吳 群 李春曉 廖承紅 韓 謙** 趙彤言**

(1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海口 570228；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071)

隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，已有越來越多生物技術(shù)應(yīng)用到昆蟲基因功能研究中，其中RNAi技術(shù)已成為研究蚊蟲基因功能主要生物技術(shù)之一(Zhuetal.，2013; Lietal.，2014)。RNA干擾是指外源性或內(nèi)源性的dsRNA(Double-stranded RNA，dsRNA)特異性地引發(fā)基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象(王翔，2013)。如何有效將外源性dsRNA導(dǎo)入蚊蟲體內(nèi)是實(shí)現(xiàn)RNA干擾成功的關(guān)鍵步驟。將線蟲浸泡在dsRNA溶液中，或者喂食線蟲表達(dá)dsRNA的細(xì)菌以及向線蟲體腔注射dsRNA都能引起RNAi效應(yīng)(Burandetal.，2013)，而對于昆蟲RNAi主要通過微量注射將外源dsRNA導(dǎo)入昆蟲血淋巴中或者喂食表達(dá)dsRNA細(xì)菌，其中微量注射法已經(jīng)越來越多應(yīng)用到完全變態(tài)昆蟲的所有生命階段(Scottetal.，2013)。Drake(2015)和Li(2014)等利用RNAi研究埃及伊蚊通道蛋白基因和致倦庫蚊Culexpipiensquinquefasciatus抗藥性相關(guān)G蛋白偶聯(lián)受體基因功能時(shí)都是通過微量注射法將dsRNA導(dǎo)入蚊蟲體內(nèi)。然而在大量應(yīng)用RNAi技術(shù)的文獻(xiàn)中并未對蚊蟲微量注射進(jìn)行詳細(xì)闡述，在Garver(2007)和Luna(2007)公布的岡比亞按蚊和埃及伊蚊微量注射視頻中也只能看到大致構(gòu)建步驟。此外，對于致倦庫蚊微量注射詳細(xì)構(gòu)建步驟報(bào)道甚少。如能詳細(xì)闡述構(gòu)建蚊蟲微量注射方法，將更有利于研究者構(gòu)建微量注射體系，更好地利用RNAi等生物技術(shù)開展基因功能研究。本文以致倦庫蚊為注射對象來構(gòu)建蚊蟲微量注射最佳方案，為后續(xù)研究致倦庫蚊基因功能提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試蚊種：致倦庫蚊敏感株來源于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所媒介生物學(xué)和防治研究室，蚊蟲養(yǎng)殖條件為：溫度(26±1)℃、相對濕度60%±5%、光照：黑暗=14 h：10 h，成蚊喂食8%糖水，羽化3～5 d的蚊蟲用于實(shí)驗(yàn)。

蚊蟲圖像采集：體視顯微鏡(型號：M165C，Leica公司)，數(shù)碼圖像采集儀及軟件(型號：Automontage-pro，SYNCROS 公司)

1.2 方法

1.2.1蚊蟲的麻醉：用吸蚊器吸取羽化3～5 d并中斷糖水4 h的致倦庫蚊，吸5次，每個(gè)吸蚊器收集盒吸取蚊蟲數(shù)量控制在300只左右，將吸蚊器收集盒放入-30℃冰箱中，冰凍時(shí)間分別為3、4、5、7和10 min；將每個(gè)收集盒內(nèi)蚊蟲平均倒入放置于冰上的3個(gè)培養(yǎng)皿中，冰上放置1 h后將培養(yǎng)皿中蚊蟲放置蚊籠中回暖(養(yǎng)蟲室條件：溫度(26±1)℃、相對濕度60%±5%)并喂食8%糖水，統(tǒng)計(jì)冰凍不同時(shí)間造成的死亡率。

用吸蚊器吸取羽化3～5 d并中斷糖水4 h的致倦庫蚊，吸5次，每個(gè)吸蚊器收集盒吸取蚊蟲數(shù)量控制在300只左右，向吸蚊器收集盒充CO2氣體，分別持續(xù)時(shí)間為0.5、1.0、2.0、4.0和10.0 min；將每個(gè)收集盒內(nèi)蚊蟲倒入放冰上的3個(gè)培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿放置于冰上，1 h后將培養(yǎng)皿中蚊蟲放置蚊籠中回暖(養(yǎng)蟲室條件同上)并喂食8%糖水，統(tǒng)計(jì)CO2充氣不同時(shí)長蚊蟲的死亡率。

1.2.2蚊蟲液體注射劑量及注射部位的選?。罕狙芯坎捎糜蛪菏绞謩?dòng)微量注射儀(CellTram oil，Eppendorf 公司)對蚊蟲進(jìn)行注射；利用最佳麻醉方式對蚊蟲進(jìn)行麻醉，從蚊蟲正對胸部腹面和胸部側(cè)面進(jìn)行注射，通過轉(zhuǎn)動(dòng)助推器旋鈕格數(shù)引起蚊蟲腹部變化情況來確定注射劑量，統(tǒng)計(jì)蚊蟲成活率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 13.0 進(jìn)行顯著性分析，比較不同處理間的差異性，顯著水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 蚊蟲不同麻醉方式效果

對蚊蟲進(jìn)行微量注射時(shí)，一般對于活動(dòng)性強(qiáng)的蚊蟲，進(jìn)行適當(dāng)?shù)穆樽砗?采用乙醚、CO2或冰)再注射，可以避免由于蟲體扭動(dòng)而使注射的dsRNA流出體外(田宏剛等，2013)。本實(shí)驗(yàn)選取冰凍和CO2來進(jìn)行麻醉，實(shí)驗(yàn)過程中當(dāng)冰凍時(shí)間為3.0 min時(shí)，蚊蟲并不能全部達(dá)到麻醉狀態(tài)，4.0 min時(shí)可以明顯看出蚊蟲處于麻醉狀態(tài)，放置冰上1 h后，成活率達(dá)98.97%，由圖1中A可以看出隨著冰凍時(shí)間的增加對蚊蟲造成的傷害越來越大，成活率成逐漸下降趨勢。

對蚊蟲充CO2氣體來進(jìn)行麻醉時(shí)，可以看出當(dāng)充氣時(shí)間為0.5 min時(shí)蚊蟲就能達(dá)到麻醉狀態(tài)，并且通氣持續(xù)時(shí)間達(dá)到1.0、2.0、4.0 min后，蚊蟲成活率均為100%，隨著時(shí)間增加到10 min時(shí)，CO2對蚊蟲造成嚴(yán)重傷害其成活率降為36.50%。

圖1 不同麻醉方式處理后蚊蟲成活率Fig.1 The survival rate of mosquitoes treated with different methodsA.冰凍；B.CO2處理. 標(biāo)有不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)A. The survival rate of mosquitoes freezed with different durations；B. The survival rate of mosquitoes treated with CO2 with different durations.The survival rates with different letters are significantly different (P<0.05).

2.2 注射劑量及部位

蚊蟲注射量的大小主要參照Luna等(2007)公布的視頻(圖2 A-B為視頻截圖)。當(dāng)轉(zhuǎn)動(dòng)微量注射儀旋轉(zhuǎn)扭格約0.75格即注射量為0.7～0.8 μL時(shí)可以明顯觀察到蚊蟲腹部由圖2中 C漲大到D，并在肉眼下也能明顯觀察到蚊蟲腹部脹大。

選擇從蚊蟲的胸部進(jìn)行注射，分別從蚊蟲胸部腹面與側(cè)面注射兩組。從表1中可以看出正對蚊蟲胸部腹面注射成活率僅為67.81%，明顯低于從胸部側(cè)面注射成活率(93.85%)，由此可見對胸部腹面注射對蚊蟲造成傷害明顯要比從側(cè)面進(jìn)行注射大。

圖2 注射前后蚊蟲腹部變化情況Fig.2 Changes of mosquito abdomen before and after injectionA-B.Luna等(2007)公布的蚊蟲注射視頻截圖，A: 注射前; B: 注射dsRNA后. C-D.本實(shí)驗(yàn)注射前后; C: 注射前; D: 注射0.7～0.8 μL dsRNA后。A-B：Published video screenshots with microinjected mosquito from Luna et al.(2007)and Garver(2007). A: The mosquito before injecting; B: The mosquito after injected dsRNA；C-D: Before and after injection in our experiment; C: The mosquito before injecting; D: The mosquito after injected 0.7～0.8 μL dsRNA.

表1 不同部位注射后蚊蟲成活率Tab.1 Survival rate of mosquitoes at different mode of the injection

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用CO2麻醉效果要比冰凍麻醉效果更佳，用CO2處理0.5～4.0 min，然后置于冰上1 h后蚊蟲能夠全部復(fù)蘇，不會(huì)對蚊蟲造成傷害；而在冰凍麻醉蚊蟲時(shí)，從冰凍5 min后開始蚊蟲回暖，將引起蚊蟲死亡，死亡率達(dá)10.37%。當(dāng)冰凍時(shí)間為4 min且放置于冰上持續(xù)1 h后死亡率較低(1.03%)能達(dá)到通CO2氣體0.5～4 min的麻醉效果，隨著冷凍時(shí)間的增加蚊蟲死亡率也逐漸增加，這與以往研究結(jié)果不同。梁國棟(1991)等發(fā)現(xiàn)將蚊蟲置冰箱冷凍室5 min左右，使其凍麻倒入一玻璃平皿，平皿下部放一冰盤以維持蚊蟲的凍麻狀態(tài)。室溫下以冰塊維持凍麻2 h的蚊蟲回暖后，可全部正?；顒?dòng)，不會(huì)因長時(shí)間凍麻而死亡。我們推測因選取的蚊蟲不同造成的差異。本研究實(shí)驗(yàn)對象致倦庫蚊主要分布在北緯32～34℃以南的地區(qū)(邢丹，2013)，耐寒能力比較弱，從中可以看出利用冰凍麻醉蚊蟲時(shí)可以根據(jù)蚊蟲種類的不同適當(dāng)增加或減少冰凍時(shí)間。

注射前對蚊蟲進(jìn)行中斷糖水飼養(yǎng)4 h，使蚊蟲處于空腹?fàn)顟B(tài)，不僅有利于觀察注射后腹部變化，還能盡可能減少蚊蟲產(chǎn)生降解dsRNA的酶類。對蚊蟲注射量主要參照Luna等(2007)等公布的視頻，進(jìn)行注射時(shí)主要以肉眼能明顯觀察到腹部變化情況為準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)中當(dāng)注射量為0.7～0.8 μL能明顯看到蚊蟲腹部脹大。早在1994年就有報(bào)道平均每只白紋伊蚊一次吸血量為1.3750～1.4820 mg，其吸血量大約為體重的59.6%～67.5%(張?jiān)浦牵?994)，說明蚊蟲腹部可以容納0.7～0.8 μL液體。

田宏剛等(2013)提出對昆蟲進(jìn)行微量注射選擇從昆蟲頭部向尾部方向注射，因?yàn)槔ハx的血液流動(dòng)在背血管以外是從頭向尾，這樣可以最大程度的避免dsRNA由于體液的流動(dòng)而被排出體外。從閆亮珍等(2011)公布的致倦庫蚊胸部切片可以看出，致倦庫蚊胸部主要分布有大量的肌肉組織，適合進(jìn)行注射。胸部側(cè)面的氣孔肉眼下無法觀察到，從側(cè)面注射會(huì)不會(huì)影響蚊蟲成活率，為此我們進(jìn)行了蚊蟲胸部腹面與側(cè)面注射實(shí)驗(yàn)，結(jié)果正對胸部腹面成活率明顯低于側(cè)面，側(cè)面注射可能對蚊蟲的傷害要更小。我們推測正對胸部進(jìn)行注射會(huì)對分布在上面胸神經(jīng)節(jié)造成傷害(閆亮珍等，2011)，從而增加蚊蟲死亡率。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的顯微注射技術(shù)主要用于后續(xù)蚊蟲氣味受體基因功能研究，而有研究證明黑腹果蠅的受體Gr21a和Gr63a，共同表達(dá)時(shí)能對CO2表現(xiàn)出敏感性，在岡比亞按蚊中與之同源的受體GPRGR22 和GPRGR24也分布在感知CO2的下顎須中(Jones，2007)，為了不不影響對氣味受體研究結(jié)果的準(zhǔn)確性，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中主要采用與CO2麻醉效果一樣的冰凍4 min來對蚊蟲進(jìn)行麻醉。本研究成功構(gòu)建蚊蟲顯微注射方法，為后續(xù)蚊蟲基因功能研究提供技術(shù)支持及理論依據(jù)。