楊強，丁曉明，徐寶山，趙艷紅，劉越，張揚，馬信龍△

取向性絲素蛋白仿生軟骨支架的制備及其生物相容性評估

楊強1，2，丁曉明1，徐寶山2，趙艷紅1，劉越2，張揚3，馬信龍2△

目的利用定向結晶技術制備具有仿生取向微孔結構的絲素蛋白支架，探討其作為軟骨支架的可行性。方法以絲素蛋白為原料，采用定向結晶技術制成具有仿生取向微孔結構的支架，掃描電鏡觀察支架結構，測量支架的孔徑、孔隙率和力學性能。從兔頸背部分離出脂肪干細胞，培養(yǎng)后獲取第3代細胞，接種到支架上。CCK8檢測支架上細胞增殖情況；HE染色和掃描電鏡觀察細胞在支架上的黏附能力；LIVE/DEAD染色觀察支架上的細胞活性。結果掃描電鏡顯示，支架縱切面可見平行排列的微管樣結構，具有較為統(tǒng)一的方向性，橫切面可見橢圓或圓形孔隙結構，橫截面微孔結構的平均孔徑為（112.43±12.65）μm，孔隙率高達（90.25±2.05）%，支架壓縮彈性模量為（52.48±5.78）kPa；復合脂肪干細胞培養(yǎng)，HE染色和掃描電鏡可見細胞均勻黏附在支架表面及孔隙內(nèi)，分泌大量沿微孔結構取向分布的細胞外基質(zhì)；CCK8檢測結果顯示細胞在支架上增殖良好；LIVE/DEAD染色顯示細胞保持良好的活性，未見死細胞。結論取向性絲素蛋白支架具有均勻的仿生取向微孔結構，具有合適的孔徑、孔隙率和生物相容性，力學強度良好，可作為軟骨組織工程的支架載體。

組織工程；軟骨；絲素蛋白；取向微孔；脂肪干細胞

由于創(chuàng)傷、退行性變、腫瘤切除等原因造成的關節(jié)軟骨受損在臨床上較為常見，關節(jié)軟骨存在較低的體內(nèi)自我修復能力，其損傷的修復是外科領域的一大挑戰(zhàn)［1-2］。常用的對癥保守治療、自體或異體骨軟骨移植等治療方法存在著纖維化、退化等問題，晚期的關節(jié)置換治療同樣難以取得理想的效果［3］。組織工程，尤其是體外軟骨再生技術，能夠完全再生軟骨組織，并且有望實現(xiàn)工業(yè)化和臨床應用，是軟骨修復的理想方法［4］。目前的研究重點集中在支架材料的選擇，支架的材料和結構特征直接影響著種子細胞的生物學功能和組織的形成［5］。本實驗以天然材料蠶絲蛋白為原料，采用定向結晶相分離技術制備具有仿生取向微孔結構的軟骨支架，檢測其結構和生物相容性，為其作為軟骨支架提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1組織來源、主要試劑及儀器新西蘭大白兔，雌雄不限，2.5 kg（天津市天津醫(yī)院動物房提供），Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、乙二胺乙酸二鈉、CCK8、LIVE/DEAD染色劑（Sigma公司，美國）；CO2培養(yǎng)箱（Hera-cell公司，德國），恒溫搖床（Hei?dolph公司，德國），倒置顯微鏡、熒光顯微鏡（Leica公司，德國），S-4800掃描電子顯微鏡（Hitachi公司，日本）。

1.2絲素蛋白溶液的提取按質(zhì)量比1∶200將天然蠶絲加入0.02 mol/L的Na2CO3溶液中，煮沸，反復水洗，更換Na2CO3溶液后重復煮沸、水洗，通風晾干，得絲素絲；按質(zhì)量比1∶4將絲素絲加入0.8 g/mL溴化鋰溶液中，60℃水浴中磁力攪拌4 h；將絲素絲溶解液倒入截留相對分子質(zhì)量為12 000～14 000的透析袋中，透析3 d，每天換水，離心，取上清，轉(zhuǎn)入截留相對分子質(zhì)量為3 500的透析袋中，經(jīng)質(zhì)量分數(shù)15%的聚乙二醇溶液中透析，離心取上清，檢測濃度，并調(diào)整質(zhì)量分數(shù)為6%（w/w）。

1.3取向性軟骨支架的制備將質(zhì)量分數(shù)為6%的絲素蛋白溶液加入Teflon模具（孔徑15 mm，深度10 mm）中，以填滿孔為宜，操作仔細，不要留有氣泡，將已經(jīng)-80℃冷卻的金屬塊放在模具上，水平放置于-80℃冰箱中過夜，取出后再經(jīng)凍干48 h，浸泡于無水乙醇中2 h，晾干。

1.4支架結構的評估

1.4.1結構觀察大體觀察支架的色澤、形狀，將支架橫、縱截面切成1 mm厚的組織片，體視顯微鏡和掃描電鏡下觀察支架結構。

1.4.2支架平均孔徑的測量在100倍掃描電鏡下觀察6個樣本，每個樣本隨機取3個視野，每個視野測量10個孔徑值，取其平均值，計算纖維環(huán)支架的平均孔徑。

1.4.3支架孔隙率的測定參考Zhang等［6］液體置換法計算支架孔隙率。具體方法如下：選取一帶有刻度的試管，裝入一定體積的無水乙醇，記為V1，放入支架，浸泡5 min，并反復擠壓，直至支架材料內(nèi)無氣泡溢出為止，記錄此時的總體積為V2，V2-V1為支架骨架結構的體積。取出浸滿乙醇的支架，剩余乙醇體積記為V3，V1-V3為支架中包容的乙醇體積，即為支架材料中孔隙的體積。支架的總體積等于骨架結構的體積加上支架孔隙的體積，即：V總=（V2-V1）+（V1-V3）= V2-V3。支架的孔隙率等于支架孔隙體積與支架總體積之比，即：（V1-V3）/（V2-V3）×100%。測試6個樣本，每個樣本測定4次，取其平均值。

1.4.4支架壓縮模量的檢測支架放入PBS緩沖液中覆水后，置于力學加載裝置加力平臺上，以0.5 mm/min的壓速進行壓縮測試，根據(jù)檢測初始階段，按公式E=（F/S）/（dL/L）計算支架的彈性模量，其中F代表截面的載荷，S代表截面面積，dL代表支架高度的變化，L代表支架原始高度。

1.5支架生物相容性評估

1.5.1兔脂肪干細胞（ADSCs）的分離、培養(yǎng)及接種取4月齡新西蘭大白兔，分離頸背部皮下脂肪組織，用含抗生素的D-Hank′s液浸泡3～5 min，再用D-Hank′s液沖洗2遍。分離肉眼可見的筋膜、血管，用剪刀將脂肪組織剪成1 mm3大小，加入3～5倍脂肪體積的0.1%Ⅰ型膠原酶，37℃，1 h，200目鋼網(wǎng)過濾，將濾得的液體移入離心管，1 500 r/min離心10 min，棄上清，D-Hank′s液清洗1遍，重懸、計數(shù)后接種。24 h后半量換液，此后3 d換液1次，待細胞達80%～90%融合時消化傳代。將第3代ADSCs以1×107/mL的密度接種到支架上。

1.5.2支架上細胞增殖檢測細胞支架復合體即為支架細胞組，分別于培養(yǎng)1、3、5和7 d行CCK8法檢測脂肪干細胞的增殖，以標準單純細胞組為對照（DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)）。支架大小一致，接種細胞量相同，每個時間點各取3個樣品（對照組為24孔板3個孔），經(jīng)PBS緩沖液清洗，放入500 μL含10%CCK8的無血清DMEM培養(yǎng)基中，37℃孵育3 h后，取100 μL加到96孔板中，酶標儀檢測液體在波長為450 nm時的光密度（OD）值，以含10%CCK8的無血清DMEM培養(yǎng)基作為空白對照。

1.5.3支架復合細胞組織學染色取培養(yǎng)1周的支架細胞復合體，經(jīng)D-Hank′s漂洗2遍，4%多聚甲醛固定12 h后，梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，石蠟包埋切片7 μm，切片脫蠟至水，取切片進行HE常規(guī)染色（蘇木素5 min，伊紅30 s），水洗，鏡檢。

1.5.4支架復合細胞掃描電鏡觀察將培養(yǎng)3 d的細胞支架復合體經(jīng)2.5%戊二醛4℃固定24 h，用PBS（pH=7.4）沖洗3遍，1%鋨酸4℃固定4 h，經(jīng)梯度乙醇脫水，每個濃度脫水20 min以上，空氣干燥，用刀片切成沿縱切面1 mm厚薄片，噴金、抽真空，掃描電鏡觀察。

1.5.5LIVE/DEAD細胞活性染色細胞支架復合物培養(yǎng)48 h后，切成100 μm厚薄片，按照說明書在配制的LIVE/ DEAD染液中孵育約30 min，共聚焦顯微鏡下觀察細胞在支架上的活性。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0軟件包進行統(tǒng)計學處理。計量資料以均數(shù)±標準差，2組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1支架理化特性檢測支架外觀呈乳白色，縱切面可見平行排列的微管樣結構，具有較為統(tǒng)一的方向性，微管直徑較一致并有微孔相互貫通；橫切面可見橢圓或圓形孔隙結構，呈多孔蜂窩狀，孔隙分布均勻，見圖1。橫截面微孔結構的平均孔徑為（112.43± 12.65）μm，孔隙率高達（90.25±2.05）%，支架壓縮彈性模量為（52.48±5.78）kPa。

2.2細胞在支架上的活性和增殖能力檢測第3代ADSCs形態(tài)典型，以長梭形為主，呈束狀或漩渦狀排列，接種到支架上并培養(yǎng)48 h后，尚未完全伸展鋪開，見圖2A。LIVE/DEAD染色細胞多呈綠色球形熒光，細胞活性良好，未見代表死細胞的紅色熒光，見圖2B。CCK8檢測結果顯示ADSCs在支架上基本呈對數(shù)生長趨勢，其各時間點OD值與標準單純細胞比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

Tab.1Comparison of the proliferations at different time points between two groups表1 2組細胞不同時間增殖能力比較（n=5，）

Tab.1Comparison of the proliferations at different time points between two groups表1 2組細胞不同時間增殖能力比較（n=5，）

均P＞0.05

組別支架細胞組標準單純細胞組t 1 d 0.761±0.087 0.748±0.068 0.204 3 d 1.338±0.141 1.393±0.119 0.516 5 d 2.012±0.091 1.958±0.118 0.628 7 d 2.510±0.118 2.461±0.136 0.471

2.3支架上細胞的黏附狀態(tài)HE染色和掃描電鏡可見細胞均勻黏附在支架的表面及孔隙內(nèi)，并沿支架結構取向分布，分泌大量的細胞外基質(zhì)，見圖3。

3 討論

3.1關節(jié)軟骨組織成熟的關節(jié)軟骨是一種無血管的組織［7］，由1%的軟骨細胞和99%的軟骨外基質(zhì)組成，關節(jié)軟骨按膠原纖維分布排列方式共分為4層［8］：淺表層位于軟骨表層，膠原纖維與關節(jié)表面平行，過渡層的纖維與表面呈一定角度交錯分布，輻射層的膠原纖維直徑更粗，與關節(jié)表面垂直排列，前三層又稱透明軟骨層；透明軟骨通過約20～250 μm厚的軟骨鈣化層與軟骨下骨相連，其中輻射層的軟骨細胞以及基質(zhì)呈垂直取向分布，是軟骨組織發(fā)揮力學作用的關鍵環(huán)節(jié)。骨性關節(jié)炎是軟骨缺損最主要的原因。隨著社會老齡化的加劇，以軟骨退變?yōu)樘卣鞯墓切躁P節(jié)炎患者與日俱增［9］。當關節(jié)軟骨全層損傷后，由于軟骨缺乏直接的血液供應、淋巴循環(huán)和神經(jīng)支配，代謝能力低，自身修復能力有限，軟骨下骨髓產(chǎn)生纖維軟骨樣修復，但這種修復產(chǎn)生的軟骨細胞無論是形態(tài)還是功能特性與正常軟骨均相差甚遠［7］。而目前臨床常用的修復方法均有一定局限性，因此尋找安全有效的軟骨修復方法成為目前的研究熱點。

3.2軟骨組織工程研究現(xiàn)狀近年來，以組織工程學的方法構建關節(jié)軟骨取得了較好的效果。組織工程學是運用生命科學和工程學原理研究生物替代品，以維持、重建或改善組織功能的一門跨專業(yè)學科，能夠在生化組成和結構特性上重塑軟骨組織［2］。其中，支架材料是組織工程構建的關鍵環(huán)節(jié)［10］。理想的支架材料除了具備良好的生物相容性，良好的孔隙結構，以及適當?shù)慕到庑阅艿裙残砸酝膺€應該在成分、形狀、結構、力學性能上與軟骨組織相似?，F(xiàn)今的支架材料多種多樣，常用的合成高分子材料如聚乙交酯、聚乳酸聚羥基乙酸共聚物（PLGA）等［11］，降解產(chǎn)物呈酸性，植入體內(nèi)可引起不同程度的炎癥反應，且其親水性較差；而天然材料很好地解決了這一問題，膠原［12］、透明質(zhì)酸［13］、殼聚糖［14］等天然材料具有優(yōu)秀的生物相容性，降解產(chǎn)物可被人體吸收利用，膠原蛋白力學性能、可塑性較差，不能與體內(nèi)軟骨生物力學微環(huán)境相匹配［12］。在支架結構設計方面，主要有三維多孔、取向微孔等結構。大量研究顯示，模仿天然組織結構的取向性支架能夠提高支架本身的力學性能，促進細胞的黏附和增殖［7，11，15］。在軟骨組織工程中，具有取向排列結構的軟骨支架相比非取向結構具有更好的力學強度，能夠更好地調(diào)整細胞的分布、排列和遷移［11，15］。

3.3取向性絲素蛋白軟骨支架本實驗以蠶絲提取的天然材料絲素蛋白為原料，采用定向結晶TIPS技術成功制備具有仿生取向微孔結構的軟骨支架。絲素蛋白纖維是一種無生理活性的天然大分子，具有良好的生物相容性和可控的生物降解速率，來源充足，提取工藝簡單，含有較多的β折疊結構，該結構穩(wěn)定，不溶于水［16］，力學性能優(yōu)良，符合軟骨支架對機械強度的要求［17］。該支架縱切面可見平行排列的微管樣結構，具有較為統(tǒng)一的方向性，微管直徑較一致并有微孔相互貫通，橫切面為可見橢圓或圓形孔隙結構，模仿了天然軟骨組織的柱狀結構，接種細胞培養(yǎng)1周后，可見大量基質(zhì)沿微孔結構取向分布，說明支架取向微孔結構可以引導細胞黏附并分泌細胞外基質(zhì)，從而為形成天然結構的軟骨組織提供保障。此外，采用定向結晶技術制備的支架不含有毒物質(zhì)，CCK8檢測可見細胞在支架上具有良好的黏附、增殖能力，活性良好。

綜上所述，以天然材料絲素蛋白為原料，采用定向結晶制備的仿生軟骨支架，具有與天然軟骨組織相似的取向微孔結構，具有良好的孔徑、孔隙率以及生物相容性，能夠支持和引導細胞取向生長，可作為軟骨組織工程的理想支架載體，但是支架能否支撐干細胞的成軟骨分化有待于進一步研究。

（圖1～3見插頁）

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（2014-11-27收稿 2015-01-18修回）

（本文編輯 李鵬）

Fabrication and biocompatibility assessment of a silk fibroin scaffold with biomimetic oriented microstructure for cartilage tissue engineering

YANG Qiang1，2，DING Xiaoming1，XU Baoshan2，ZHAO Yanhong1，LIU Yue2，ZHANG Yang3，MA Xinlong2△
1 Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Department of Minimally Invasive Spine Surgery，Tianjin Hospital；3 Tianjin Orthopaedic Institute of Integrative Medicine△

ObjectiveTo fabricate a silk fibroin scaffold with biomimetic oriented microstructure using the directional crystallization technology，and to evaluate the possibility of application to the cartilage tissue engineering.MethodsThe silk fibroin scaffold with biomimetic oriented microstructure was made by the directional crystallization technology.The structure of scaffold was observed by the scanning electron microscope，and the pore size，porosity and mechanical properties were calculated. Adipose-derived stem cells were isolated from rabbit，and the passage 3 was seeded into the scaffold.The cell proliferation was detected by CCK8 method.The cell adhesion ability was observed by HE staining and scanning electron microscope.The cell viability was observed by LIVE/DEAD staining.ResultsThe scanning electron microscopy showed that the parallel microtubulelike structure can be seen arranged in longitudinal section of the scaffold，which had a uniform directivity，and also the ellipticalor circular pore structure in cross-section.The scaffold had a good pore interconnectivity with（112.43±12.65）μm pore diameter of the cross-section，（90.25±2.05）%porosity and（52.48±5.78）kPa the compression modulus.HE staining and scanning electron microscopy demonstrated that the cells uniformly adhered to the surface and inner pore，and which secreted lots extracellular matrix distributed in the oriented microstructure.Results of CCK8 showed that the good cell proliferation on the scaffold，and the LIVE/ DEAD staining indicated that the cells were maintained good viability.ConclusionThe silk fibroin scaffolds have a biomimetic oriented microstructure，and show good pore diameter，porosity，biocompatibility and biomechanical properties，which made it a suitable candidate as an alternative scaffold for cartilage tissue engineering.

tissue engineering；cartilage；silk；orientedmicrostructure；adipose-derived stem cell

R329-33，R318.1

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.002

國家自然科學基金項目（31470937，31300798，81272046）；天津市衛(wèi)生局科技基金項目（2013KR16，2012KY24）

1天津醫(yī)科大學（郵編300070）；2天津市天津醫(yī)院微創(chuàng)脊柱外科；3天津市中西醫(yī)結合骨科研究所

楊強（1980），男，副主任醫(yī)師，博士后，主要從事椎間盤、骨軟骨、組織工程方面研究

△通訊作者E-mail：maxinlong8686@sina.com