劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論Ccbel病毒可能通過上調(diào)淋巴管生成因子VEGF-C表達促進喉癌細胞增殖和淋巴管生成。

[關(guān)鍵詞]Ccbel病毒；VEGF-C：喉癌；Hep-2細胞

[中圖分類號]R739.65

[文獻標識碼]A

[文章編號]1674-0742（2015）07（c）-0010-03

喉癌是我國東北地區(qū)最為常見的耳鼻咽喉科惡性腫瘤。發(fā)病率高，危害大。近年來，隨著分子生物學和細胞學的發(fā)展，一系列關(guān)于喉癌發(fā)病與治療的相關(guān)機制得到探討。目前發(fā)現(xiàn)多種淋巴管生成因子參與喉癌的生長與淋巴管轉(zhuǎn)移，有研究表明Ccbel（膠原和鈣結(jié)合蛋白表皮生長因子-域-1）作為新發(fā)現(xiàn)的一種淋巴管生成因子，在斑馬魚胚胎期進行Ccbel基因沉默后，其淋巴管和血管完全喪失。但關(guān)于Ccbel對腫瘤細胞的影響尚不清楚。該實驗在2014年3月-2014年6月期間通過觀察Ccbel病毒對喉癌Hep-2細胞增殖及VEGF-C的表達的影響，探討Ccbel對腫瘤細胞淋巴管生成的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

實驗時間：2014年3月-2014年6月。胎牛血清（美國Hy-clon公司），CCK-8法（美國Sigma公司），PCR試劑盒（Invitrogen公司）；引物設計（大連寶生物公司）。

1.2 細胞株培養(yǎng)和病毒干預分組

人喉癌細胞株Hep-2（中國科學院上海細胞生物研究所），依據(jù)參考文獻進行培養(yǎng)，RPMI1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清），至對數(shù)期進行實驗，制成單細胞懸液（4xl0⁵/mL）。Ccbel病毒（Ccbel Adenovirus Mouse，購于美國abm公司，No.80829A），實驗分為空白對照組（PBS），Ccbel低劑量組（lxl0² pfu/mL），Ccbel中劑量組（lxl0⁴pfu/mL），Ccbel高劑量組（lxl0⁶pfu/mL）。

1.3 CCK-8法檢測

取各組單細胞懸液種植于96孔培養(yǎng)板（每孔100μL），培養(yǎng)48h后加入10μL的CCK-8溶液（sigma公司），常規(guī)CCK-8法檢測，酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測每孔的吸光度值（OD490）。

1.4 實時熒光定量PCR檢測

總RNA提取，采用Pollmann等嗍報道方法進行PCR反轉(zhuǎn)錄、檢測及熒光定量分析。VEGF-C以及β-actin的引物的序列為：VEGF-C，上游5'-CTACAGATGTGGGGGTTGCT-3'，下游5'-CATCCAGCTCCUGTTTGGT-3'；NF-KB，上游5'-GAAGAAGC-GAGACCTGGA-3'，下游5'-TCCGGAACACAATGGCCA-3'；β-actin，上游5'-TGGTGGGTATGGGTCAGAAGGACTC-3'，下游5'-CATGGCTGGGGTGTTGAAGGTCTCA-3'，分析方法利用2-AA cr方法。

1.5 統(tǒng)計方法

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料連續(xù)型變量采用（X±S）表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Ccbel對Hep-2細胞增殖的影響

培養(yǎng)ld后，與對照組相比，Ccbel各干預組能夠顯著促進Hep-2細胞生長，中劑量組和高劑量增殖高于低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），培養(yǎng)3 d和Sd后，Ccbel各干預組增殖增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），其中Ccbel高劑量組較中劑量組和低劑量組增殖更為顯著，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。其促進作用呈濃度依賴性（見表1）。

2.2 各組細胞VEGF-C mRNA相對表達水平比較

與對照組比較，Ccbel病毒低、中、高劑量組VEGF-C mRNA相對表達水平顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中Ccbel病毒高劑量組VEGF-C mRNA相對表達水平顯著高于Ccbel病毒低、中劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

3 討論

喉癌是耳鼻咽喉科最常見的惡性腫瘤，在我國東北地區(qū)發(fā)病率逐年上升，其中近95%患者為鱗狀上皮癌，其細胞系為hep-2細胞，盡管近年來相關(guān)治療如激光切除術(shù)和化學藥物治療已取得了較大進展，但淋巴管轉(zhuǎn)移和復發(fā)率仍高達20%，因此，開發(fā)新的有效治療喉癌淋巴管轉(zhuǎn)移的方法已尤為迫切。

以往研究已經(jīng)證實喉癌中VEGF-C表達上調(diào)，但對于VEGF-C在喉癌細胞系方面的研究仍存在爭議翻。VEGF-C能夠選擇性增強淋巴管內(nèi)皮細胞有絲分裂；刺激內(nèi)皮細胞增生并促進淋巴管生成；參與淋巴管外基質(zhì)重塑。到目前為止已有大量的研究證明在胚胎發(fā)育、組織再生和腫瘤的生長過程VEGF-C在淋巴管新生過程中有極其重要的作用。最近發(fā)現(xiàn)的分泌蛋白Ccbel是淋巴管生成不可或缺的重要生成因子。研究發(fā)現(xiàn)在斑馬魚、小鼠和人類.Ccbel基因突變導致淋巴管增生和淋巴水腫（Hennekam綜合征），Ccbel促進淋巴管新生并且可能參與腫瘤細胞的增殖。此外，發(fā)現(xiàn)胚胎期在一些組織Ccbel和其他的淋巴管生成因子表達下降，并證實Ccbel能夠獨立調(diào)節(jié)淋巴管生成。但Le等發(fā)現(xiàn)Ccbel在卵巢癌細胞株中顯著下調(diào)，與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展呈負相關(guān)。前期研究證實喉癌中Ccbel表達顯著增高，參與喉癌淋巴管生成和血管生成，該研究從體外實驗探討Ccbel的作用機制。

Jeltsch表明Ccbel是VEGF-C活化的必要條件，VEGF-C信號通路可能是Ccbel作用的重要下游信號通路。該研究CCK-8法結(jié)果表明，Ccbel各干預組能夠顯著促進Hep-2細胞生長，其中3d和5d.Ccbel高劑量組較中劑量組和低劑量組增殖更為顯著，顯示Ccbel干預組能夠顯著促進喉癌hep-2細胞增殖，并具有濃度依賴性，證實了Ccbel能夠促進Hep-2細胞增殖能力，這與Pollmann等的研究結(jié)果相一致。但Ccbel的作用機制目前尚不明確，該研究發(fā)現(xiàn)與對照組比較.Ccbel病毒各劑量組VEGF-C mRNA表達水平均顯著上升，其中Ccbel病毒高劑量組VEGF-C mRNA相對表達水平顯著高于Ccbel病毒低、中劑量組，高于對照組4～5倍，VEGF-C是重要的淋巴管生成因子，因此我們推測Cebel可能通過上調(diào)VEGF-C信號通路發(fā)揮作用。

綜上所述，該研究證實了Ccbel能夠上調(diào)喉癌hep-2細胞中VEGF-C表達，提示Ccbel可能通過活化VEGF-C.促進喉癌細胞增殖和淋巴管轉(zhuǎn)移。