潘麗莉，鄭璐，張俊，于洋，姚霜，喻妙梅，馮悅華，羅光華

雙重熒光實時PCR法鑒定SRBⅠ基因敲除小鼠

潘麗莉，鄭璐，張俊，于洋，姚霜，喻妙梅，馮悅華，羅光華△

目的建立一種雙重熒光實時PCR鑒定B族Ⅰ型清道夫受體（SRBⅠ）基因敲除小鼠的方法。方法提取小鼠尾尖DNA，應用自行設計的鑒定野生型和敲除型SRBⅠ基因的引物和探針，經PCR擴增后，在FAM通道及CY5通道判斷小鼠基因型。同時應用基因測序技術對結果進行驗證，并構建質粒標準品分析該方法的靈敏度和重復性。結果僅在FAM通道出現典型S型擴增曲線的為SRBⅠ基因野生型小鼠，僅在CY5通道出現典型S型擴增曲線的為SRBⅠ基因敲除型小鼠，在兩個通道都出現典型S型擴增曲線的為SRBⅠ基因雜合型小鼠。結果與DNA測序法吻合，檢測野生型和突變型的靈敏度均達4×101拷貝/μL。結論新方法簡單、快速、準確，適用于分型SRBⅠ基因敲除小鼠。

抗原，CD36；清道夫受體BⅠ；雙重熒光實時PCR；基因敲除

B族Ⅰ型清道夫受體（scavenger receptors class B type I，SRBⅠ）最早是在以乙?；兔芏戎鞍祝ˋcLDL）為配體克隆的清道夫受體家族（scavenger receptors，SR）中發(fā)現的［1］，是第一個在分子水平上得到證實的高密度脂蛋白（HDL）受體，屬于B亞族Ⅰ型。最近研究發(fā)現，它不僅參與膽固醇的逆轉運，有益于心血管系統，而且參與糖代謝、骨代謝、雌激素等的調節(jié)［2］，在這些疾病研究中常用SRBⅠ基因敲除小鼠作為動物模型［3］，而該基因敲除動物在用于研究前必須進行基因型鑒定，傳統PCR-瓊脂糖凝膠電泳技術耗時長且易污染，單重熒光定量PCR需要多管反應體系，較為麻煩，因此建立一種簡單、快捷、準確的新方法尤為必要。本研究通過應用雙重熒光PCR技術建立一種新的同時鑒定SRBⅠ基因野生型和敲除型小鼠的方法，效果很好，報告如下。

1 材料與方法

1.1材料SRBⅠ基因敲除小鼠由南京醫(yī)科大學饋贈，品系為C57BL/6。Ezup柱式動物基因組抽提試劑盒購自上海生工公司，Taq熱啟動酶、dNTP混合液、10×PCR緩沖液等購自TaKaRa公司，Light Cycler熒光定量PCR儀購自Roche公司。

1.2DNA提取用溫水孵育小鼠尾巴2～3 min，采集尾尖5 mm，按Ezup柱式動物基因組抽提試劑盒說明書操作提取基因組DNA，置于4℃保存。

1.3引物及探針的設計和合成根據NCBI數據庫中小鼠SRBⅠ基因序列及文獻［4］報道的SRBⅠ基因敲除和插入序列，用Primer Premier5.0軟件設計正、反義引物和探針，引物和探針均由上海生工公司合成和修飾，見表1。

Tab.1Primers and probes for wild and knockout SRBⅠgene mice表1 檢測SRBⅠ基因野生型和敲除型小鼠的引物和探針

1.4實時熒光PCR總反應體系為25 μL，包括DNA模板2 μL，25 mmol/L的MgCl21 μL，5 U/μL Taq熱啟動酶0.25 μL，100 μmol/L野生型及敲除型正、反義引物和探針均為0.1 μL，2.5 mmol/L dNTP混合物2 μL，10×PCR緩沖液2.5 μL，ddH2O補足至25 μL。循環(huán)參數:95℃預變性3 min； 98℃10 s，58℃10 s（溫度轉換率為4.4℃/s），共40個循環(huán)；40℃持續(xù)收集熒光數據。反應在Light Cycler 480Ⅱ型熒光定量PCR擴增儀上進行。

1.5質粒載體構建根據不同的基因型分別構建野生型和敲除型的載體。擴增產物片段送上海生工公司克隆并測序。

2 結果

2.1結果判斷野生型小鼠在FAM通道出現明顯“S”型擴增曲線，在CY5通道無擴增；敲除型小鼠在CY5通道出現明顯“S”型擴增曲線，在FAM通道無擴增；在2個通道都出現典型S型擴增曲線的為SRBⅠ基因雜合型小鼠，見圖1。

Fig.1The analysis of amplification curves圖1 擴增曲線分析圖

2.2靈敏度分析分別選取野生型和敲除型載體作為模板，經10倍連續(xù)稀釋（4×101～4×105），按上述條件進行熒光定量RT-PCR。結果表明，該法對檢測SRBⅠ基因野生型和敲除型小鼠的靈敏度均為4×101拷貝/μL，見圖2。

Fig.2The analysis of sensitivity圖2 靈敏度檢測結果

2.3準確性分析選取野生型和敲除型樣本各1份進行測序，并用BLAST比對，RT-PCR結果均與測序結果一致。野生型和敲除型的部分測序序列見圖3。

Fig.3The PCR product sequence of the wild and SRBⅠknockout mice圖3 SRBⅠ基因野生型和敲除型小鼠PCR產物測序圖

3 討論

隨著基因敲除技術和轉基因技術的廣泛應用，已經證實SRBⅠ不但在脂蛋白代謝和膽固醇轉運中發(fā)揮著重要作用，而且在一氧化氮代謝、丙肝病毒感染、正常紅細胞成熟和雌性生育等方面也顯示出較強的調節(jié)作用［5-6］。本研究旨在建立一種快速準確的檢測野生型和SRBⅠ基因敲除型小鼠的方法，引物設計是整個方法建立的關鍵，利用Primer Premier5.0軟件設計出針對野生型和SRBⅠ基因敲除型高度特異的引物和探針，在以同一濃度陽性核酸作為模板的反應體系中，優(yōu)選引物和探針的最佳濃度，根據最低Ct值選擇最佳引物和探針濃度，建立最優(yōu)化的反應體系。本研究所用的2條探針，分別標記的是FAM和CY5熒光基團，在用LightCycler480Ⅱ型實時熒光定量PCR儀進行檢測時，可分別選擇FAM或CY5通道作為觀察結果的參數，即有較典型的“S”型擴增曲線。該法靈敏度試驗表明檢出限可達到4×101拷貝/μL，特異性也較高，無任何交叉反應，與測序結果一致。

在進行基因型鑒定時，單重熒光定量PCR需要多管反應體系，較為麻煩。而PCR-凝膠電泳法耗時長，易發(fā)生污染，且靈敏度和特異性較低，均較少使用［7-8］。本研究實現了單管同時檢測并區(qū)分野生型和SRBⅠ基因敲除型小鼠，比普通PCR和單重熒光PCR更簡便、快速，證明雙重熒光PCR引物擴增互不干擾且有很高的擴增效率。綜上所述，本研究成功建立了雙重熒光定量PCR檢測SRBⅠ基因野生型和敲除型小鼠的方法，可以推廣使用。

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（2015-02-02收稿 2015-02-26修回）

（本文編輯 閆娟）

Development of a duplex fluorescence RT-PCR assay for identifying SRBⅠgene knockout mice

PAN Lili，ZHENG Lu，ZHANG Jun，YU Yang，YAO Shuang，YU Miaomei，FENG Yuehua，LUO Guanghua△
Comprehensive Laboratory，The Third Affiliated Hospital of Soochow University，Changzhou Key Lab of Individualized Diagnosis and Treatment Associated with High Technology Research，Changzhou 213003，China△

ObjectiveTo develop a duplex fluorescence RT-PCR assay for detection of scavenger receptor class B，typeⅠ（SRBⅠ）knockout mice.MethodsPrimers and probes were designed according to knockout region of SRBⅠgene and related substituted sequence.DNA samples were extracted from tails of mice and performed amplification using realtime PCR.SRBⅠgenotypes of mice were analyzed according to amplification curves of FAM and CY5 channels.Finally，the sensitivity of the method was detected and the accuracy was verified by the direct sequencing.ResultsThe homozygous SRBⅠwild genotype showed an amplification curve only in FAM channel.When the homozygous SRBⅠknockout genotype was present，the typical S amplification curve appeared only in the CY5 channel.Heterozygous genotype showed two typical S amplification curves in both FAM and CY5 channels，respectively.The results showed that the sensitivity reached 4×101copies/μL，and there was complete concordance between this method and direct DNA sequencing.ConclusionThe new method is simple，rapid and accurate，which is suitable for genotyping SRBⅠknockout mice.

antigens，CD36；scavenger receptors-BⅠ；dual fluorescence real-time PCR；gene knockout

R349.82

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.008

國家自然科學基金資助項目（81201352）；江蘇省自然科學基金資助項目（BK2012154）

蘇州大學附屬第三醫(yī)院綜合實驗室，常州市個性化診療高技術研究重點實驗室（郵編213003）

潘麗莉（1986），女，醫(yī)學學士，主要從事疾病分子生物學診斷的研究

△通訊作者E-mail:shineroar@163.com