何　鋼，劉　嵬，鄔曉勇，劉坤平，梁　立，彭靈犀，戴　欣，顏　軍，茍小軍

（成都大學(xué)藥食同源植物資源開(kāi)發(fā)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610106）

HPLC-RI法測(cè)定食用酵母的海藻糖含量

何鋼，劉嵬，鄔曉勇，劉坤平，梁立，彭靈犀，戴欣，顏軍，茍小軍*

（成都大學(xué)藥食同源植物資源開(kāi)發(fā)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都610106）

目的：建立酵母海藻糖的提取方法，并比較啤酒酵母、葡萄酒酵母、高活性酵母、釀酒高活性酵母的海藻糖含量。方法：酵母菌體經(jīng)液氮研磨后以乙醇-水溶液為溶媒，通過(guò)超聲波輔助的方法提取海藻糖，采用HPLC法分析海藻糖含量。以釀酒高活性酵母為例，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酵母菌海藻糖的提取工藝，并比較4株食用酵母菌海藻糖的含量。結(jié)果：酵母菌細(xì)胞海藻糖提取的最優(yōu)工藝條件為：在80℃的條件下，乙醇濃度為50%，料液比1∶15（g∶mL），提取時(shí)間70min，海藻糖得率達(dá)（68.10±0.7）mg/g，四株食用酵母菌海藻糖含量大小次序?yàn)椋横劸聘呋钚越湍福靖呋钚越湍福酒咸丫平湍福酒【平湍?。結(jié)論：優(yōu)化的酵母海藻糖提取的工藝簡(jiǎn)單，得率高；方法學(xué)分析顯示HPLCRI分析海藻糖含量方法準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，方便快捷；不同生產(chǎn)用途的酵母菌株海藻糖含量存在差異。

高效液相色譜，食用酵母，海藻糖，含量

海藻糖（Trehalose）由2個(gè)葡萄糖單元通過(guò)α，α-1，1糖苷鍵鏈接而成的非還原性雙糖，廣泛存在于藻類(lèi)、細(xì)菌、真菌、低等植物、昆蟲(chóng)和其他無(wú)脊椎動(dòng)物中。海藻糖化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，易溶于水和熱醇，具有非特異性保護(hù)、抗輻射、保濕、防腐等特性［1］。海藻糖主要存在于酵母細(xì)胞的子囊孢子和細(xì)胞質(zhì)中，因此提取時(shí)需要進(jìn)行細(xì)胞破碎讓海藻糖溶出。酵母海藻糖的抽提溶劑包括三氯乙酸、乙醇、水等。酵母菌提取液的組分復(fù)雜，溶液中的海藻糖含量分析方法主要有紙層析、薄層層析［2］、離子色譜法［3］、氣相色譜［4］、高效液相色譜［5-6］、蒽酮比色［7］、酶分析［8］等方法。其中紙層析、薄層層析、蒽酮-硫酸法分析靈敏度較低，操作繁瑣，雜質(zhì)干擾較大，準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性較差以至于不能準(zhǔn)確定量。氣相色譜法需要衍生化后進(jìn)行分析，操作繁瑣。酶分析法成本較高，操作復(fù)雜。高效液相色譜示差折光法（HPLC-RI）可以通過(guò)優(yōu)化色譜條件將海藻糖和雜質(zhì)分開(kāi)，具有快速、準(zhǔn)確定性和定量分析的特點(diǎn)。酵母菌在不同的脅迫條件下其海藻糖的積累量會(huì)迅速上升，如高壓處理、外加乙醇處理、熱休克處理、短時(shí)饑餓處理。文獻(xiàn)［1，7］報(bào)道酵母菌體的海藻糖含量存在差異，這與分析方法，酵母培養(yǎng)方法以及是否受到環(huán)境脅迫等原因相關(guān)。然而酵母正常生長(zhǎng)條件下的海藻糖含量以及酵母菌種間海藻糖含量差異報(bào)道較少。本文將四株食用酵母菌進(jìn)行液體培養(yǎng)，收集菌體、優(yōu)化抽提海藻糖工藝并分析其含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為采用HPLC-RI檢測(cè)篩選海藻糖高產(chǎn)菌株提供參考，也有助于解釋酵母菌種間差異和生產(chǎn)用途差異。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

釀酒高活性酵母菌、高活性酵母菌、葡萄酒酵母菌購(gòu)買(mǎi)于安琪酵母公司，經(jīng)劃線分離保藏于成都大學(xué)藥食同源植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；啤酒酵母菌由萬(wàn)萍副教授提供的金威啤酒原麥汁中分離純化得到，經(jīng)鑒定后，保藏于成都大學(xué)藥食同源植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；海藻糖Sigma公司購(gòu)買(mǎi)；乙腈色譜純；無(wú)水乙醇成都市科龍化工試劑廠；其他試劑均為分析純。

L-2000型高效液相色譜儀、L-2490型示差折光檢測(cè)器日本Hitachi公司；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；CT15RT型冷凍離心機(jī)上海天美儀器公司；BS110S型分析天平上海賽多利斯公司；LDZX-75KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；SHZ-82型水浴恒溫振蕩器江蘇金壇實(shí)驗(yàn)儀器廠；KQ-400KDE型超聲清洗器昆山市超聲儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1色譜條件根據(jù)文獻(xiàn)［9-10］中的方法選擇Sugar-D色譜柱（4.6mm×250mm i.d.，5μm），流動(dòng)相為乙腈-純水混合體系（乙腈∶純水為80∶20、78∶22、76∶24、74∶26），流速1mL/min，進(jìn)樣量20μL，柱溫35℃，示差折光檢測(cè)器（RI）檢測(cè)。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱(chēng)取烘干至恒重的海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品50.0mg，于10.0mL的容量瓶中，用超純水溶解并定容至10.0mL，配制成5mg/mL的儲(chǔ)備液，按濃度減半逐級(jí)稀釋成5個(gè)濃度梯度，并進(jìn)行色譜分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，海藻糖的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3酵母細(xì)胞樣品制備四株酵母菌采用YPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3d，發(fā)酵液6000r/min離心10min獲得酵母菌體，菌體經(jīng)蒸餾水反復(fù)洗滌，吸水紙吸干菌體水分后液氮充分研磨酵母細(xì)胞備用。

1.2.4單因素篩選酵母海藻糖提取條件預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明釀酒高活性酵母海藻糖含量較高，以其為材料對(duì)提取溫度、乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比進(jìn)行優(yōu)化，確定海藻糖提取的最佳條件，得率（mg/g）=提取的海藻糖總質(zhì)量/鮮酵母樣品質(zhì)量，各組數(shù)據(jù)以±sD表示。

1.2.4.1提取溫度稱(chēng)取15份1.0g鮮酵母樣品，乙醇濃度為50%，提取時(shí)間40min，料液比1∶10，提取溫度分別為40、50、60、70、80℃條件下超聲（200W）提取海藻糖，將提取液以12000r/min的速度離心10min，收集上清液，各取2mL上清液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液按照“1.2.1”的色譜條件分析海藻糖的得率，每個(gè)溫度梯度重復(fù)3次。

1.2.4.2乙醇濃度稱(chēng)取15份1.0g鮮酵母樣品，在選擇的最佳溫度條件下，乙醇濃度為30%、40%、50%、60%、70%，提取時(shí)間40min，料液比1∶10，超聲（200W）提取海藻糖，后續(xù)處理及分析同上。每個(gè)乙醇濃度梯度重復(fù)3次。

1.2.4.3提取時(shí)間稱(chēng)取15份1.0g鮮酵母樣品，料液比1∶10，提取時(shí)間40、50、60、70、80min，在最佳提取溫度和乙醇濃度條件下分別超聲（200W）提取海藻糖，后續(xù)處理及分析同上，每個(gè)時(shí)間梯度重復(fù)3次。

1.2.4.4提取料液比稱(chēng)取15份1.0g鮮酵母樣品，料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，在選擇的最佳溫度、乙醇濃度、提取時(shí)間條件下超聲（200W）提取海藻糖，后續(xù)處理及分析同上，每個(gè)料液比梯度重復(fù)3次。

1.2.5正交實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，因素水平表見(jiàn)表1。

表1　正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1　Factors and levels of orthogonal experimental design

1.2.6四株酵母海藻糖含量分析分別稱(chēng)取制備的鮮酵母細(xì)胞樣品各3份，每份10.0g，按照“1.2.5”優(yōu)化的提取工藝條件制備海藻糖供試樣品溶液，樣品溶液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液進(jìn)行色譜分析。將供試樣品對(duì)應(yīng)海藻糖的峰面積代入回歸方程計(jì)算樣品中海藻糖含量。

2　結(jié)果及分析

2.1色譜條件的選擇

圖1　海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1　HPLC chromatogram of trehalose standard

海藻糖樣品溶液分析時(shí)考察了流動(dòng)相組成（乙腈∶純水）的比例，結(jié)果表明乙腈∶純水為78∶22時(shí)，分離效果最好。分別取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和四株酵母菌海藻糖供試品溶液進(jìn)樣分析結(jié)果如圖1、圖2所示。從圖1～圖2中可見(jiàn)，海藻糖和其他峰能完全分離（分離度＞1.5）。

圖2　食用酵母菌提取液中海藻糖色譜圖Fig.2　HPLC chromatogram of trehalose from extraction of edible yeast

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按“1.2.2”精密量取海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液，用純水稀釋成質(zhì)量濃度分別為5、2.5、1.25、0.625、0.3125mg/mL的工作液進(jìn)行色譜分析。以峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X，mg/mL）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明：海藻糖在所測(cè)定的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其回歸方程為Y=1064458.74X+9866.00（R2=0.9997）。

圖3　海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3　Standard curve of trehalose

2.3海藻糖提取條件優(yōu)化

2.3.1提取溫度對(duì)海藻糖提取的影響溫度是一個(gè)重要因素，升高溫度有助于溶脹的細(xì)胞壁的崩解，內(nèi)容物的溢出。由圖4可以看出隨著提取溫度的升高，海藻糖的得率也隨之增加，溫度從40～70℃時(shí)，海藻糖的得率呈增加趨勢(shì)，得率達(dá)到（31.11±1.28）mg/g，80℃提取時(shí)，乙醇揮發(fā)量增加，海藻糖得率略有降低，因此選取70℃進(jìn)行后續(xù)條件篩選。

圖4　提取溫度對(duì)海藻糖得率的影響Fig.4　Effect of temperature on yield of trehalose

圖5　乙醇濃度對(duì)海藻糖得率的影響Fig.5　Effect of concentration of ethanol on yield of trehalose

2.3.2乙醇濃度對(duì)海藻糖得率的影響海藻糖能夠溶于水和熱乙醇溶液中，乙醇能夠沉淀酵母細(xì)胞溶出的蛋白、核酸和多糖，有利于后續(xù)的分析。圖5結(jié)果表明隨著乙醇濃度增加得率隨之增高，當(dāng)濃度為50%時(shí)得率達(dá)到（39.05±1.8）mg/g，乙醇濃度進(jìn)一步增加時(shí)，得率沒(méi)有明顯增加，選擇50%乙醇濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3.3提取時(shí)間對(duì)海藻糖提取的影響圖6表明提取時(shí)間為40～70min時(shí)，海藻糖得率呈增加的趨勢(shì)，提取時(shí)間為70min時(shí)，海藻糖的得率達(dá)到（44.08±1.28）mg/g，提取時(shí)間為80min時(shí)得率為（43.88±2.6）mg/g未呈現(xiàn)明顯增加趨勢(shì)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)乙醇揮發(fā)量增加，從經(jīng)濟(jì)成本和時(shí)間考慮，提取最佳時(shí)間為70min。

圖6　提取時(shí)間對(duì)海藻糖得率的影響Fig.6　Effect of extraction time on yield of trehalose

2.3.4料液比對(duì)海藻糖提取的影響料液比的選擇要考慮提取物的得率，同時(shí)也要考慮提取液的后續(xù)處理成本。由圖7可以看出隨著料液比的增加，海藻糖的得率也隨之增加，當(dāng)料液比為1∶15時(shí)得率達(dá)到（37.47±1.33）mg/g，而料液比為1∶20時(shí)得率為（36.09± 2.08）mg/g，得率呈降低趨勢(shì)，考慮提取液的后續(xù)處理方便，最佳料液比選取1∶15進(jìn)行海藻糖的提取。

圖7　料液比對(duì)海藻糖得率的影響Fig.7　Effect of rate of material to water on yield of trehalose

2.3.5正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝分別取各單因素中最優(yōu)的3水平，采用L9（34）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

由方差分析結(jié)果可知影響海藻糖得率影響的大小順序?yàn)椋毫弦罕龋疽掖紳舛龋咎崛r(shí)間＞提取溫度，即D＞B＞C＞A。綜合各因素，最優(yōu)的提取工藝為：A3B2C2D3，即提取溫度為80℃，乙醇濃度為50%，提取時(shí)間70min，料液比1∶15，在該最佳條件下對(duì)工藝進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)3組，海藻糖的得率為（68.10±0.7）mg/g。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1精密度實(shí)驗(yàn)取同一海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定海藻糖峰面積。峰面積的RSD值為2.67%，表明精密度良好。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　Results of orthogonal experimental design

2.4.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確稱(chēng)取6份酵母樣品，按“2.3.5”篩選的條件制備6份供試樣品溶液，進(jìn)行色譜分析，記錄峰面積，峰面積的RSD值為3.4%，表明重復(fù)性良好。

2.4.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一海藻糖提取樣品溶液，每隔2h進(jìn)樣1次，0～10h內(nèi)測(cè)定6次并記錄峰面積。結(jié)果峰面積的RSD值為4.16%，表明海藻糖提取樣品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4加樣回收率精密稱(chēng)取1.0g釀酒酵母樣品9份，分別加入海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液12、15、18mL，按最佳提取方法制備供試樣品溶液各3份，分析海藻糖含量并計(jì)算加樣回收率。不同加樣量的平均回收率分別為104.1%、103.5%、99.3%，RSD值分別為2.3%、2.6%、2.7%，表明該方法的準(zhǔn)確度較高，可以作為酵母菌海藻糖含量檢測(cè)。

2.5四株食用酵母中海藻糖的含量分析結(jié)果

各酵母樣品按“2.3.5”篩選的條件制備海藻糖供試樣品溶液進(jìn)行色譜分析，將峰面積A代入回歸方程計(jì)算供試樣品溶液中海藻糖濃度。經(jīng)計(jì)算啤酒酵母海藻糖含量（22.33±1.21）mg/g，葡萄酒酵母海藻糖含量（36.79±1.54）mg/g，高活性酵母海藻糖含量（41.90±1.32）mg/g，釀酒高活性酵母海藻糖含量（69.11±1.27）mg/g。則四種食用酵母通過(guò)液體培養(yǎng)獲得的菌體中海藻糖含量高低次序是釀酒高活性酵母＞高活性酵母＞葡萄酒酵母＞啤酒酵母。

3　結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酵母海藻糖的提取工藝，該工藝簡(jiǎn)單，得率高；并借助高效液相色譜-示差折光檢測(cè)（HPLC-RI）技術(shù)，建立了酵母海藻糖的定量方法，同其他的檢測(cè)方法相比，該方法準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，方便快捷，為海藻糖高產(chǎn)菌株的篩選提供參考。同時(shí)本研究比較了相同培養(yǎng)條件下的四種酵母菌海藻糖的含量，研究結(jié)果表明海藻糖含量存在明顯的差異，進(jìn)一步佐證了酵母菌種間差異，種間生境差異以及生產(chǎn)用途差異。

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Determination of trehalose content of edible yeast by HPLC-RI

HE Gang，LIU Wei，WU Xiao-yong，LIU Kun-ping，LIANG Li，PENG Ling-xi，DAI Xin，YAN Jun，GOU Xiao-jun*
（Key Laboratory of Medicinal and Edible Plants Resources Development of Sichuan Education Department，Chengdu University，Chengdu 610106，China）

Objective：To establish a method of trehalose extraction from yeast，and compare trehalose content from beer yeast（Saccharomyces cerevisiae），Saccharomyces ellipsoideus，high-activity dry yeast（Saccharomyces cerevisiae），high-activity Saccharomyces cerevisiae.Methods：Yeast was grinded firstly in liquid nitrogen，and then of extracted trehalose with ethanol-water solution by ultrasonic assisted，trehalose content was analysed by high performance liquid chromatography（HPLC-RI）.Saccharomyces cerevisiae as a material，extraction conditions of trehalose was optimized by orthogonal experiment based on single factor experiment.The content of trehalose from four edible yeast strains was compared.Results：The results showed that the optimal method for extraction of trehalose were as follows：extraction temperature 80℃，ethanol concentration 50%，ratio of material to water 1∶15（g∶mL），extraction time 70min，then the yield of trehalose was（68.10±0.7）mg/g.The order of trehalose content of four edible strains was Saccharomyces cerevisiae＞high-activity dry yeast（Saccharomyces cerevisiae）＞Saccharomyces ellipsoideus＞beer yeast（Saccharomyces cerevisiae）.Conclusion：Optimization of yeast trehalose extraction process was simple，high extraction efficiency.Methodology investigation results showed that analysis the content of trehalose by HPLC-RI was accurate，repeatability，convenient and quick. The content of trehalose from the yeast strains different production uses was different.

HPLC；edible yeast；trehalose；content

TS207.3

A

1002-0306（2015）14-0049-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.001

2014－09－26

何鋼（1982-），男，博士，講師，研究方向：糖生物化學(xué)。

茍小軍（1974-），男，博士，教授，研究方向：糖生物化學(xué)。

四川省杰出青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人培育計(jì)劃（2012JQ0044）；四川省教育廳項(xiàng)目（14ZB0374）；成都大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（CDU_CX_201101034）。