王　　凱，李　　婷，師瑞芳，李師翁，*

（1.蘭州交通大學化學與生物工程學院，甘肅蘭州730070；2.甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點實驗室，甘肅蘭州730070；3.中科院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所，甘肅蘭州730030）

鏈霉菌生物活性物質(zhì)分離純化技術(shù)研究進展

王凱1，李婷2，師瑞芳3，李師翁1，*

（1.蘭州交通大學化學與生物工程學院，甘肅蘭州730070；2.甘肅省極端環(huán)境微生物資源與工程重點實驗室，甘肅蘭州730070；3.中科院寒區(qū)旱區(qū)環(huán)境與工程研究所，甘肅蘭州730030）

放線菌尤其是鏈霉菌是微生物生物活性天然產(chǎn)物的主要產(chǎn)生菌，鏈霉菌屬的很多菌能產(chǎn)生多種抗生素、抗腫瘤藥物及酶等重要活性代謝產(chǎn)物，具有廣泛的商業(yè)和醫(yī)用開發(fā)價值。本文對鏈霉菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)分離純化方法進行了綜述，并對發(fā)展趨勢進行了展望。

鏈霉菌，生物活性物質(zhì)，分離純化技術(shù)

鏈霉菌屬革蘭氏陽性放線菌，其具復(fù)雜而龐大的次級代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可產(chǎn)生大量具重要應(yīng)用價值的次級代謝產(chǎn)物，除最主要的抗生素類外，還包括抗腫瘤劑、免疫抑制劑、抗蟲劑［1］以及胞外水解酶類（幾丁質(zhì)酶、果膠酶、纖維素酶）［2］等生物活性產(chǎn)物，它們在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品、化工等領(lǐng)域具有重要的商業(yè)和藥用價值。然而這些活性代謝產(chǎn)物存在于物質(zhì)成分復(fù)雜的發(fā)酵液中，給其規(guī)模開發(fā)和應(yīng)用帶來困難，因此選擇合理高效的分離純化手段是有效解決這一問題并獲得高純度活性產(chǎn)物的關(guān)鍵。本文就目前主要的鏈霉菌生物活性物質(zhì)分離純化方法的研究進展作一綜述。

1　鏈霉菌生物活性物質(zhì)研究概況

過去十年，不同環(huán)境中分離的鏈霉菌分泌的生物活性新型代謝物數(shù)量在不斷增長。根據(jù)其化學結(jié)構(gòu)的不同主要分為多肽、醌類、大環(huán)內(nèi)酯類、萜烯類、聚酮類、吲哚類、酶、酶抑制劑以及脂類等［3］。數(shù)據(jù)顯示，在近10000種放線菌產(chǎn)生的生物活性化合物中，有7600多種來自鏈霉菌屬，約占74%［4］，顯示了鏈霉菌作為藥物產(chǎn)生者的巨大價值。國內(nèi)外研究者也紛紛從鏈霉菌中分離純化各種活性代謝產(chǎn)物。例如Usama W H等［5］從Streptomyces sp.Mei37分離到五個異喹啉醌生物堿，這些生物堿對8種腫瘤細胞具有抑制作用。Eric D M［6］對鏈霉菌產(chǎn)物進行分離得到三種具細胞毒性的環(huán)肽。Sebastian M［7］從Streptomyces sp. CS495中分離得到一種堿性幾丁質(zhì)酶。Taechowisan T等［8］從Streptomyces sp.Tc052中分離到4個黃酮類化合物，其中有兩種可以作為神經(jīng)保護劑等。而在已經(jīng)分離的16500多種抗生素中，從鏈霉菌中分離的就有8366種，約占51%（表1），并且由鏈霉菌產(chǎn)生的9000多種生物活性物質(zhì)中，目前已有100～120多種得到應(yīng)用，占微生物活性物質(zhì)應(yīng)用品種總數(shù)的70%～75%［4］。由此可見，從鏈霉菌屬中可提取分離得到多種多樣的活性代謝產(chǎn)物，它們在人類生活中發(fā)揮著重要作用。

表1　微生物產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)［4］Table 1　Bioactive microbial secondary metabolites［4］

2　鏈霉菌生物活性物質(zhì)分離純化特點

生化分離純化技術(shù)作為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中關(guān)鍵技術(shù)，其具有特殊要求。尤其對于某些生物活性物質(zhì)（酶、蛋白質(zhì)等）具有生理活性和藥理作用，因而在分離純化中，必須在保證其活性的前提下進行分離操作。因此，從鏈霉菌發(fā)酵液中提取、分離、純化生物活性物質(zhì)是極其復(fù)雜的工藝過程，主要具有以下特點：

a.原料發(fā)酵液中常存在和目的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)相似的同分異構(gòu)體或者結(jié)構(gòu)類似物，普通分離法難分離，因此，需借助高效分子識別技術(shù)純化目標產(chǎn)物。同時，需借助多種分離技術(shù)來完成，致使分離步驟增多，能源和材料消耗增大，分離純化成本增加。研究表明，生物產(chǎn)品分離純化費用通常占總生產(chǎn)成本的80%［9］。魏茂龍［10］對吡啶霉素鏈霉菌中pyr2缺失突變株HTT12發(fā)酵產(chǎn)物依次進行了離心、萃取、反相硅膠柱層析、凝膠柱層析、半制備型HPLC分離，然后進行LC-MS、二級質(zhì)譜分析，經(jīng)過復(fù)雜繁瑣的純化及分析步驟最終分離得到兩種吡啶霉素類似物HTT12-1和HTT12-3。

b.鏈霉菌生物活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和多樣性，致使所采用的操作方法通用性較差，常無固定的操作方法，因此在分離過程中需根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)選擇經(jīng)濟及分離效率高的分離法。

c.多數(shù)鏈霉菌生物活性物質(zhì)只能在適合的溫度和條件下發(fā)揮作用，其對pH、溫度較為敏感，外界環(huán)境的變化很可能造成活性物質(zhì)的活性降低或失活，因此分離純化中通常需采用保護劑和緩沖系統(tǒng)等措施來保持活性。李漢廣等［11］探索Streptomycete 702發(fā)酵液中菌絲體浸提條件時將菌絲體置于不同溫度和不同pH下的有機溶劑中進行優(yōu)化分離。結(jié)果表明，當Streptomycete 702在pH6.5（緩沖液∶磷酸氫二鈉-檸檬酸），溫度30℃，時間12h時其浸提效果最好，浸提完成時優(yōu)化后的浸提液效價較優(yōu)化前高出17%。因而，選擇經(jīng)濟高效的分離法在鏈霉菌活性物質(zhì)分離純化中尤為重要。

3　鏈霉菌生物活性物質(zhì)分離純化技術(shù)及其進展

鑒于上述有關(guān)鏈霉菌生物活性物質(zhì)的特點，因而在對其進行分離純化時需要采用合理的分離手段，方可分離得到目標產(chǎn)物。目前鏈霉菌生物活性物質(zhì)的分離純化常用的方法主要包括：溶媒萃取法、色譜法（吸附色譜、凝膠色譜、離子交換、高效液相色譜）和膜分離法（納濾、超濾）。其中運用最多的是色譜法，當然，實際操作中根據(jù)被分離物質(zhì)的差異，多種分離技術(shù)的聯(lián)合使用將會使分離效果到達最佳。

3.1預(yù)分離

發(fā)酵液成分通常比較復(fù)雜，因而在分離純化之前必須對發(fā)酵液進行預(yù)處理，除去雜質(zhì)，分離菌絲體，同時一般還要對濾液進行改性，為進一步的提純做準備。對于胞外代謝物，發(fā)酵液經(jīng)離心過濾，上清液進行硫酸銨分級沉淀或超濾等法進行濃縮；鏈霉菌的胞內(nèi)產(chǎn)物需要破碎細胞后分離，除使用醇、丙酮沉淀外，多采用硫酸銨沉淀濃縮法。Beg等［12］將鏈霉菌QG-11-3發(fā)酵液溶解于60%的硫酸銨溶液中，隔夜（4℃），離心，將沉淀溶于100mmol/L的甘氨酸溶液中，分別采用NaOH緩沖液（pH8.6）和磷酸鹽緩沖液（pH3.0）透析24h得到部分純化的木聚糖酶（96IU/mL）和果膠酶（46IU/mL）。Pradeep G C等［13］將Streptomyces sp.CS 495發(fā)酵得到的粗樣品通過30%～80%硫酸銨分級沉淀，然后離心（6000r/min，1h，4℃），回收蛋白質(zhì)，用5ku的濾膜進行超濾，超濾液經(jīng)過透析（10mmol Tris/HCl，pH7.0），經(jīng)過Sepharose CL-6B柱（85cm×1.7cm；預(yù)平衡：10mmol Tris/HCl，pH7.0；洗脫流速：30mL/h）純化，得到純化7倍的堿性幾丁質(zhì)酶?？梢姡鳛轭A(yù)分離的主要手段沉淀、離心在分離初期發(fā)揮重要作用。

3.2溶媒萃取法

萃取主要應(yīng)用于整個分離純化過程的前階段，得到的是粗分離物質(zhì)。萃取中使用的溶劑主要是親水和親脂性的有機溶劑，如甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯等。例如在對螺旋霉素、紅霉素、麥迪霉素等的分離中多采用溶媒萃取法［14］。Makoto等［15］將Streptomycesviolaceusniger的發(fā)酵液離心后（6000r/min，20min，5℃）通過80%丙酮萃取，然后用丁醇提取，再離心，經(jīng)過離心分配色譜技術(shù)（流動相∶BuOH∶EtOH∶H2O=10∶2.5∶10；流速：3mL/min）得到粗產(chǎn)物，最后通過制備型HPLC（20mm×250mm；流動相：80%甲醇；流速：9.9mL/min）分離得到了三種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素RS-22A、B和C，三種化合物對真菌和革蘭氏陽性菌均顯示了良好的抑菌活性；Slim S［16］通過對鏈霉菌TN17發(fā)酵離心過濾的發(fā)酵液獲得的有機相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，得到提取物，溶解進5mL的二氯甲烷和甲醇中（9∶1）進行萃取，將得到的提取物使用Sephadex LH-20柱（洗脫液為二氯甲烷∶甲醇=9∶1）進行層析，最終通過TLC檢測得到三個有效活性組分，三者均對革蘭氏陽性菌以及真菌有抑制作用。當然隨著萃取分離技術(shù)的不斷發(fā)展，諸如固相微萃取技術(shù)［17］等也逐漸用于生物制品的分離工業(yè)中，與溶媒萃取相比它們更加高效環(huán)保。

3.3色譜法

色譜技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于鏈霉菌次級代謝產(chǎn)物的分離純化中。根據(jù)分離原理的不同，色譜法分為吸附色譜法、離子交換色譜法、凝膠色譜法以及高效液相色譜法。

3.3.1吸附色譜法吸附色譜法也稱液-固色譜法，它是基于溶質(zhì)和固體吸附劑上的固定活性位點之間的相互作用?？梢詫⑽絼┭b填于柱中。最常用的吸附劑是硅膠、大孔吸附樹脂等。

硅膠柱色譜法一次性層析獲得產(chǎn)品的純度通常不高，因而實際使用中需進行多次反復(fù)層析以期獲得高純度的產(chǎn)品。Houssam M等［18］對Streptomyces albidoflavus-143發(fā)酵液離心（5000r/min，20min）過濾，對上清液進行旋蒸濃縮后用石油醚沉淀（5000r/min，15min），繼而通過TLC（展開劑為氯仿∶甲醇=24∶1）分離單一組分，最后通過硅膠柱（2cm×25cm；洗脫劑為氯仿∶甲醇=9∶1）吸附收集組分，得到一種分子式為C22H36O6的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。段傳人等［19］通過對海洋鏈霉菌Streptomyces sp.SCSIO 1666發(fā)酵液首先進行離心（10min，3500r/min）棄上清，經(jīng)過丙酮萃取后進行乙醇洗脫，得到的產(chǎn)物通過100～200目硅膠柱層析（氯仿-甲醇10∶0～5∶5梯度洗脫），再通過反相硅膠（依次進行甲醇-水20%～100%梯度洗脫和氯仿-甲醇10∶0～8∶2梯度洗脫），減壓蒸干后得到替達霉素A（Tirandamycins A）。當改變萃取劑時，使用乙酸乙酯對離心后的發(fā)酵液萃取3次，得到產(chǎn)物過100～200目硅膠梯度柱層析，氯仿-甲醇（10∶0～5∶5）梯度洗脫，再經(jīng)300～400目硅膠梯度柱層析，洗脫，蒸干后經(jīng)反相硅膠柱（20%～100%甲醇-水梯度洗脫）最后得到替達霉素B（Tirandamycins B）。

大孔吸附樹脂可以有效地吸附具有不同化學性質(zhì)的各類化合物。吸附性能主要取決于吸附劑的表面性質(zhì)（親水性和疏水性）。根據(jù)樹脂的表面性質(zhì)分為非極性、中極性和極性三種類型［20］。在抗生素工業(yè)中，大孔吸附樹脂的應(yīng)用正在日益得到發(fā)展，應(yīng)用相當普遍。張珊珊［21］在星海鏈霉菌抑菌活性物質(zhì)的分離純化中先后使用大孔吸附樹脂HP-20（靜態(tài)吸附2h，對為吸附的組分用等體積的50%和100%乙醇液態(tài)解析1h）和葡聚糖凝膠Sephadex LH-20（1cm× 17cm；3倍柱體積水洗脫，10倍濃縮）進行分離發(fā)現(xiàn)，大孔吸附樹脂HP-20可有效的吸附發(fā)酵液中無活性的雜質(zhì)，葡聚糖凝膠Sephadex LH-20可有效分離活性組分。最后得到一種對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌株具有抑制活性的氨基糖苷類化合物。而在大孔吸附樹脂分離過程中由于分離物質(zhì)的性質(zhì)、洗脫劑的性質(zhì)、吸附的流速、樹脂的性能等因素的作用均會影響到大孔吸附樹脂的分離效果，因而在分離中需要篩選分離效果較好的樹脂及分離條件進行吸附分離。王海燕等［22］比較了不同樹脂對那他霉素分離效果后選擇大孔吸附樹脂HZ-816進行分離純化，當流速為1.0mL/min，洗脫劑為pH11的80%乙醇溶液時，吸附率和解吸率高，洗脫液雜質(zhì)少，解吸收率大于90%，產(chǎn)品純度大于98%。這一方法生產(chǎn)成本低、安全、收率高，可見具有很高的應(yīng)用價值。張楠等［23］對吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）BS-112通過大孔吸附樹脂X-5（40cm×2.6cm；振蕩吸附2.5h，3倍去離子水洗脫后用75%乙醇解析；流速：0.5mL/min；對活性組分減壓旋蒸）和硅膠柱層析（60cm×2.6cm，200～300目硅膠；洗脫液：甲醇∶氯仿=3∶2；流速：1.0mL/min；活性組分減壓旋蒸）分離，最后進行HPLC進一步純化（色譜條件為：色譜柱BEH C18，2.1mm× 50mm，1.7μm；柱溫30℃；檢測波長305nm；進樣量0.2μL；以0.2mL/min的流速洗脫15min）得到4種抗真菌活性組分（Tetrins A和B，Tetramycins A和B），它們對黃曲霉均具有良好的抑制作用。

3.3.2凝膠色譜法近年來凝膠色譜法廣泛用于分離小分子化合物。凝膠色譜的固定相一般是交聯(lián)度很高的聚丙烯酰胺、葡聚糖和瓊脂糖的凝膠。因其操作簡便快捷、數(shù)據(jù)可靠且重現(xiàn)性好，自動化程度高等優(yōu)點，應(yīng)用十分廣泛。Yang P等［24］對一種新分離的Streptomyces diastaticus代謝產(chǎn)物進行硅膠柱層析（硅膠為200～400目；洗脫劑：氯仿∶甲醇=40∶1）和葡聚糖凝膠Sephadex LH-20（洗脫劑：氯仿∶甲醇=1∶1）過濾，然后進一步提高C18快速柱層析（洗脫劑：甲醇∶水= 4∶1），最終得到兩種化合物寡霉素A和C，這是首次在S.diastaticus中發(fā)現(xiàn)寡霉素A和C。何峰［25］對鏈霉菌H03發(fā)酵產(chǎn)物采用先沉淀（8000r/min，20min）、后透析（分子截留量：20000u，透析48h）、再經(jīng)過Sephadex G-100柱層析（70cm×3cm；流動相：0.1mol/L NaCl溶液；流速：0.3mL/min）等技術(shù)純化，得到具有抗菌活性的多糖（由甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成2∶1∶1）。Lobna E［26］對Streptomyces TN262發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過兩次乙酸乙酯萃取后，經(jīng)過凝膠柱Sephadex LH-20（100cm×3cm；洗脫劑：二氯甲烷∶甲醇=5∶2）層析多次分離，收集得到八種組分，其中兩種屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素cineromycin B和2，3-dihydrocineromycin B。

3.3.3離子交換法離子交換法廣泛用于抗生素等小分子生物制品的分離純化。姬志勤等［27］對一株新放線菌-秦嶺鏈霉菌Streptomyces qinlingnensis sp.nov的抑菌活性成分進行分離時采用HD-2弱酸陽離子交換樹脂（分離初期需對上清液用草酸調(diào)pH3.5，靜置過濾再調(diào)pH8.0，以4L/h流速洗脫；柱型：Na+型，再用2.5L/h流速的1mol/L HCl解析）結(jié)合硅膠柱層析（2.0cm×80cm；洗脫劑：甲醇∶丙酮∶氨水=5∶5∶1），最終分離得到二丙酮胺，該物質(zhì)對多種病原真菌和細菌具有明顯抑菌活性。楊曉燕［28］對吸水鏈霉菌發(fā)酵上清液進行硫酸銨分級沉淀，后用Hitrap Q HP陰離子交換柱（洗脫劑：20mmol/L pH7.5的Tris-HCl；流速：0.4mL/min，含1mol/L的NaCl）除去色素，再先后經(jīng)Superdex 75 10/300 GL凝膠柱（洗脫劑：20mmol/L pH7.5的Tris-HCl；流速：0.4mL/min，含0.15mol/L的NaCl）和Hitrap Q HP陰離子交換柱（洗脫劑：20mmol/L pH8.5的Tris-HCl，含0.4mol/L的NaCl）分離得到高純度的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶。王澤根［29］利用陰離子交換樹脂330對達托霉素的純化工藝發(fā)現(xiàn)，當進行靜態(tài)吸附，溫度15～30℃，pH8.0～8.5，吸附時間為10h，洗脫劑為0.8mol/L NaCl水溶液時，達托霉素的純度由2%提高到60%，回收率87.5%，純化效果明顯。

3.3.4高效液相色譜法HPLC法對樣品的適應(yīng)性廣泛，不受樣品的熱穩(wěn)定性等限制，并且分離效果好，靈敏度高。目前最常用如反相高效液相色譜（RP-HPLC）。與正相高效液相色譜相比較其具有柱效高、使用壽命更長的優(yōu)點，幾乎對各種類型的有機化合物都呈現(xiàn)良好的選擇性。Ying等［30］將鏈霉菌Streptomyces griseoluteus P510的培養(yǎng)液進行乙酸乙酯萃?。╬H2.0，體積比1∶1）和硅膠柱層析（25cm× 1cm；洗脫劑：乙酸乙酯；流速：1.0mL/min）后，然后經(jīng)過C18反相高效液相層析（色譜柱：Agilent eclipse XDB-C185μm，4.6mm×250mm；流動相：甲醇∶水=50∶50；進樣量為20μL；流速1mL/min；柱溫30℃），最終得到2個純抗菌片段吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxylic acid，PCA），1-羥基吩嗪（1-hydroxyphenazine，1-OHPHZ）。張輝等［31］采用大孔吸附樹脂（無水乙醇洗脫）、硅膠柱層析（100～200目；洗脫液：氯仿∶甲醇=90∶10～70∶30梯度洗脫）和反相高效液相色譜（乙腈∶水=20∶80；流速1.5mL/min；λ=254nm）分離法對鏈霉菌HSHM-068主要次級代謝產(chǎn)物分離得到兩個musacins類化合物。

目前，在色譜分離技術(shù)領(lǐng)域不斷出現(xiàn)很多新型色譜技術(shù)，并且逐漸應(yīng)用于鏈霉菌生物活性物質(zhì)的分離純化中。彭飛等［32］首次利用高速逆流色譜（溶劑系統(tǒng)：乙酸乙酯∶正丁醇∶水=8∶1∶10；上相作為固定相，下相為流動相；轉(zhuǎn)速：890r/min，正轉(zhuǎn)；流速：0.5mL/min）和結(jié)晶法（4℃靜置過夜）結(jié)合的方法從S.castelarensis FIM95-F1的胞外分離純化得到抗真菌抗生素S1。王嬌艷［33］將高速逆流色譜技術(shù)（樣品純化前經(jīng)0.22μm微孔濾膜處理；循環(huán)器溫度20℃；轉(zhuǎn)速850r/min）應(yīng)用于抗霉素組分的分離中，該法可更大量且更快速的進行抗霉素組分的分離純化。

3.4膜分離法

膜技術(shù)不僅高效、能耗低、無相變，而且容易與其他分離技術(shù)整合。目前在鏈霉菌活性物質(zhì)分離純化中應(yīng)用有超濾，納濾法（分別為1000～30000u，200～1000u）。韓少卿等［34］利用超濾（分子截留量：5000ku；料液濃度：8%；壓力：0.22MPa）、納濾（分子截留量：800u；料液濃度：2%；壓力：1.5MPa；pH8.5）操作對產(chǎn)二素鏈霉菌（Streptomyces ambofabiens）發(fā)酵產(chǎn)物螺旋霉素進行板框過濾處理，收率可達76.3%，明顯高于傳統(tǒng)溶媒提取收率。Ana I等［35］研究了不同納濾膜對Streptomyces clavuligerus發(fā)酵液中克拉維酸的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Desal DK（美國OSMONICS公司生產(chǎn)的一種納濾膜）是最合適有效的過濾膜（分離條件：pH5.0；溫度：15℃±2℃；壓力：4.0MPa），其展現(xiàn)了很好的流通量，克拉維酸的截留率達到98.1%。膜過濾效率雖然明顯，但是其多作為分離純化操作的中間環(huán)節(jié)，經(jīng)純化的物質(zhì)，需要進一步進行色譜分離，陸穎健［36］對海洋鏈霉菌GB-2抗菌物質(zhì)分離超濾時，發(fā)現(xiàn)抗菌物質(zhì)可以通過分子截留量≤1ku的超濾膜，濾液（pH4.0的鹽酸溶液預(yù)處理12h，酸沉后的收集液分別經(jīng)過乙酸乙酯和正己烷萃取，旋蒸濃縮）進一步經(jīng)Sephadex LH-20色譜柱（2.6cm×100cm；甲醇∶水= 3∶7；流速：15mL/min）分離后得到兩種抑菌物質(zhì)，對蠟樣芽孢桿菌等致病菌具有明顯抑制作用。

綜上可見，對于不同的分離對象需要選擇合適的分離法，以達到預(yù)期效果。一些鏈霉菌生物活性物質(zhì)的常用分離方法總結(jié)見表2。

表2　鏈霉菌生物活性物質(zhì)常用分離方法Table 2　Separation and purification technologies of bioactive metabolites from Streptomyces

4　結(jié)語

鏈霉菌生物活性物質(zhì)分離純化技術(shù)發(fā)展的趨勢將會是：

a.多種分離技術(shù)的聯(lián)合使用。目前，針對目標物質(zhì)的特點，如何將這些分離提取技術(shù)聯(lián)用，以更短時間更低能耗提取得到更高產(chǎn)率物質(zhì)，已成為天然產(chǎn)物分離提取方法的研究熱點。如高速逆流色譜法和結(jié)晶法同時使用［32］，大孔吸附樹脂層析、中壓制備液相色譜、高速逆流色譜制備型高效液相色譜結(jié)合的分離法［50］。多種分離方法的整合將會大大提高分離純化的效率和產(chǎn)品純度。

b.新興分離技術(shù)，如逐漸被應(yīng)用于天然產(chǎn)物分離的分子印跡技術(shù)（MIT），此外包括對傳統(tǒng)分離技術(shù)在機理和材料上進行改進的超臨界萃取、超臨界流體色譜及液膜技術(shù)等。這些分離技術(shù)手段極大豐富了鏈霉菌活性物質(zhì)分離手段。

c.吸附色譜、離子交換色譜及凝膠色譜仍然是當前生物活性物質(zhì)分離中最主要的分離手段。層析過程的放大技術(shù)是天然產(chǎn)物分離過程中常用到的。工業(yè)生產(chǎn)過程需放大幾十至幾百倍，放大效應(yīng)顯著。因而，研究大型層析柱的放大效應(yīng)及結(jié)構(gòu)優(yōu)化將是十分重要的課題。

在鏈霉菌活性代謝產(chǎn)物研究方面要加大對極端環(huán)境（高鹽、高壓、高寒等）、海洋等的研究，以期分離新的鏈霉菌和新型代謝產(chǎn)物。在分離純化中要整合結(jié)構(gòu)解析技術(shù)（紅外、質(zhì)譜等），實時分析分離物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，提高新化合物發(fā)現(xiàn)的機會。對分離純化過程要進行優(yōu)化，提高產(chǎn)率的同時要縮短分離的流程、簡化分離提純步驟，積極開發(fā)具有反饋檢測控制的工藝過程，提高產(chǎn)品純度。

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Separation and purification technologies of bioactive metabolites from Streptomyces

WANG Kai1，LI Ting2，SHI Rui-fang3，LI Shi-weng1，*
（1.School of Chemical and Biological Engineering，Lanzhou Jiaotong University，Lanzhou 730070，China；2.Key Laboratory of Extreme Environmental Microbial Resources and Engineering Gansu Province，Lanzhou 730070，China；3.Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Research Institute，Chinese Academy of Sciences，Lanzhou 730030，China）

A large number of bioactive substances，such as antibiotics，antineoplastic drugs and enzymes were mainly derived from actinomycetes，especially from streptomyces.Streptomyces could produce many active metabolites which had tremendous commercial and medical exploitation value.In this paper，the separation and purification technologies of bioactive microbial metabolites were reviewed and the research trends were discussed.

Streptomyce；bioactive microbial metabolites；separation and purification technologies

TS201.1

A

1002-0306（2015）14-0373-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.069

2014－10－13

王凱（1989-），男，在讀碩士研究生，研究方向：資源微生物。

李師翁（1963-），男，博士，教授，研究方向：環(huán)境分子生物學。

國家自然科學基金資助項目（31260090）。