梁恩利，吳長(zhǎng)利，王瑩，胡海龍，田大偉

專題研究·腫瘤基因與臨床

CCNE1、RIP2基因多態(tài)性與膀胱癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

梁恩利，吳長(zhǎng)利△，王瑩，胡海龍，田大偉

目的細(xì)胞周期蛋白E1（CCNE1）基因和受體相互作用蛋白2（RIP2）基因區(qū)域分別存在多態(tài)性位點(diǎn)rs8102137和rs42490，探討這2種多態(tài)性與膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及膀胱癌的病理分級(jí)和分期之間的關(guān)系。方法收集膀胱癌患者（膀胱癌組）176例及非腫瘤體檢患者（對(duì)照組）210例血樣本并提取DNA，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）測(cè)序方法檢測(cè)CCNE1（rs8102137）和RIP2（rs42490）的多態(tài)性。根據(jù)術(shù)后病理結(jié)果確定膀胱癌患者的分級(jí)及分期。分析膀胱癌組和對(duì)照組中等位基因和基因型的分布差異。對(duì)2組間基因型的分布情況進(jìn)行比較，分析CCNE1（rs8102137）和RIP2（rs42490）各基因型與膀胱癌患者的臨床資料間的關(guān)系，及與膀胱癌遺傳易感性的關(guān)系。結(jié)果對(duì)照組樣本的基因型分布具有良好的群體代表性。CCNE1（rs8102137）突變型（C/T+C/C）在膀胱癌組中頻率（40.91%）高于對(duì)照組（30.95%，OR=1.54，95%CI：1.02～2.45，P＜0.05）。RIP2（rs42490）突變型（A/G+G/G）在膀胱癌組頻率（72.73%）高于對(duì)照組（62.38%，OR=1.61，95%CI：1.04～2.48，P＜0.05）。不同膀胱癌病理分級(jí)、分期患者的CCNE1（rs8102137）和RIP2（rs42490）基因多態(tài)性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論CCNE1（rs8102137）、RIP2（rs42490）基因型與膀胱癌易感性關(guān)系密切，攜帶突變型等位基因的個(gè)體患膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于野生型個(gè)體。

膀胱腫瘤；多態(tài)現(xiàn)象，遺傳；基因；細(xì)胞周期蛋白E；受體相互作用蛋白2

世界范圍內(nèi)，膀胱癌發(fā)病率位居常見惡性腫瘤的第9位［1］。2012年美國(guó)常見惡性腫瘤發(fā)病率排名中，膀胱癌位居第6位（新發(fā)73 510例，死亡14 880例）［2］。膀胱癌的發(fā)病率在我國(guó)所有惡性腫瘤中列第10位，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)［3］。本研究旨在探討細(xì)胞周期蛋白E1（CCNE1）、受體相互作用蛋白2（RIP2）基因多態(tài)性與膀胱癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及病理分級(jí)、分期之間的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象本研究課題獲得天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。膀胱癌組為2013年2月—12月我科病理證實(shí)為膀胱尿路上皮癌患者176例，男142例，女34例，年齡（64.36±12.04）歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：曾經(jīng)患過惡性腫瘤、未知原發(fā)灶的轉(zhuǎn)移癌、接受過化療或放療的患者。對(duì)照組為2013年10月—2014年1月于我院非腫瘤體檢者，共210例，男171例，女39例，年齡（66.35±10.91）歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有精神疾病、近期接受過輸血治療。2組性別（χ2=0.035）、年齡（t= 1.314）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。標(biāo)本均為化驗(yàn)血常規(guī)后廢棄的1 mL EDTA抗凝血液標(biāo)本。

1.2 病理分組腫瘤病理分期根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟2009年第7版TNM分期法進(jìn)行，分為非肌層浸潤(rùn)型膀胱尿路上皮癌（pTa-pT1）和肌層浸潤(rùn)型膀胱尿路上皮癌（pT2-pT4）；腫瘤病理分級(jí)根據(jù)WHO 2004膀胱尿路上皮癌惡性程度分級(jí)系統(tǒng)進(jìn)行，分為低度惡性傾向尿路上皮乳頭狀瘤、尿路上皮乳頭狀癌低級(jí)別、尿路上皮乳頭狀癌高級(jí)別，考慮到低度惡性潛能尿路上皮乳頭狀瘤（papillary urothelial neoplasm of low malignant potential，PUNLMP）易復(fù)發(fā)、進(jìn)展快的病理特性且數(shù)量極少，將其歸類到低級(jí)別組。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 基因組DNA提取采用無水乙醇法從膀胱癌患者及非腫瘤對(duì)照外周血白細(xì)胞中抽提基因組DNA，經(jīng)測(cè)定DNA純度和進(jìn)行相應(yīng)稀釋后于-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR擴(kuò)增引物合成應(yīng)用Primer Premier 5軟件針對(duì)CCNE1（rs8102137）、RIP2（rs42490）設(shè)計(jì)PCR引物。CCNE1上游：5′-GATGAGTCCTGCTTGGTTTAGAC-3′；下游：5′-TTATGTAGCCAGTTGGGTTTG-3′。RIP2上游：5′-CTTGT?GATCCGTCTAAGTTGTG-3′；下游：5′-TTTGCTTTGTGAAA GTCCCT-3′。產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為478和495 bp。由北京華大基因研究中心合成引物，為干粉，使用前先離心，再溶解。通常配成儲(chǔ)存液濃度為100 μmol/L，-20℃保存；使用濃度為10 μmol/L。94℃10 min，94℃30 s，退火（rs8102137和rs42490的退火溫度分別為55℃和57℃）30 s，72℃延伸30 s，31個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 s，4℃保存待用。電泳鑒定PCR產(chǎn)物后進(jìn)行純化、測(cè)序、分型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0，結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)方法中的χ2檢驗(yàn)，顯著性分別用比值比（OR）和95%置信區(qū)間（CI）表示。應(yīng)用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)是否具有群體代表性。檢驗(yàn)的顯著標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物準(zhǔn)確性的鑒定與Marker（DM2000）作對(duì)照，顯示CCNE1和RIP2擴(kuò)增產(chǎn)物純度較高，條帶清晰，見圖1、2。

Fig.1 Results of gel electrophoresis of samples containing target gene of CCNE1（rs8102137）圖1 部分含CCNE1（rs8102137）多態(tài)位點(diǎn)目的基因的電泳結(jié)果

Fig.2 Results of gel electrophoresis of samples containing target gene of RIP2（rs42490）圖2 部分含RIP2（rs42490）多態(tài)位點(diǎn)目的基因的電泳結(jié)果

2.2 測(cè)序結(jié)果測(cè)序后，應(yīng)用oligo6.0軟件對(duì)CC?NE1（rs8102137）基因和RIP2（rs42490）基因序列與所得基因序列進(jìn)行差異性對(duì)比，證實(shí)為目的基因，見圖3、4。

Fig.3 The polymorphic loci sequencing diagram of CCNE1（rs8102137）圖3 CCNE1（rs8102137）多態(tài)位點(diǎn)測(cè)序峰圖（箭頭所示）

2.3 CCNE1和RIP2基因單核苷酸多態(tài)性在各實(shí)驗(yàn)組中的分布CCNE1（rs8102137）檢測(cè)到的基因型有野生型（T/T）、突變雜合子（C/T）、突變純合子（C/ C）。PIP2（rs42490）檢測(cè)到的基因型有野生型（G/ G）、突變雜合子（A/G）、突變純合子（A/A）。經(jīng)Har?dy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)，rs42490和rs8102137基因型頻率符合遺傳平衡定律（χ2分別為1.906和1.623，均P＞0.05），對(duì)照組具有群體代表性。各基因型等位基因頻率在膀胱癌組和對(duì)照組中的分布見表1。

Fig.4 The polymorphic loci sequencing diagram of RIP2（rs42490）圖4 RIP2（rs42490）多態(tài)位點(diǎn)測(cè)序峰圖（箭頭所示）

Tab.1 Distribution of CCNE1（rs8102137）and RIP2（rs42490）SNP genotypes and allele frequency in two groups表1 CCNE1（rs8102137）和RIP2（rs42490）等位基因頻率（%）

2.4 CCNE1和RIP2基因單核苷酸多態(tài)性和膀胱癌易感性的關(guān)系以野生型為暴露對(duì)照，CCNE1和RIP2基因突變型在對(duì)照組低于膀胱癌組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

Tab.2 The relationship between CCNE1（rs8102137）and SNP genotypes and the susceptibility to bladder urothelialcarcinoma表2 CCNE1（rs8102137）和RIP2（rs42490）基因單核苷酸多態(tài)性和膀胱尿路上皮癌易感性關(guān)系例（%）

Tab.3 The relationship between CCNE1，RIP2 SNP genotypes and the grade and stage of bladder urothelial carcinoma表3 CCNE1和RIP2基因多態(tài)性與膀胱尿路上皮癌分級(jí)及分期關(guān)系

2.5 CCNE1（rs8102137）和PIP2（rs42490）基因單核苷酸多態(tài)性與膀胱癌病理分級(jí)、分期的關(guān)系2組突變型與野生型的病理分級(jí)及臨床分期比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

3 討論

膀胱癌的發(fā)生是復(fù)雜、多因素、多步驟的病理變化過程，其本質(zhì)是基因不穩(wěn)定性。在分子水平上，這種不穩(wěn)定表現(xiàn)為原癌基因激活、基因修復(fù)功能的失?；騿适А⒌蛲鱿嚓P(guān)基因失衡及抑癌基因失活等；在細(xì)胞遺傳水平上表現(xiàn)為染色體的異常，如染色體易位、缺失和擴(kuò)增等；同時(shí)涉及細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡等過程的失調(diào)控。

CCNE1是一種重要原癌基因，其產(chǎn)物為Cy?clinE與CDK2結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞增生［4］。許多CCNE1的多態(tài)性位點(diǎn)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系已被確認(rèn)。有兩項(xiàng)膀胱癌全基因組關(guān)聯(lián)性分析均發(fā)現(xiàn)CCNE1（rs8102137）多態(tài)性與膀胱癌易感性及腫瘤的高分級(jí)具有相關(guān)性［5-6］。在CCNE1基因的5′非編碼區(qū)的多態(tài)性位點(diǎn)rs8102137等位基因C與膀胱癌的發(fā)病相關(guān)。研究認(rèn)為CCNE1的過表達(dá)與膀胱癌及上尿路移行細(xì)胞癌的高級(jí)別、高分期及較差的預(yù)后相關(guān)［7-8］。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌組CCNE1（rs8102137）野生型等位基因型頻率顯著低于對(duì)照組，而突變型等位基因型（C/T+C/C）頻率高于對(duì)照組，這提示CCNE1（rs8102137）基因突變與膀胱癌的遺傳易感性相關(guān)，突變可明顯增加膀胱癌的患病風(fēng)險(xiǎn)。這可能與CCNE1（rs8102137）基因突變后影響了CCNE1的表達(dá)水平，增加細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞周期蛋白E的含量，致使癌癥的發(fā)生。但突變與膀胱癌的分期、分級(jí)無明顯關(guān)聯(lián)。

RIP2屬RIP家族成員，RIP與腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）家族成員蛋白的胞外域相作用并且介導(dǎo)下游信號(hào)，主要介導(dǎo)核因子（NF）-κB和誘導(dǎo)凋亡［9］。Zhang等［10］研究發(fā)現(xiàn)RIP2與膀胱癌轉(zhuǎn)移有關(guān)。Guirado等［11］進(jìn)行了275例膀胱癌病例-對(duì)照研究中發(fā)現(xiàn)，RIP2內(nèi)含子區(qū)rs42490的多態(tài)性與膀胱癌的易感性相關(guān)，純合突變型AA比野生純合型GG和突變雜合型AG發(fā)生膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)要高。本研究分析膀胱癌組RIP2（rs42490）野生型等位基因型頻率低于對(duì)照組，而突變型等位基因型（C/T+C/C）頻率高于對(duì)照組，這提示RIP2（rs42490）基因突變與膀胱癌的遺傳易感性相關(guān)，RIP2（rs42490）突變可明顯增加膀胱癌的患病風(fēng)險(xiǎn)與分期、分級(jí)無明顯關(guān)聯(lián)，這與Guirado等［11］的研究結(jié)果是相同的。

總之，CCNE1（rs8102137）和RIP2（rs42490）基因型突變明顯增加膀胱尿路上皮癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多因素共同作用的復(fù)雜過程，因此對(duì)更多的腫瘤相關(guān)基因做更深入的研究是必要的，這將有助于更好地預(yù)防、早期診斷及控制疾病。

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（2014-12-16收稿2015-04-26修回）

（本文編輯魏杰）

Association of genetic polymorphism of CCNE1 and RIP2 with bladder cancer risk

LIANG Enli，WU Changli△，WANG Ying，HU Hailong，TIAN Dawei
Department of Urology，Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin Urology Institute，Tianjin Key Laboratory of Basic Urology，Tianjin 300211，China△

ObjectiveTo evaluate the relationship between the CCNE1 or RIP2，identified at a single nucleotide poly?morphism，and the risk，clinic stage and pathological grade of bladder cancer.MethodsPeripheral venous blood samples were obtained from 176 patients with bladder cancer and 210 controls without cancer.DNA was extracted.Polymerase chain reaction（PCR）method was used to detect CCNE1（rs8102137）and RIP2（rs42490）polymorphism.According to the postoper?ative pathological results，patients with bladder cancer were determined the grading and staging.The genotype differences of medium gene and the distribution gene were analyzed and compared in bladder cancer group and control group.The relation?ship of CCNE1（rs8102137）and RIP2（rs42490）genotypes and clinical data of patients with bladder cancer was analyzed，and the relationship of them with the genetic susceptibility to bladder cancer was also analyzed.ResultsThe genotype dis?tribution was with good group representative in control group.The frequency of CCNE1（rs8102137）variant allele was signifi?cantly higher in bladder cancer group（40.91%）than that of control group（30.95%，OR=1.54，95%CI：1.02-2.45，P＜0.05）. The frequency of RIP2（rs42490）variant allele was significantly higher in bladder cancer group（72.73%）than that of control group（62.38%，OR=1.61，95%CI：1.04-2.48，P＜0.05）.There were no significant differences in gene polymorphisms of CC?NE1（rs8102137）and RIP2（rs42490）between different pathological grades and different clinical stages of bladder cancer. ConclusionThe CCNE1（rs8102137）and RIP2（rs42490）polymorphism have interaction in occurrence of bladder cancer process.There is higher risk of bladder cancer in individuals carrying mutant alleles than that of individuals carrying wild type.

urinary bladder neoplasms；polymorphism，genetic；genes；cyclin E；RIP2

R737.14

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.09.018

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30700834）；天津市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（12ZCDZSY16600）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃（14JCYBJC26300）

天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津市泌尿外科基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（郵編300211）

梁恩利（1981），男，博士在讀，主要從事單核苷酸多態(tài)性與膀胱癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性方面研究

△通訊作者E-mail：wucl2003@163.com