祖　　昕，董會娜，李　　寧，3，張大偉，*，孫玉梅

（1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116034；2.中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津300308；3.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000）

響應(yīng)面法優(yōu)化腺苷脫氨酶法快速檢測發(fā)酵液中的腺苷含量

祖昕1，2，董會娜2，李寧2，3，張大偉2，*，孫玉梅1，*

（1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連116034；2.中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津300308；3.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000）

通過腺苷脫氨酶（ADA）與靛酚藍(lán)方法結(jié)合建立一種高通量快速檢測腺苷的新方法。通過單因素、響應(yīng)面方法優(yōu)化氫氧化鈉、水楊酸、亞硝基鐵氰化鈉和次氯酸鈉的用量，并進(jìn)行了驗(yàn)證，以最優(yōu)試劑用量建立腺苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線。確定了檢測腺苷的最優(yōu)試劑用量氫氧化鈉25.85g/L、水楊酸68.05g/L、亞硝基鐵氰化鈉2.19g/L和次氯酸鈉40.9mL/L，該方法線性范圍為0.01～10mmol/L，加標(biāo)回收率在95.5%～103.8%之間，RSD精準(zhǔn)度在0.9%～3.3%之間。本方法與HPLC法檢測發(fā)酵液中的腺苷含量結(jié)果一致。本方法可以用來快速、高通量的檢測發(fā)酵液中的腺苷含量。

腺苷，腺苷脫氨酶，高通量篩選，響應(yīng)面

腺苷又稱腺嘌呤核苷，是酶反應(yīng)和細(xì)胞修復(fù)所需輔助因子的重要組成部分，在神經(jīng)傳遞中起著重要的作用［1-2］。由于腺苷具有減慢心律、增強(qiáng)心肌對缺血的耐受力等保護(hù)心臟的功能，現(xiàn)已被廣泛的應(yīng)用在醫(yī)療和保健食品領(lǐng)域［3-5］。同時(shí)，腺苷還是合成多種藥用核苷類物質(zhì)的醫(yī)藥中間體，目前已成功的合成腺苷酸、三磷酸腺苷等藥用物質(zhì)以及嘌呤霉素、s-腺苷蛋氨酸等核苷類抗菌素［6］。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)核苷類物質(zhì)始于1968年，小西八真［7］第一次成功的以枯草芽孢桿菌異亮氨酸缺陷型發(fā)酵法生產(chǎn)鳥苷。發(fā)酵法主要是以枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌株，經(jīng)誘變篩選出黃嘌呤缺陷、抗嘌呤結(jié)構(gòu)類似物等表型，從而得到腺苷的高產(chǎn)菌株［8-9］。

在微生物代謝過程中，腺苷作為產(chǎn)物會被釋放到培養(yǎng)基中，為了驗(yàn)證微生物生產(chǎn)腺苷的能力，需要測定培養(yǎng)基中腺苷的含量。目前腺苷測定的常用方法主要包括紙層析法和高效液相色譜法（HPLC）。紙層析法檢測腺苷精度不高，而且所用的有機(jī)溶劑如丙酮等，具有一定的揮發(fā)性和毒性。HPLC法雖然檢測結(jié)果精準(zhǔn)可靠，可用于檢測微量腺苷，但是儀器成本過高，檢測時(shí)間較長，不適用于快速、高通量的檢測。另外，還有基于腺苷與其適體特異性識別和腺苷適體偶聯(lián)金納米粒子自組裝導(dǎo)致共振光散射信號放大建立的腺苷檢測新方法，但仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。本研究將腺苷脫氨酶（ADA）和靛酚藍(lán)方法結(jié)合建立一種新的、快速檢測腺苷的方法。ADA水解腺苷生成銨，在亞硝基鐵氰化鈉的作用下銨可以與水楊酸、次氯酸離子在堿性條件下反應(yīng)生成水溶性藍(lán)色化合物，通過該化合物顏色的變化可以對腺苷濃度進(jìn)行檢測［10-11］。本方法操作簡便、快速，可節(jié)省大量的人力物力，同時(shí)可用于快速檢測發(fā)酵液中的腺苷產(chǎn)量及進(jìn)行腺苷高產(chǎn)菌株的高通量篩選。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ZX05中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所保藏；LB固體培養(yǎng)基自制；M9培養(yǎng)基（不含硫酸銨，含2g/L尿素） 自制；0.01mol/L PBS緩沖液自制；試劑A25.85g/L氫氧化鈉，68.05g/L水楊酸，2.19g/L亞硝基鐵氰化鈉；試劑B40.9mL/L次氯酸鈉；腺苷（Adenosine）標(biāo)準(zhǔn)品Sigma公司；腺苷脫氨酶（ADA） 上海金穗生物科技有限公司；氫氧化鈉、水楊酸、亞硝基鐵氰化鈉、次氯酸鈉（含5%活性氯）、氯化銨均為分析純；乙腈HPLC級。

Spectramax M5連續(xù)多波長多功能讀板機(jī)Molecular Devices公司；1260 series高效液相色譜儀Agilent公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1菌種活化取-80℃保藏的菌種劃線接種于LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱恒溫靜置培養(yǎng)14～16h。

1.2.2種子培養(yǎng)挑取LB固體培養(yǎng)基上的一個單菌落接于裝有50mL LB培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，37℃，200r/min，培養(yǎng)12h。

1.2.3搖瓶發(fā)酵取0.5mL的種子液接于裝有50mL M9培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，37℃，200r/min，培養(yǎng)48h。

1.2.4腺苷檢測試劑的單因素優(yōu)化

1.2.4.1氫氧化鈉對顯色反應(yīng)的影響取25μL 10mmol/L的氯化銨溶液，加入50μL終濃度為17.5、20、22.5、25、30g/L氫氧化鈉溶液、50μL 62g/L水楊酸溶液、50μL 2g/L亞硝基鐵氰化鈉溶液和50μL 60mL/L次氯酸鈉溶液，37℃恒溫箱溫浴30min。以超純水為參比，測定OD696的變化情況，每個濃度重復(fù)3次。

1.2.4.2水楊酸對顯色反應(yīng)的影響取25μL 10mmol/L的氯化銨溶液，加入50μL 25g/L氫氧化鈉溶液、50μL終濃度為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85g/L水楊酸溶液、50μL 2g/L亞硝基鐵氰化鈉溶液和50μL 60mL/L次氯酸鈉溶液，37℃恒溫箱溫浴30min。以超純水為參比，測定OD696的變化情況，每個濃度重復(fù)3次。

1.2.4.3亞硝基鐵氰化鈉對顯色反應(yīng)的影響取25μL 10mmol/L的氯化銨溶液，加入50μL 25g/L氫氧化鈉溶液、50μL 65g/L水楊酸溶液、50μL終濃度為0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3、3.5、4g/L亞硝基鐵氰化鈉溶液和50μL 60mL/L次氯酸鈉溶液，37℃恒溫箱溫浴30min。以超純水為參比，測定OD696的變化情況，每個濃度重復(fù)3次。

1.2.4.4次氯酸鈉對顯色反應(yīng)的影響取25μL 10mmol/L的氯化銨溶液，加入50μL 25g/L氫氧化鈉溶液、50μL 65g/L水楊酸溶液、50μL 1.5g/L亞硝基鐵氰化鈉溶液和50μL終濃度為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100mL/L次氯酸鈉溶液，37℃恒溫箱溫浴30min。以超純水為參比，測定OD696的變化情況，每個濃度重復(fù)3次。

1.2.5響應(yīng)面分析法優(yōu)化腺苷檢測試劑在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，著重考查氫氧化鈉濃度（A）、水楊酸濃度（B）、亞硝基鐵氰化鈉濃度（C）和次氯酸鈉濃度（D）對腺苷檢測的影響。運(yùn)用Design Expert 8.0軟件程序，根據(jù)CCD［12］中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用四因素五水平響應(yīng)面（RSM）［13-14］分析方法，以吸光度值為響應(yīng)值Y做響應(yīng)面，對各試劑濃度進(jìn)行優(yōu)化，因素水平如表1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行處理。

表1　CCD因素水平及編碼Table 1　Variables and levels used for CCD

1.2.6腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確稱取腺苷標(biāo)準(zhǔn)品適量，加M9培養(yǎng)基溶解制成10mmol/L的溶液。分別吸取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行稀釋，使腺苷終濃度為0.01、0.025、0.05、0.075、0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mmol/L。取25μL腺苷溶液，加入100μL 0.01mol/L的PBS緩沖液，再加入1μL ADA，37℃恒溫箱溫浴40min后，加入50μL試劑A、50μL試劑B，再放入37℃恒溫箱溫浴30min。以不加ADA的反應(yīng)體系作為空白參比，在696nm處測其吸光度值。以吸光度值（y）對腺苷濃度（x）作圖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7發(fā)酵液中的腺苷含量檢測將產(chǎn)腺苷枯草芽孢桿菌ZX05發(fā)酵24h的發(fā)酵液12000r/min離心3min，取25μL上清液，按照1.2.6的方法，以相應(yīng)的發(fā)酵液作為空白參比，測定OD696的值。同時(shí)取上清液1mL過濾進(jìn)行HPLC分析，根據(jù)保留時(shí)間定性，峰面積定量。HPLC條件：色譜柱為Agilent C18柱（250mm×416mm，5μm），流動相為水（pH=3.0）∶乙腈=94∶6，流速0.8mL/min，檢測波長280nm，柱溫35℃，進(jìn)樣量10μL。

1.2.8加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)取1.2.7中離心過的上清液與適量的腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，使腺苷溶液終濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1、2mmol/L。以相應(yīng)的發(fā)酵液作為空白參比，按1.2.6的方法檢測加標(biāo)樣本。

2　結(jié)果與分析

2.1最大吸收波長的測定

取25μL 10mmol/L的氯化銨溶液，加入50μL 25g/L氫氧化鈉溶液、50μL 62g/L水楊酸溶液、50μL 2g/L亞硝基鐵氰化鈉溶液和50μL 60mL/L次氯酸鈉溶液，37℃恒溫箱溫浴30min。在波長450～750nm之間進(jìn)行掃描，隨后又進(jìn)一步縮小掃描范圍，吸光度值曲線見圖1和圖2。由圖2可知，在696nm處有一強(qiáng)吸收峰，選定此波長作為測定波長。

圖1　 波長掃描圖Fig.1　Scanning of wavelength

圖2　 波長掃描圖Fig.2　Scanning of wavelength

2.2單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1氫氧化鈉對顯色反應(yīng)的影響由圖3可知，在氫氧化鈉濃度為25g/L時(shí)，吸光度值最大。因此，實(shí)驗(yàn)選取氫氧化鈉溶液濃度為25g/L。

2.2.2水楊酸對顯色反應(yīng)的影響由圖4可知，在水楊酸溶液濃度為65g/L時(shí)，吸光度值最大。因此，實(shí)驗(yàn)選取水楊酸溶液濃度為65g/L。

2.2.3亞硝基鐵氰化鈉對顯色反應(yīng)的影響由圖5可知，在亞硝基鐵氰化鈉溶液濃度為1.5g/L時(shí)，吸光度值最大。因此，實(shí)驗(yàn)選取亞硝基鐵氰化鈉溶液濃度為1.5g/L。

圖3　氫氧化鈉對顯色反應(yīng)的影響Fig.3　The effects of sodium hydroxide on the absorbance

圖4　水楊酸對顯色反應(yīng)的影響Fig.4　The effects of salicylic acid on the absorbance

圖5　亞硝基鐵氰化鈉對顯色反應(yīng)的影響Fig.5　The effects of sodium nitroferricyanide on the absorbance

圖6　次氯酸鈉對顯色反應(yīng)的影響Fig.6　The effects of sodium hypochlorite on the absorbance

2.2.4次氯酸鈉對顯色反應(yīng)的影響由圖6可知，在次氯酸鈉溶液濃度為60mL/L時(shí)，吸光度值最大。因此，實(shí)驗(yàn)選取次氯酸鈉溶液濃度為60mL/L。

2.3響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果根據(jù)CCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取氫氧化鈉、水楊酸、亞硝基鐵氰化鈉和次氯酸鈉濃度4個因素，進(jìn)行四因素五水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，共30個實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2　中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　Experimental design and results based on CCD

2.3.2數(shù)學(xué)模型的建立及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析對表2進(jìn)行方差分析及多元回歸分析。方差分析（ANOVA）及回歸系數(shù)的顯著性分析采用F檢驗(yàn)，p值用來評估各個變量對吸光度值的影響，以p值（Prob＞F）＜0.05判定某模擬項(xiàng)為顯著項(xiàng)［15］。方差分析結(jié)果見表3，得到的回歸模型為：

Y=8.04-0.10A+0.37B+0.16C-0.21D+0.05AB+ 0.01AC-0.04AD+0.13BC+0.07BD-0.13CD-0.12A2-0.13B2-0.23C2-0.08D2

由表3可知，回歸模型的顯著性水平p=0.0005＜0.05，說明此模型顯著。失擬項(xiàng)p=0.2895＞0.05，影響不顯著，且回歸方程的R2=0.8545，說明該模型的擬合效果較好，可以用該回歸方程代替真實(shí)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

表3　二次方模型ANOVA分析Table 3　ANOVA for quadratic model

表4　響應(yīng)面模型中變量的回歸系數(shù)和重要水平Table 4　Regression coefficients and their significance for response surface model

回歸模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表4。檢驗(yàn)結(jié)果表明，水楊酸、亞硝基鐵氰化鈉溶液濃度的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)、次氯酸鈉溶液濃度的一次項(xiàng)、氫氧化鈉溶液濃度的二次項(xiàng)為顯著項(xiàng)，交互項(xiàng)影響不顯著。

圖7　氫氧化鈉和水楊酸對吸光度值產(chǎn)生的交互影響Fig.7　Effect of the interaction between sodium hydroxide and salicylic acid on OD696

等高線的形狀可以反映因素間交互作用的強(qiáng)弱大小，圓形表示交互作用不顯著，橢圓形表示交互作用顯著。圖7表示氫氧化鈉和水楊酸之間的相互影響。等高線呈圓形說明氫氧化鈉和水楊酸之間的交互作用不顯著。此結(jié)果與顯著性分析表所反映出的結(jié)果一致。根據(jù)回歸方程得到最優(yōu)試劑用量：氫氧化鈉25.85g/L，水楊酸68.05g/L，亞硝基鐵氰化鈉2.19g/L，次氯酸鈉40.9mL/L。對應(yīng)于此最優(yōu)值，預(yù)測的最優(yōu)吸光度值為8.6336。

2.3.3模型的驗(yàn)證為了考察模型的實(shí)用性和準(zhǔn)確性，對該模型進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。按照此最終試劑參數(shù)進(jìn)行六次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，可得吸光度值為8.7210±0.094，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值（8.6336）的偏差＜5%。表明此模型是可行的，并具有一定的實(shí)踐參考價(jià)值。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照1.2.6的方法制標(biāo)的準(zhǔn)曲線見圖8?；貧w方程為y=0.8207x+0.4028，R2=0.9940，線性范圍為0.01～10mmol/L，呈良好的線性關(guān)系。

圖8　M9培養(yǎng)基中腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8　Adenosine standard curves using ADA assay in M9 medium

2.5 ADA法和HPLC法檢測發(fā)酵液中腺苷含量結(jié)果比較

按照1.2.7的方法測定發(fā)酵液中的腺苷含量，ADA法做3個平行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖9。

圖9　ADA法和HPLC法檢測發(fā)酵液中的腺苷含量Fig.9　Concentration of adenosine detected by ADA assay and HPLC

由圖9可知，ADA法檢測發(fā)酵液所含腺苷的含量為（1.091±0.005）mmol/L，HPLC檢測的結(jié)果為（1.087± 0.001）mmol/L，兩種檢測方法檢測到的腺苷含量一致，說明可以利用本方法來檢測腺苷含量。

2.6加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照1.2.8的方法，以2.4中的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中腺苷的測定值，結(jié)果見表5。

表5　標(biāo)準(zhǔn)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5　The results of standard addition recovery experiments

由表5知，該方法回收率在95.5%～103.8%之間，RSD精準(zhǔn)度在0.9%～3.3%之間。檢測結(jié)果顯示本方法的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性良好，可以用來檢測發(fā)酵液中的腺苷含量。

3　結(jié)論與討論

本研究建立了一種快速、高通量檢測發(fā)酵液中腺苷含量的方法。該方法只需要用到腺苷脫氨酶和氫氧化鈉、水楊酸等幾種簡單的化學(xué)試劑，且檢測能夠在1.5h內(nèi)完成。通過單因素、響應(yīng)面方法優(yōu)化得到最優(yōu)試劑用量為氫氧化鈉25.85g/L、水楊酸68.05g/L、亞硝基鐵氰化鈉2.19g/L和次氯酸鈉40.9mL/L，以最優(yōu)試劑用量建立腺苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性范圍為0.01～10mmol/L。該方法回收率在95.5%～103.8%之間，RSD精準(zhǔn)度在0.9%～3.3%之間。

本方法與HPLC法檢測結(jié)果一致，且加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)亦驗(yàn)證了本方法的準(zhǔn)確性。值得注意的是，腺苷脫氨酶要充分水解腺苷產(chǎn)生銨，且該檢測方法的反應(yīng)條件是在堿性條件下進(jìn)行，試劑A、試劑B加入的時(shí)間要盡可能的短，否則會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測不準(zhǔn)確。本研究方法與傳統(tǒng)的HPLC檢測方法相比，大大節(jié)省了檢測時(shí)間、樣品處理時(shí)間，尤其是高通量篩選檢測的時(shí)間。同時(shí)，本方法省去了昂貴的設(shè)備使用費(fèi)、維修費(fèi)，且操作簡單，無需對操作人員再進(jìn)行額外的培訓(xùn)。

研究發(fā)現(xiàn)本方法能夠?qū)Πl(fā)酵液樣本進(jìn)行快速且高通量檢測，為高通量篩選腺苷高產(chǎn)菌株奠定了基礎(chǔ)。本方法用到的檢測銨的方法只是常用的檢測方法之一［16］。銨的其他檢測方法［17-21］，亦可以與腺苷脫氨酶結(jié)合來對腺苷進(jìn)行檢查。同時(shí)，此方法也為其他能夠通過脫氨反應(yīng)產(chǎn)生氨的檢測提供了一種可選方法。

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Optimization of a rapid enzymatic assay for adenosine in fermentation broth based on adenosine deaminase by response surface methodology

ZU Xin1，2，DONG Hui-na2，LI Ning2，3，ZHANG Da-wei2，*，SUN Yu-mei1，*
（1.School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China；2.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China；3.School of Basic Medical Sciences，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China）

This study attempted to establish a new rapid assay for adenosine combined adenosine deaminase（ADA）with indophenol method.Based on the single factor tests，the optimal reaction conditions were explored by response surface methodology with four variables of sodium hydroxide，salicylic acid，sodium nitroferricyanide and sodium hypochlorite.And a verification experiment using the optimum composition（sodium hydroxide 25.85g/L，salicylic acid 68.05g/L，sodium nitroferricyanide 2.19g/L，sodium hypochlorite 40.9mL/L）was performed. A adenosine standard curve was established under the optimum reaction conditions in range of 0.01～10mmol/L. The recovery of adenosine by ADA assay were between 95.5%～103.8%and RSD were between 0.9%～3.3%. This assay showed high consistency with HPLC method when determine the concentration of adanosine in fermentaton broth.Then the reliability of the ADA assay was further supported by spike and recovery test.The results showed that the method could rapidly and high-throughput determine the adenosine concentration in fermentation broth.

adenosine；adenosine deaminase；high-throughput screening；response surface methodology

TS207.3

A

1002-0306（2015）14-0081-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.007

2014－10－20

祖昕（1990-），女，在讀碩士研究生，研究方向：微生物代謝。

張大偉（1978-）男，博士，研究員，研究方向：微生物代謝控制，蛋白組學(xué)分析。孫玉梅（1962-），女，博士，教授，研究方向：微生物發(fā)酵工程，生物降解。

國家自然基金（31200036，31370089）。