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桂枝芍藥知母湯對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)炎的作用及其機(jī)制研究

2015-11-12 03:58:44胡雨峰俞晶華奚飛飛
江蘇中醫(yī)藥 2015年11期
關(guān)鍵詞:知母滑膜空白對(duì)照

胡雨峰 俞晶華 奚飛飛

(南京中醫(yī)藥大學(xué),江蘇南京 210023)

桂枝芍藥知母湯對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)炎的作用及其機(jī)制研究

胡雨峰 俞晶華 奚飛飛

(南京中醫(yī)藥大學(xué),江蘇南京 210023)

目的:研究桂枝芍藥知母湯對(duì)CIA模型大鼠關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)的治療作用及其機(jī)制。方法:建立Ⅱ型膠原誘導(dǎo)(CIA)動(dòng)物模型,隨機(jī)分為模型組、雷公藤多苷片組和桂枝芍藥知母湯高、中、低劑量組,另取10只正常大鼠作為空白對(duì)照組,分別給藥后觀察各組大鼠關(guān)節(jié)評(píng)分和腫脹度、病理改變?cè)u(píng)分,并比較各組大鼠滑膜上清液中IL-1、IL-6及IL-17的表達(dá)。結(jié)果:模型組大鼠關(guān)節(jié)評(píng)分、左右足體積、造模足關(guān)節(jié)腫脹度、踝關(guān)節(jié)病理改變?cè)u(píng)分均明顯高于空白對(duì)照組;治療16d后,桂枝芍藥知母湯各劑量組大鼠上述指標(biāo)均明顯低于模型組(P<0.01)。模型組大鼠滑膜上清液中IL-1、IL-6及IL-17的表達(dá)均明顯高于空白對(duì)照組(P<0.01),治療后桂枝芍藥知母湯中、高劑量組大鼠上述指標(biāo)明顯低于模型組(P<0.01或P<0.05)。結(jié)論:桂枝芍藥知母湯可通過調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)而明顯緩解CIA模型動(dòng)物的各種炎癥反應(yīng)。

桂枝芍藥知母湯 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 關(guān)節(jié)評(píng)分 病理學(xué) SD大鼠 實(shí)驗(yàn)研究

桂枝芍藥知母湯(下簡(jiǎn)稱桂芍知母湯)出自漢·張仲景《金匱要略·中風(fēng)歷節(jié)病脈證并治篇》,具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)散寒、滋陰清熱之功效,主要用于治療風(fēng)寒濕痹日久,漸次化熱傷陰之證,至今仍為臨床上的常用方、基礎(chǔ)方,尤多被用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)等以關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鞯牟“Y。本研究在建立Ⅱ型膠原誘導(dǎo)(CollagenⅡ-induced arthritis,CIA)動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上,觀察桂芍知母湯對(duì)模型動(dòng)物關(guān)節(jié)炎癥的治療作用及其對(duì)血清白介素(Interleukin,IL)-1、IL-6及IL-17表達(dá)的影響,為其治療RA的作用及機(jī)制進(jìn)行闡釋和解讀。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠60只,雌雄各半,體重(200g±20)g,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司提供,生產(chǎn)許可證:SCXK(滬)2007-0005,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證:SYXK(蘇)2007-0030。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物桂芍知母湯,藥物組成:桂枝12g,白芍9g,甘草6g,麻黃12g,生姜15g,白術(shù)15g,知母12g,防風(fēng)12g,炮附子10g。藥物均購(gòu)自南京中醫(yī)藥大學(xué)百草堂中醫(yī)門診部,由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制劑室制備成濃度分別為1.2、0.6及0.3g/mL的水煎劑。雷公藤多苷片,10mg/片,由浙江得恩德制藥有限公司生產(chǎn),批號(hào):1108101,研缽研碎后加蒸餾水制成濃度為0.001g/mL的混懸液。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑牛Ⅱ型膠原,美國(guó)Sigma,批號(hào):A7906;完全弗氏佐劑(Complete Frund's Adjuvant,CFA),美國(guó)Sigma,批號(hào):F5881;IL-1、IL-6及IL-17 ELISA試劑盒,上海韻涵生物科技公司,批號(hào)20111201B;焦碳酸二乙酯(DEPC),美國(guó)Sigma。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備YLS-7B型大鼠趾體積測(cè)量?jī)x,山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站;SZ61TRC-ILST型解剖鏡,日本Olympus;ROTOFIX 32A型離心機(jī),德國(guó)Hettich;-80℃低溫冰箱,日本Sanyo;Multiskan MK3型全自動(dòng)酶標(biāo)儀,芬蘭Labsystems。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 建立CIA模型將牛Ⅱ型天然膠原溶解于0.1mol/L醋酸溶液中,制成4mg/mL的溶液,并置于4℃冰箱過夜。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日將含弗氏完全佐劑與CⅡ膠原等體積于冰上充分震蕩乳化制成CⅡ乳劑。用微量注射器于大鼠左后足跖皮內(nèi)、頸、背、腹、尾根等5個(gè)部位分別注射CⅡ乳劑0.1mL,總量0.5mL,并于14d后用同等劑量免疫原在相同部位加強(qiáng)免疫一次。通過定期測(cè)定各組大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)(ArthriticIndex,AI)及檢測(cè)大鼠雙后足的腫脹度判斷模型建立是否成功。

2.2 分組與給藥取造模成功的大鼠50只,隨機(jī)分為5組,每組10只。另取10只正常大鼠作為空白對(duì)照組。給藥方案:空白對(duì)照組與模型組,給予等容量蒸餾水;桂芍知母湯高、中、低劑量組,分別給予桂芍知母湯水煎劑18g生藥/(kg·d)(濃度1.2g/mL)、9g生藥/(kg·d)(濃度0.6g/mL)以及4.5g生藥/(kg·d)(濃度0.3g/mL);雷公藤多苷片組,給予雷公藤多苷片混懸液0.015g/(kg·d)。以上各組均予灌胃給藥,給藥體積均為15mL/(kg·d)。第二次加強(qiáng)免疫后即日開始給藥,連續(xù)給藥16d。

2.3 關(guān)節(jié)評(píng)分、雙足體積測(cè)量及腫脹度計(jì)算關(guān)節(jié)評(píng)分采用0—4級(jí)關(guān)節(jié)評(píng)分法[1]。0分:腳爪正?;驘o(wú)炎癥;1分:趾關(guān)節(jié)腫脹或輕度發(fā)紅;2分:趾關(guān)節(jié)和足跖發(fā)紅并且腫脹;3分:踝關(guān)節(jié)以下的整個(gè)腳爪全部發(fā)紅并且腫脹;4分:踝關(guān)節(jié)嚴(yán)重發(fā)紅且腫脹,關(guān)節(jié)有變形跡象。以第二次加強(qiáng)免疫當(dāng)天為d0,此后每隔4d用大鼠趾體積測(cè)量?jī)x測(cè)量大鼠左右足跖體積,檢測(cè)并記錄關(guān)節(jié)炎指數(shù)積分,以2個(gè)腳爪的評(píng)分之和作為每個(gè)大鼠的關(guān)節(jié)評(píng)分,并按公示計(jì)算出其關(guān)節(jié)腫脹度。

腫脹度ER(%)=(Vt-V0)/ V0×100%(V0為造模前體積,Vt為檢測(cè)時(shí)體積)

2.4 樣本提取及處理連續(xù)給藥16d后使用脫頸法處死大鼠。將大鼠仰臥位固定,70%酒精消毒,大腿外旋,從內(nèi)側(cè)切開并剝離皮膚,沿膝關(guān)節(jié)正中線縱向切開直至暴露出以膝關(guān)節(jié)為中心的約3cm×3cm大小的區(qū)域,用齒鑷提起髕骨。沿髕骨上沿約0.3cm×0.4cm處向下切割直至股骨,再沿髕骨向下分離至脛骨,此時(shí)即可打開膝關(guān)節(jié)腔,由髕骨下極向上延續(xù)的一層平滑光亮且呈淡黃色的軟組織即為滑膜。在解剖鏡下以眼科剪小心分離滑膜,將部分組織分組加入適量生理鹽水搗碎,3000r/min離心10min后取上清液凍于-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 病理組織學(xué)檢查及評(píng)分處死大鼠后,將大鼠的踝關(guān)節(jié)用10%福爾馬林固定,經(jīng)過脫鈣、脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片(厚度約4~5μm)和常規(guī)HE染色后,由病理專業(yè)人員檢查閱片。具體觀察指征包括關(guān)節(jié)炎癥表現(xiàn)、關(guān)節(jié)滑膜病變、關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞等,主要檢查指標(biāo)包含了炎細(xì)胞浸潤(rùn)、血管充血、滑膜腫脹、組織壞死等病理變化,最終根據(jù)病變輕重程度進(jìn)行評(píng)分,按正常和輕、中、重度異常分別計(jì)0~3分。

2.6 滑膜上清液IL-1、IL-6及IL-17含量檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),按照試劑盒使用說(shuō)明測(cè)定組織勻漿上清液中IL-1、IL-6及IL-17之含量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠治療各時(shí)期關(guān)節(jié)炎評(píng)分比較見表1。

3.2 各組大鼠治療各時(shí)期左右足關(guān)節(jié)體積比較見表2。

3.3 各組大鼠左足(造模足)治療各時(shí)期關(guān)節(jié)腫脹度比較見表3。

表1 各組大鼠治療各時(shí)期關(guān)節(jié)評(píng)分(±s)分

表1 各組大鼠治療各時(shí)期關(guān)節(jié)評(píng)分(±s)分

注:與同期空白對(duì)照組比較,▲▲P<0.01;與同期模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

表2 各組大鼠治療各時(shí)期左、右足體積比較(±s)mL

表2 各組大鼠治療各時(shí)期左、右足體積比較(±s)mL

注:與同期空白對(duì)照組比較,▲P<0.01,▲▲P<0.01;與同期模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

3.4 各組大鼠治療后踝關(guān)節(jié)病理評(píng)分比較見表4

3.5 各組大鼠治療后滑膜組織上清液IL-1、IL-6及IL-17表達(dá)比較見表5。

4 討論

RA是一種以關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)周圍組織的非感染性炎癥為主的異質(zhì)性、系統(tǒng)性、慢性自身免疫性疾病。現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)者一般將RA歸屬于“痹證”范疇,但因其病情頑固,遷延難愈,且疼痛遍歷周身多個(gè)關(guān)節(jié)的特點(diǎn),又有別于一般的痹證,是痹證中的特殊類型,尤其與《金匱要略·中風(fēng)歷節(jié)病脈證并治篇》中提及的“歷節(jié)”相似,所謂:“病歷節(jié),不可屈伸”,“諸肢節(jié)疼痛,身體尫羸,腳腫如脫”。而桂芍知母湯正是醫(yī)圣張仲景為風(fēng)濕歷節(jié)所設(shè),全方僅用藥物九味,卻配伍精妙,藥少效宏,具有寒溫并用、溫散而不傷陰、養(yǎng)陰而不礙陽(yáng)等特點(diǎn),是當(dāng)代醫(yī)家用以治療RA的常用方、基礎(chǔ)方。

RA的主要表現(xiàn)包括雙手、腕和足關(guān)節(jié)的對(duì)稱性多關(guān)節(jié)炎,亦可累及膝、髖等關(guān)節(jié),并可伴發(fā)諸多關(guān)節(jié)外表現(xiàn)。在其關(guān)節(jié)表現(xiàn)中,腫脹和變形是較為典型的癥狀。本研究所采用的CIA模型所引發(fā)的炎癥反應(yīng)為多發(fā)性外周關(guān)節(jié)炎(以雙足,踝、膝關(guān)節(jié)為主),關(guān)節(jié)局部可紅腫和畸形,病理變化為增生性滑膜炎,關(guān)節(jié)軟骨破壞以及骨侵蝕,血管翳形成和炎性細(xì)胞浸潤(rùn),其臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)與免疫及病理學(xué)改變方面均接近人類RA,故在CIA大鼠模型的基礎(chǔ)上通過藥物干預(yù)并定期觀察大鼠關(guān)節(jié)評(píng)分變化,雙足體積、腫脹度趨勢(shì)及膝關(guān)節(jié)病理改變可了解藥物對(duì)于關(guān)節(jié)炎癥的治療作用。

炎性細(xì)胞因子的異常表達(dá)在RA的炎癥反應(yīng)中起到了重要的作用,被認(rèn)為是RA炎癥及關(guān)節(jié)損傷的重要介質(zhì)[2]。這其中,IL-1、IL-6及IL-17的表達(dá)與RA的發(fā)病均有密切關(guān)聯(lián)。Arend[3]發(fā)現(xiàn),無(wú)論是在動(dòng)物模型還是患者體內(nèi),IL-1受體都是重要的抗炎因子,在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn),IL-1受體缺乏使得癥狀得以加重。有實(shí)驗(yàn)證明,滑膜液中的IL-6含量可反映局部前炎癥變化,尤其是破壞性的病變[4]。Veldhoen等[5]報(bào)道,IL-6和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)發(fā)揮協(xié)同作用時(shí),可誘導(dǎo)Th17細(xì)胞合成并分泌IL-17,而IL-17又能刺激滑膜成纖維細(xì)胞分泌IL-6,造成炎癥的進(jìn)展。而Chabaud等[6]發(fā)現(xiàn),IL-17能通過滑膜細(xì)胞使得基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)的表達(dá)水平升高5倍,而在抗IL-17抗體作用下,MMP-1的表達(dá)水平降低50%,顯示了IL-17在RA損傷中的作用。IL-17致炎的主要途徑為促進(jìn)T細(xì)胞激活并刺激上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子如IL-6、動(dòng)脈粥樣硬化和細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)等而引起炎癥[7]。

表3 各組大鼠治療各時(shí)期左足(造模足)關(guān)節(jié)腫脹度比較(±s)

表3 各組大鼠治療各時(shí)期左足(造模足)關(guān)節(jié)腫脹度比較(±s)

注:與同期模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

d16組別關(guān)節(jié)腫脹度(%)動(dòng)物數(shù)(只)d0d4d8d12給藥劑量(g·kg-1·d-1)10-桂芍知母湯高劑量組44.2±19.9*41.7±20.7**35.9±16.5**21.7±12.5**48.9±21.4模型組69.2±32.870.1±32.579.4±32.689.6±29.795.8±34.9 1018桂芍知母湯中劑量組10953.2±19.243.2±17.0*35.9±14.5**28.1±11.4**20.7±08.5**桂芍知母湯低劑量組104.557.5±16.953.4±13.046.8±14.9*36.0±14.4**22.6±11.5**雷公藤多苷片組100.01561.5±18.052.9±16.947.2±17.1*42.4±16.3**27.0±13.1**

表4 給藥后各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理改變?cè)u(píng)分統(tǒng)計(jì)表(±s)

表4 給藥后各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理改變?cè)u(píng)分統(tǒng)計(jì)表(±s)

注:與模型組比較,**P<0.01。

組別動(dòng)物數(shù)(只)給藥劑量(g·kg-1·d-1)空白對(duì)照組病理評(píng)分10--模型組10-13.5±1.581桂芍知母湯高劑量組10181.3±2.767**桂芍知母湯中劑量組1093.2±2.820**桂芍知母湯低劑量組104.55.3±3.164**雷公藤多苷片組100.0150.8±1.687**

表5 各組大鼠治療后滑膜組織上清液IL-1、IL-6、IL-17含量比較(±s)pg/mL

表5 各組大鼠治療后滑膜組織上清液IL-1、IL-6、IL-17含量比較(±s)pg/mL

注:與空白對(duì)照組比較,▲▲P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

組別動(dòng)物數(shù)(只)空白對(duì)照組給藥劑量(g·kg-1·d-1)10 IL-1IL-6 -IL-17 37.772±15.75586.978±18.2956.353±2.505模型組-88.447±49.774▲▲119.224±24.585▲▲20.902±9.134▲▲10桂芍知母湯高劑量組101848.498±7.433*90.755±21.542*10.093±6.172**桂芍知母湯中劑量組10950.523±10.053*85.882±22.451**10.066±6.184**桂芍知母湯低劑量組104.569.184±33.720103.954±23.50116.112±9.984雷公藤多苷片組100.01539.633±6.766*76.257±2.974**11.785±7.342*

本研究我們發(fā)現(xiàn),自d0起,模型組的關(guān)節(jié)評(píng)分、左右足體積及腫脹度一直保持上升趨勢(shì),而桂芍知母湯各劑量組相關(guān)指標(biāo)則持續(xù)下降,直至d16;同時(shí)在病理評(píng)分方面,桂芍知母湯各劑量組均遠(yuǎn)低于模型組,顯示桂芍知母湯可緩解模型動(dòng)物關(guān)節(jié)腫脹、變形等癥狀并改善關(guān)節(jié)病理變化,對(duì)模型動(dòng)物的關(guān)節(jié)炎癥有較為明顯的治療效果;而桂芍知母湯高、中劑量可明顯減少模型動(dòng)物滑膜上清液中IL-1、IL-6及IL-17的含量,提示桂芍知母湯可通過調(diào)節(jié)IL-1、IL-6及IL-17的表達(dá)而起到緩解關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用。

[1]張均田.現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法.北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1998:1383

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p

R684.305

A

1672-397X(2015)11-0076-04

胡雨峰(1985—),男,博士,講師,中醫(yī)內(nèi)科學(xué)專業(yè),風(fēng)濕免疫病研究方向。

奚飛飛,博士,助理研究員。xifeifei@163.com

2015-08-27

編輯:吳寧

南京中醫(yī)藥大學(xué)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(13xzr10);南京中醫(yī)藥大學(xué)哲學(xué)社會(huì)科學(xué)基金資助項(xiàng)目(13xsk29);南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)痹病學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放課題基金項(xiàng)目(BBXK2013104)

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