胡 靚，秦 臻，王 琴，李 蓉，王 平*

（1.浙江大學(xué)生物傳感器國家專業(yè)實驗室，生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點實驗室，生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院，杭州 310027；2.中科院傳感技術(shù)國家重點實驗室，上海 200050）

海馬神經(jīng)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)傳感器及其記錄5-HT對網(wǎng)絡(luò)活動的作用*

胡 靚1，2，秦 臻1，王 琴1，李 蓉1，王 平1，2*

（1.浙江大學(xué)生物傳感器國家專業(yè)實驗室，生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點實驗室，生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院，杭州 310027；2.中科院傳感技術(shù)國家重點實驗室，上海 200050）

海馬神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動在調(diào)節(jié)記憶和學(xué)習(xí)等行為中具有重要作用，而五羥色胺是調(diào)節(jié)此類行為的重要神經(jīng)遞質(zhì)。目前，某些研究手段揭示了5-HT對海馬神經(jīng)元活動的作用，但是這些手段并沒有直觀展示海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的電生理活動。因此，為了研究5-HT在體外海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)活動中的作用，本實驗建立了微電極陣列（Microelectrode Array，MEA）的檢測平臺。利用60通道MEA芯片，可以實時無損地記錄5-HT作用前后的多位點信號，實驗結(jié)果證明5-HT對海馬神經(jīng)元的動作電位有抑制作用，但是對低頻振蕩沒有明顯變化。該實驗表明，這種海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)傳感器可以對神經(jīng)元進行無損、長時間的記錄。上述研究結(jié)果表明，這種新的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)傳感器有望成為神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)活動研究中的一種重要手段。

生物傳感器；海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)；微電極陣列（MEA）；神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)活動；5羥色胺；網(wǎng)絡(luò)振蕩

海馬神經(jīng)元的生理活動在調(diào)節(jié)記憶和學(xué)習(xí)等行為上具有重要作用。研究表明，海馬神經(jīng)元活動可以被某些神經(jīng)遞質(zhì)興奮或者抑制，進而產(chǎn)生不同的電生理發(fā)放模式。這些不同的發(fā)放模式可能代表大腦功能的不同處理階段［1-3］。還有研究表明，異常神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動如癲癇樣放電可能造成海馬神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能障礙，進而導(dǎo)致如Alzheimer癥等記憶受損癥［4-5］。因此非常有必要研究海馬神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動來了解更多大腦工作的方式。

另外，在上個世紀(jì)90年代，海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)作為傳感器敏感單元，已經(jīng)被體外培養(yǎng)在微電極陣列表面來檢測一些毒素及化學(xué)物質(zhì)。通過改變自發(fā)活動模式，神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)能對大量具有神經(jīng)活性的物質(zhì)進行響應(yīng)，且具有相當(dāng)高的靈敏度［6-8］。研究結(jié)果表明，體外培養(yǎng)的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)可以保持電生理和藥理活性長達9個月，有利于進行長時程檢測。以神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)作為敏感單元的生物傳感器在對藥物，毒素和氣味物質(zhì)的檢測中具有良好表現(xiàn)。但是，以上研究中通常采用的是海馬組織或者神經(jīng)元，對其所檢測的物質(zhì)的信號傳導(dǎo)機理和編碼缺乏認(rèn)識和研究，其網(wǎng)絡(luò)的特異性和功能性應(yīng)用方面的研究也比較少。因此本實驗研究了體外神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)中的信號傳導(dǎo)。

在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中，5-HT是一種廣泛分布的神經(jīng)遞質(zhì)，參與調(diào)節(jié)人類情感，攝食等行為。5-HT受體主要分布于腦區(qū)，尤其是海馬區(qū)，皮層和基底神經(jīng)節(jié)等區(qū)域［9］。幾乎所有的5-HT受體亞基都在海馬區(qū)表達，5-HT受體在海馬神經(jīng)元中對神經(jīng)元活動具有抑制性調(diào)節(jié)作用［10-11］，5-HT受體對海馬神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)振蕩也有調(diào)節(jié)作用［12-13］。因此不同于傳統(tǒng)的在體記錄方式［14］，本實驗采用體外多點記錄方式，對體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)胞外電生理活動進行。該方法降低了海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜度，為研究細(xì)胞間信號傳播提供了簡便的檢測方法。

圖1 MEA芯片

本研究采用微陣列電極技術(shù)，建立了一個胞外電生理記錄平臺。這種方法可以實時無損地記錄神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)多點信息，為研究體外神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)活動提供了大量信息。同時，單個神經(jīng)元的電生理活動也可以同時采集。在以往的研究中，我們已經(jīng)將這種技術(shù)應(yīng)用于生物組織例如嗅黏膜或嗅球切片的電生理記錄［15-16］。這種基于生物組織的復(fù)合傳感方式對刺激具有良好的靈敏度和特異性。而本實驗中，采用體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的方式，相較于生物組織切片而言，降低了網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜度，便于實驗觀察和分析信號。

1 實驗方法

1.1 MEA芯片加工

采用標(biāo)準(zhǔn)微加工技術(shù)制備MEA芯片。首先，將一層30 nm鈦層和一層300 nm金層分別沉積到玻璃基底上，作為粘附層和電極層。采用光蝕刻技術(shù)蝕刻出電極位點和引線的布局。除去光刻膠后沉積一層1 μm Si3N4作為鈍化層，再用KOH暴露出電極和焊盤。將用金線將芯片上的焊盤和PCB上的接口連接，用環(huán)氧膠將細(xì)胞培養(yǎng)腔固定在芯片上（圖1（a））。

如圖1（b）所示，MEA芯片為8×8陣列排布。單個電極大小為20 μm，電極間距為150 μm。60個電極作為記錄電極。實驗前對電極表面電鍍鉑黑，采用交流阻抗譜評估鉑黑的效果。結(jié)果表明，電鍍鉑黑明顯降低低頻段阻抗（圖1（c））。該結(jié)果與基于MONTECARLO模型的結(jié)果一致，證明納米顆粒的沉積具有降低電極阻抗的作用，有利于提高性噪比［17］。

1.2 海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的培養(yǎng)

選取出生1 d～2 d的SD乳鼠，斷頭取腦。取海馬組織剪碎后置于含有3 g/L滅火牛血清的HBSS溶液中，用0.25%胰酶消化15 min。用200孔/inch的細(xì)胞篩將分離的細(xì)胞加入含有10%滅火牛血清的DMEM制成懸浮液，隨后加入MEA培養(yǎng)腔中進行培養(yǎng)。細(xì)胞接種密度為104個/cm2。培養(yǎng)液每兩天更換一次，七天后初步形成海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，便可以進行實驗。

1.3 MEA檢測神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)電位

MEA檢測海馬神經(jīng)元電位的原理圖如圖2所示。采用MEA-1060（Multi Channels Systems，Germany）采集放大系統(tǒng)進行實時記錄神經(jīng)元電位信號。采樣率為10 kHz，Ag/AgCl電極作為參考電極。首先，記錄磷酸鹽酸緩沖液（PBS）中海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的自發(fā)放電位10 min。然后移除PBS溶液，加入100 μM的5-HT溶液，檢測海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)在5-HT刺激下的響應(yīng)。最后，洗脫5-HT溶液，換成PBS環(huán)境下檢測神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的發(fā)放。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用MC-Rack軟件記錄采集并放大后的60通道海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)發(fā)放電位。采用Butterworth帶通濾波器對原始信號進行濾波（100 Hz～300 Hz），觀察動作電位發(fā)放情況。對每個試驗階段（自發(fā)狀態(tài)，5-HT處理，5-HT洗脫）下60通道中記錄到神經(jīng)點發(fā)放活動的通道數(shù)進行統(tǒng)計，作為活躍通道數(shù)，來評價5-HT的抑制作用。采用Clampfit對3個實驗階段的原始信號進行頻譜分析，觀察低頻狀態(tài)下的網(wǎng)絡(luò)振蕩狀態(tài)。

圖2 采用多位點電生理檢測平臺記錄5-HT對海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)活動的原理圖。

2 實驗結(jié)果

2.1 海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的培養(yǎng)

圖3為在MEA芯片表面培養(yǎng)6 d所形成的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)。海馬神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞能從軸突這個特征中很好的區(qū)分開來。海馬神經(jīng)元具有兩極或三極的形狀，并和周圍的神經(jīng)元通過突觸相連接。而膠質(zhì)細(xì)胞作為支持細(xì)胞，沒有軸突的形成。

圖3 海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)和膠質(zhì)細(xì)胞

2.2 海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)自發(fā)活動的特點

首先，根據(jù)電極的排布位置和實驗記錄的數(shù)據(jù)，得出了自發(fā)狀態(tài)下神經(jīng)沖動傳導(dǎo)速度。通過發(fā)放模式特征和位置，同一個網(wǎng)絡(luò)中的不同神經(jīng)元的信號被歸類出來；統(tǒng)計相鄰電極上記錄到信號的延時，除以電極間的距離，得到神經(jīng)沖動傳導(dǎo)的速度。自發(fā)狀態(tài)下，神經(jīng)沖動傳播速度大約為1.4 cm/s，而在無髓鞘神經(jīng)纖維上神經(jīng)沖動的傳播速率大約為20 cm/s～35 cm/s［18］。這主要是由于體外培養(yǎng)的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)在生理活性較低造成。且神經(jīng)電興奮在突觸間傳播速度比在神經(jīng)纖維上的傳導(dǎo)速度更低。其次，我們分析了自發(fā)狀態(tài)下海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的振蕩特性。在實驗中可以觀察到大量的網(wǎng)絡(luò)同步振蕩活動（圖4（a）。通過頻譜分析發(fā)現(xiàn)主要為theta、alpha、beta振蕩（圖5）。

2.3 5-HT對海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的抑制效應(yīng)

為了研究5-HT對海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的作用，實驗記錄了網(wǎng)絡(luò)對100 μM 5-HT的響應(yīng)。在檢測到自發(fā)響應(yīng)的海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)中加入5-HT進行刺激，神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)活動（5次）表現(xiàn)出幾乎完全被抑制的現(xiàn)象。而將5-HT洗脫后，神經(jīng)元的動作電位活動又迅速恢復(fù)（圖4（a）?；钴S通道數(shù)統(tǒng)計也證明了100 μM 5-HT的抑制作用（圖4（b）。

圖4 海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)活動在5-HT作用下的響應(yīng)

高頻電生理信號體現(xiàn)了單個神經(jīng)元的動作電位發(fā)放，而低頻的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)振蕩則體現(xiàn)了神經(jīng)元之間的相互作用。神經(jīng)振蕩是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在的一種節(jié)律性，本實驗中的低頻神經(jīng)振蕩屬于局部場電位，是由大量神經(jīng)元同步發(fā)放引起的振蕩活動。圖5中頻譜分析結(jié)果顯示，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的振蕩頻率主要成分在theta和beta頻段，且在5-HT刺激前后振蕩頻率并沒有明顯改變。

圖5 低頻網(wǎng)絡(luò)振蕩頻率在5-HT作用前后無明顯變化

3 討論

本文通過結(jié)合體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，建立了一個簡化的海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，并分析了海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)響應(yīng)信號的時域和空間特點。研究表明單個海馬神經(jīng)元活動在不同頻段振蕩表明了神經(jīng)元的一種內(nèi)在能力，這種能力是協(xié)調(diào)網(wǎng)絡(luò)活動的基礎(chǔ)。在本研究中，單個海馬神經(jīng)元的自發(fā)放頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在體檢測的神經(jīng)元發(fā)放頻率（低于1 spike/s）［19］。這種顯著差別可能來源于兩種檢測方式的差別。在體檢測中，微電極陣列植入海馬可能會引起神經(jīng)組織的損傷，導(dǎo)致神經(jīng)元活動的減弱。而離體的MEA芯片對神經(jīng)元是無損的，可以進行長時程檢測。另外，貼附在MEA芯片表面的神經(jīng)元比在體情況下神經(jīng)元和電極的接觸更為緊密。體外培養(yǎng)的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)可能比在體的神經(jīng)組織活動更為活躍。

實驗中海馬神經(jīng)元的動作電位被5-HT幾乎完全抑制，這也與以往報道的結(jié)果一致。這個結(jié)果和文獻報道一致，即5-HT1A受體激動劑和5-HT自身都能抑制大鼠海馬區(qū)的神經(jīng)元活動。這種抑制效應(yīng)可以通過選擇性或非選擇性的5-HT1A受體拮抗劑阻斷。研究報道，5-HT能誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元超極化，并通過激活鉀通道來增加抑制性突觸后電位［20］。同時，5-HT通過與5-HT1A受體作用，能激發(fā)GABA能中間神經(jīng)元，增加抑制性突出后電位的形成，從而降低神經(jīng)元的發(fā)放活動［21］。

實驗中海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)出現(xiàn)了同步振蕩的電生理活動。同步振蕩是一種最基本的網(wǎng)絡(luò)活動，海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的一個重要特征就是能產(chǎn)生有節(jié)律性的振動。本實驗中，theta，beta振蕩共同存在于海馬神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)振蕩中。同步的theta/beta網(wǎng)絡(luò)振蕩可能表明了未成熟的腦皮層形成早期功能性網(wǎng)絡(luò)的內(nèi)源性能力。海馬神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的振蕩頻率范圍可能對海馬神經(jīng)信號的編碼解碼研究提供信息。5-HT對調(diào)節(jié)theta節(jié)律具有重要作用，而本實驗中直接對海馬神經(jīng)元施加5-HT刺激，對并沒有明顯改變海馬神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的振蕩頻率。目前具體的機制并不清楚，但是有多種可能的原因。首先，實驗中直接施加5-HT刺激于體外培養(yǎng)的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，相比于以往的研究采用腹膜下注射等系統(tǒng)性輸入方式，也許缺乏某些能和5-HT作用來調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)振蕩的效應(yīng)器。5-HT調(diào)節(jié)在體海馬theta振蕩主要是由于調(diào)節(jié)GABA能和膽堿能神經(jīng)元的抑制/興奮平衡來影響網(wǎng)絡(luò)振蕩。而體外培養(yǎng)的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)振蕩可能缺乏與這些中間神經(jīng)元的相互作用。另外，實驗中采用的體外培養(yǎng)的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)還處于網(wǎng)絡(luò)形成初期（7 d左右），神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的功能性連接可能還不成熟，因此對5-HT也無法響應(yīng)。

4 結(jié)論

通過培養(yǎng)海馬通路神經(jīng)元，構(gòu)建了一種新的海馬細(xì)胞神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)傳感器。實驗結(jié)果表明，多點記錄的MEA傳感器可以有效記錄海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的胞外電位和振蕩活動，具有無損和長時程連續(xù)測量的優(yōu)勢。另外，實驗結(jié)果證明，5-HT能抑制海馬神經(jīng)元動作電位的方法，但是對體外培養(yǎng)的初級海馬神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)振蕩頻率沒有明顯變化。在后續(xù)的研究中，我們將探索如何將海馬神經(jīng)元更好地貼附于微電極表面上，以提高傳感器的穩(wěn)定性，靈敏度和可重復(fù)性。在實驗室同事以前的工作中，采用共自組裝單體層（SAM）技術(shù)來修飾細(xì)胞傳感器的電極表面，提高了傳感器的生物相容性，并成功將細(xì)胞固定在目標(biāo)位置［22］。另外，對于海馬神經(jīng)元的生理特性，還可以采用其他手段進行多參數(shù)觀測，如熒光探針技術(shù)［23］，電化學(xué)阻抗［24］，膜片鉗傳感器［25］等。

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胡 靚（1988-），女，博士研究生，浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與儀器學(xué)院。主要研究方向為生物傳感器，味覺傳感器，huliang1226@zju.edu.cn；

王 平（1962-），男，博士，教授，浙江大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院、生物傳感器國家專業(yè)實驗室主任、生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點實驗室主任國家杰出青年科學(xué)基金獲得者。主要研究方向傳感器與檢測技術(shù)，生物芯片于生物電子學(xué)，人工嗅覺與人工味覺，cnpwang@zju.edu.cn。

Hippocampal Neuronal Network Biosensor and Its Application in Recording Network Activity with 5-HT Stimulation*

HU Liang1，2，QI Zhen1，WANG Qing1，LI Rong1，WANG Ping1，2*
（1.Biosensor National Special Laboratory，Key Laboratory of Biomedical Engineering of Education Ministry，Department of Biomedical Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China；2.State Key Laboratory of Transducer Technology，Shanghai 200050，China）

Hippocampal neural activities have been proved to play important roles in various behaviors such as memoryand learning. 5-hydroxytryptamine（5-HT）isoneimportantneuraltransmitterinvolved in theseprocesses.Currently， some approaches revealed part of 5-HT effect on hippocampal activities；however，they did not illustrate the visual and direct electrophysiological activities in hippocampal neural networks. Thus，a microelectrode array （MEA） sensing platform were established in order to investigate the effect of 5-HT on simplified hippocampal neuronal networks （HNNs） in vitro. Taking advantage of our self-designed 60-channel MEA chip，multi-site electrophysiological signals of the HNNs can be recorded simultaneously in a non-invasive and convenient way. Experimental results confirmed that 100 μM 5- HT completely abolished the action potentials of hippocampal neurons but has little effect on the low frequency oscillation. This study suggests this HNN-based biosensor can monitor and record neuronal electrophysiology in a long term. Andthismulti-sitesensingplatform becomesapromisingapproachinthestudyofneuronalnetworkactivity.

biosensor；hippocampal neuronal network；microelectrode array（MEA）；neuronal network activity；5-hydroxytryptamine（5-HT）；network oscillation EEACC：7230

TP393

A

1004-1699（2015）07-0947-06

10.3969/j.issn.1004-1699.2015.07.001

項目來源：國家自然科學(xué)基金項目（30970765）；教育部博士點基金項目（20120101130011）

2014-10-27 修改日期：2015-04-09