劉欽梅 李春曉 刁曉平 廖承紅 韓 謙 趙彤言**

(1. 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，?？?570228；2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071)

長(zhǎng)期以來，化學(xué)防治是控制蚊媒病的重要手段(Heimingweietal.，2006)。隨著擬除蟲菊酯類殺蟲劑的長(zhǎng)期大量使用，蚊蟲對(duì)施用過的殺蟲劑幾乎都產(chǎn)生了不同程度的抗性(郭鳳英等，2001；Nkyaetal.，2013)影響殺蟲效果。

殺蟲劑抗性是一種復(fù)雜的多基因遺傳現(xiàn)象，只有認(rèn)識(shí)殺蟲劑抗性相關(guān)基因序列特征以及調(diào)控規(guī)律，才能有效闡明抗藥性表型背后的分子機(jī)制，進(jìn)而發(fā)展適宜的防治手段(Hemingweietal.，1993)。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，尋找蚊抗藥性相關(guān)新基因及其與抗藥性關(guān)系，闡明抗藥性的發(fā)生機(jī)制并尋找抗藥性的治理方法，是科學(xué)合理地進(jìn)行蚊蟲防治的關(guān)鍵(Denholmetal.，2002)。

卵黃羧肽酶基因(Vitellogenic carboxypeptidase，VCP)，屬于S10肽酶家族，其功能和絲氨酸羧肽酶相似。分子量大小在40與75 kDa之間，高等動(dòng)植物和真菌中都有分布。在pH<7的環(huán)境下，絲氨酸蛋白酶具有C末端蛋白水解酶脫酰胺酶和酯酶的活性，參與多種蛋白質(zhì)及多肽的加工修飾與降解等代謝過程(Schaller，2004)，如昆蟲及其他哺乳動(dòng)物腸道中食物蛋白質(zhì)的初步消化(Bownetal.，1998)、昆蟲生長(zhǎng)、發(fā)育、蛻皮和變態(tài)等生長(zhǎng)發(fā)育過程等(Suietal.，2009),以及小麥等植物種子體內(nèi)儲(chǔ)藏蛋白的調(diào)用。

本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法檢測(cè)VCP基因在敏感株、野外株和抗性株致Culexpipiensquinquefasciatus中的表達(dá)，探討VCP與蚊抗性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 供試蚊蟲

敏感株蚊蟲采自廣東廣州，在軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所媒介生物學(xué)和防治研究室常規(guī)飼養(yǎng)10年以上，未接觸任何殺蟲劑的致倦庫(kù)蚊。野外株致倦庫(kù)蚊F22代是從海南三亞采集于實(shí)驗(yàn)室傳代飼養(yǎng)得到。為了得到更高的抗藥性，以溴氰菊酯LC50濃度對(duì)于野外株的Ⅳ齡幼蟲用藥，經(jīng)過其間5代篩選得到抗性株F22代致倦庫(kù)蚊。

蚊蟲養(yǎng)殖條件為：溫度(26±1)℃、相對(duì)濕度(65±5)%、光照∶黑暗=14 h∶10h，成蚊喂食8%糖水。

1.2 生物測(cè)定

采用WHO幼蟲浸漬法(Cetinetal.，2005)，具體操作步驟：首先將殺蟲劑(擬除蟲菊酯類殺蟲劑溴氰菊酯,濃度98%購(gòu)自上海農(nóng)藥研究所)原液用丙酮(分析純)配制成5～10個(gè)濃度梯度。每個(gè)容器(紙杯)中加99 mL過夜脫氯水，之后加1 mL不同濃度梯度的藥液，對(duì)照組加入1 mL丙酮。其次，挑選30條Ⅲ齡末或Ⅳ齡初幼蟲，連同脫氯水共量取100 mL加入藥液杯中。24 h后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并且記錄死亡數(shù)(以幼蟲不能逃避機(jī)械刺激為死亡)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。最后，將蚊蟲放入溫度(26±1)℃、相對(duì)濕度(65±5)%的實(shí)驗(yàn)室中。

1.3 致倦庫(kù)蚊VCP基因的定量分析

1.3.1引物合成：根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中致倦庫(kù)蚊的VCP基因序列(CPIJ008608)和核糖體蛋白L8基因序列(XP_001841927)，在NCBI-Primer-BLAST里設(shè)計(jì)特異性引物，VCP基因引物序列：上游為：5’-A C G C T C A A C T T C T C G G G T CG-3’,下游為：5’-T G A T C A G A T C C A G C G C C C AC-3’； RPL8基因引物序列：上游為：5’-G T G G A A A G G G A G A C G A G A A G TT-3’,下游為：5’-C G C A G A A C G A A C C G A A T CT-3’，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.3.2致倦庫(kù)蚊整體cDNA的獲得：按照全式金公司TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒說明書提取總RNA；1.5% TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的RNA的完整性，紫外分光光度計(jì)測(cè)量提取的RNA的濃度與純度；使用全式金公司TransScript Ⅱ All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄，體系如下：5×TransScript Ⅱ All-in-One SuperMix for qPCR 4 μL，gDNA Remover 1 μL，RNase-free Water 補(bǔ)全到體積20 μL，總RNA 1 μg；反應(yīng)條件如下：50℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃，保存。得到cDNA溶液-20℃保存。

1.3.3致倦庫(kù)蚊VCP基因和RPL8基因的擴(kuò)增：利用全式金TransStart TopTaq DNA Polymerase通過PCR擴(kuò)增內(nèi)參基因與目的基因，PCR反應(yīng)體系總體積50 μL，包括模板cDNA 1 μL，上游引物(10μmol/L) 1 μL，下游引物(10 μmol/L)1 μL，10×TransStart TopTaq Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，TransTaq TopTaq DNA Polymerase 1 μL，ddH20 37 μL。反應(yīng)條件為95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物使用1.5%TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，將PCR產(chǎn)物直接送往華大測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)鑒定。

1.3.4PCR產(chǎn)物的克隆、測(cè)序和鑒定：將剩余PCR產(chǎn)物用全式金EasyPure PCR Purification Kit試劑盒說明書進(jìn)行純化，分別將兩條基因PCR純化產(chǎn)物與pEASY-T1 Simple載體連接，藍(lán)白斑篩選出的陽(yáng)性克隆經(jīng)檢測(cè)后送公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)鑒定。

1.3.5制備VCP和RPL8基因標(biāo)準(zhǔn)品，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：按照全式金EasyPure HiPure Plasmid MiniPrep Kit試劑盒說明書提取重組質(zhì)粒，測(cè)定質(zhì)粒濃度，計(jì)算拷貝數(shù)，按10倍梯度逐級(jí)稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)品。反應(yīng)體系總體積20 μL，包括2x TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL，模板cDNA 1 μL，上游引物 (10 μmol/L) 0.4 μL，下游引物(10 μmol/L) 0.4 μL，ddH2O 8.2 μL。反應(yīng)條件為95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 15 s，72℃ 10 s，45個(gè)循環(huán)；熔解曲線反應(yīng)條件為：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。

1.3.6三種株致倦庫(kù)蚊VCP基因和RPL8基因的定量分析：構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線后，采用RPL8基因的拷貝數(shù)對(duì)VCP基因的拷貝數(shù)進(jìn)行校正，比較VCP基因在致倦庫(kù)蚊敏感株、野外株、抗性株之間表達(dá)量的差異倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0軟件中的回歸分析中概率分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得致死中濃度LC50值和95%置信區(qū)間。采用GraphPad Prism 5單因素方差分析中的Turkey法對(duì)3種株拷貝數(shù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 三種株致倦庫(kù)蚊幼蟲對(duì)溴氰菊酯抗性檢測(cè)結(jié)果

和敏感株相比，其他2種株致倦庫(kù)蚊對(duì)溴氰菊酯均產(chǎn)生了很高的抗性，野外株和抗性株對(duì)溴氰菊酯的抗性差異倍數(shù)分別為682與74 144倍(表1)。

2.2 三株致倦庫(kù)蚊總RNA電泳檢測(cè)

結(jié)果顯示，三種致倦庫(kù)蚊總RNA的條帶明亮、清晰、銳利，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖1)。

表1 三種株致倦庫(kù)蚊溴氰菊酯的抗性水平Tab.1 Levels of deltamethrin resistance in three Cx.pipiens quinquefasciatus

SS：敏感株；FS：野外株；RS：抗性株。
S：Sensitive strain；F：Field strain；R：Resistant strain.

圖1 致倦庫(kù)蚊總RNA擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoresis of Cx.pipiens quinquefasciatus RNAM: Trans2K Plus П DNA Marker；1-3：野外采集株；4-6：敏感株；7-9：抗性株。M: Trans2K Plus П DNA; 1-3: Field strain; 4-6: Sensitive strain; 7-9: Resistant strain.

2.3 致倦庫(kù)蚊VCP基因與管家基因RPL8的擴(kuò)增結(jié)果

以致倦庫(kù)蚊野外抗性株cDNA為模板，特異性引物擴(kuò)增致倦庫(kù)蚊VCP、RPL8片段大小分別為175、98 bp，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符(圖2)。

圖2 致倦庫(kù)蚊基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR products of Cx.pipiens quinquefasciatus genes fragmentM: Trans2K Plus П DNA Marker；1：VCP基因擴(kuò)增條帶；2：RPL8基因擴(kuò)增條帶。M: Trans2K Plus П DNA;1: VCP amplification band; 2: RPL8 amplification band.

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線的制作

致倦庫(kù)蚊VCP和RPL8重組質(zhì)粒的濃度和OD比值分別為：195 ng/μL，A260/280=1.733；485 ng/μL，A260/280=1.732。將質(zhì)粒濃度換算成拷貝數(shù)后，10倍濃度稀釋用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。得到VCP基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=-3.795×Log(x)+56.05,R2=0.996, 擴(kuò)增效率E=83.4%；內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=-3.150×Log(x)+43.55,R2=1.000,擴(kuò)增效率E=107.7%。從標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率可知VCP和RPL8基因的擴(kuò)增效率較高，并且熔解曲線表明VCP和RPL8基因都不存在非特異性擴(kuò)增。

2.5 三種致倦庫(kù)蚊VCP基因表達(dá)量分析

對(duì)致倦庫(kù)蚊敏感株、野外株和抗性株中VCP基因拷貝數(shù)進(jìn)行定量分析，結(jié)果見表2和圖3。結(jié)果顯示，VCP基因在敏感株中的表達(dá)量比野外株高，差異具有顯著性；野外株中的表達(dá)量比抗性株高，差異達(dá)到顯著性。

2.6 VCP基因的表達(dá)量與對(duì)溴氰菊酯的抗藥性之間的關(guān)系

將致倦庫(kù)蚊不同株對(duì)溴氰菊酯的LC50值(RR值為抗性指數(shù)：三種株以敏感株LC50值為底數(shù)，其RR值分別為1、682、74144)和VCP的cDNA基因的拷貝數(shù)均取對(duì)數(shù)后,相關(guān)性分析結(jié)果顯示兩基因的表達(dá)量之間存在著顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖4)。

表2 VCP基因在致倦庫(kù)蚊敏感株、野外株和抗性株的表達(dá)量Tab.2 The VCP expression level in sensitive, field and resistant of Cx.pipiens quinquefasciatus

圖3 不同株中VCP基因表達(dá)拷貝數(shù)Fig.3 The expression level of VCP genes in different strainsSS：敏感株；FS：野外株；RS：抗性株。 SS：Sensitive strain；FS：Field strain；RS：Resistant strain.

圖4 三種致倦庫(kù)蚊溴氰菊酯RR值與VCP基因拷貝數(shù)的相關(guān)性分析Fig.4 Relationship between VCP copies of three Cx. pipiens quinquefasciatus strains and the prevalence of the resistance ratio of deltamethrin

3 討論

抗性的產(chǎn)生是多種因素綜合的結(jié)果，其中代謝相關(guān)酶表達(dá)或活性的增加是導(dǎo)致殺蟲劑抗性產(chǎn)生的最重要機(jī)制(Davidetal.，2005)。到目前為止，人們已證實(shí)一些代謝酶家族成員與蚊對(duì)殺蟲劑的代謝抗性相關(guān)，如細(xì)胞色素P450(P450s)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和乙酰膽堿酯酶等(Nkyaetal.，2013)。

在植物中，絲氨酸羧肽酶主要參與其生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡及種子發(fā)育等生理過程(Cercosetal.，2003)。但是在昆蟲中對(duì)其研究相對(duì)較少，只有少數(shù)幾個(gè)絲氨酸羧肽酶的序列及生理學(xué)功能得到鑒定。昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育過程中絲氨酸蛋白酶是必需生化酶類,如在埃及伊蚊雌蚊的脂肪體內(nèi)可以合成一種絲氨酸羧肽酶，以酶原形式在卵母細(xì)胞中存在，并在卵中形成活性形式為胚胎生長(zhǎng)發(fā)育運(yùn)輸卵黃蛋白(Choetal.，1991)。最近有研究結(jié)果表明，通過在昆蟲的中腸蛋白酶表達(dá)水平高低或類型的改變從而對(duì)殺蟲劑是否降解或者降解程度的不同使昆蟲對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生抗性(張雅昆等.，2013)。

熒光定量PCR結(jié)果證明，VCP基因在敏感株致倦庫(kù)蚊表達(dá)量顯著高于野外株，野外株也顯著高于抗性株。推測(cè)在致倦庫(kù)蚊中，抗性株絲氨酸羧肽酶受到抑制,由于殺蟲劑的持續(xù)作用,致倦庫(kù)蚊體內(nèi)保幼激素發(fā)生變化,間接使致倦庫(kù)蚊成蟲體內(nèi)卵黃發(fā)生受到影響,使得抗性種群的絲氨酸羧肽酶表達(dá)量降低。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示VCP基因在致倦庫(kù)蚊對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生抗性的機(jī)制中存在一定作用，可做為新的耐藥性治理備選基因及耐藥性檢測(cè)靶標(biāo)，為昆蟲抗藥性機(jī)理研究及抗藥性的分子檢測(cè)提供了新的研究方向。