林建城，陳越麗

（莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建莆田351100）

果膠酶在磁性復(fù)合載體上的固定化及其酶學(xué)性質(zhì)

林建城，陳越麗

（莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建莆田351100）

通過Fe3O4磁核與海藻酸鈉明膠制備磁性復(fù)合載體，戊二醛交聯(lián)后協(xié)同對果膠酶進行固定化，并研究固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)。利用正交實驗優(yōu)化固定化酶的制備條件，比較研究了固定化酶與溶液酶的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明：在Fe2+（5mol/L）∶Fe3+（5mol/L）體積比為0.75∶1的溶液中，制備Fe3O4磁核；3.5%海藻酸鈉與3.0%明膠以2.5∶1的體積比，加入3.0mg/mL Fe3O4磁核量，在體積分數(shù)4.0%的戊二醛中交聯(lián)2.5h；以每克載體加入20mg果膠酶，pH4.0下固定60min，制備的固定化果膠酶活力回收率可達78.69%。固定化果膠酶最適pH為4.0，在pH3.0～7.0內(nèi)穩(wěn)定；最適溫度50℃，在20～50℃具有較好的熱穩(wěn)定性；表觀米氏常數(shù)Kmapp為3.162mg/mL；重復(fù)使用10次后，酶活力還剩51%，4℃下儲存10d，酶活力還保留81%。說明以戊二醛交聯(lián)磁性海藻酸鈉明膠為復(fù)合載體制備的固定化果膠酶，機械強度大、彈性好，酶活力回收率高，操作穩(wěn)定性好。

磁性復(fù)合載體，果膠酶，固定化，酶學(xué)性質(zhì)

酶固定化載體與固定化方法是固定化酶研究的核心問題。海藻酸鈉是從海藻中提取的一種親水性膠態(tài)多聚糖，這種線性高分子化合物含有自由的羧基和羥基，作為固定化酶載體，具有生物相容性、傳質(zhì)性能好，成本低以及操作簡單等優(yōu)點［1］。明膠是由膠原部分水解而得到的一類蛋白質(zhì)，溶解性好而且價格低廉，可以很好的改善海藻酸鈉的成型效果；與單一應(yīng)用海藻酸鈉載體相比，利用海藻酸鈉與明膠聯(lián)合固定化制備的凝膠粒，可以為酶提供更大的固定化空間，有利于內(nèi)外物質(zhì)的擴散［2］。目前采用這2種高分子材料為復(fù)合載體協(xié)同對酶進行固定的研究不多，薛慶海等［3］使用海藻酸鈉明膠協(xié)同包埋莧菜脂氫過氧化物裂解酶，并使用戊二醛交聯(lián)，獲得了較好的固定化效果。采用海藻酸鈉明膠協(xié)同固定化纖維素酶和脂肪酶［4-5］，制備的固定化酶也呈現(xiàn)較好的熱穩(wěn)定性與儲存穩(wěn)定性，顯示了海藻酸鈉明膠復(fù)合載體在酶固定化中的優(yōu)越性。前已用明膠、殼聚糖為載體分別制備了固定化果膠酶［6-7］，但是存在固定化載體易破碎，酶活力回收率不高或酶反應(yīng)器難于使用等諸多缺點。

此外，近年來發(fā)現(xiàn)利用磁性高分子微球載體制備的固定化酶具有磁響應(yīng)性，能較快從反應(yīng)體系中分離和回收，操作簡便，還可借助外部磁場將其應(yīng)用在流化床式的酶反應(yīng)器中，比表面積大，從而提高固定化酶的催化效率［8-10］。為此，本課題組以殼聚糖為載體制備了磁性殼聚糖微球固定化果膠酶，獲得了各種性能較好固定化酶［11］。為了進一步提高固定化果膠酶酶活力回收率和固定化酶的操作穩(wěn)定性，本文擬采用Fe3O4磁核與海藻酸鈉和明膠制備成磁性復(fù)合載體，戊二醛交聯(lián)后協(xié)同對果膠酶進行固定，并優(yōu)化固定化酶制備的條件，研究固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)，旨為固定化果膠酶在食品工業(yè)中應(yīng)用提供可靠的實驗數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

果膠酶（20000U/g） 莆田市綠森莊園酒業(yè)有限公司贈送，以0.1mol/L pH4.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制果膠酶液；果膠Sigma公司；明膠、戊二醛（50%）、碘和可溶性淀粉購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；海藻酸鈉購于廣東光華化學(xué)廠有限公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、硫代硫酸鈉、碳酸鈉、氫氧化鈉、FeCl2、FeCl3均為分析純，購于天津市紅巖化學(xué)試劑廠。

JBZ-14H磁力攪拌器上海隆拓儀器設(shè)備有限公司；THZ-82恒溫振蕩器常州潤華電器有限公司；HH-4恒溫水浴鍋常州國華電器有限公司；BS224S電子天平北京賽多麗斯科學(xué)儀器有限公司；TDL-5低速大容量離心機上海安亭科學(xué)儀器廠；PHS-25精密數(shù)顯酸度計南京曉曉儀器設(shè)備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1Fe3O4磁核的制備參照文獻［11］的方法，5mol/L的FeCl2和FeCl3以一定的體積比，與過量的3mol/L NaOH混合均勻后，磁力攪拌30min，用磁鐵從底部吸住沉淀物，去除上清液，用蒸餾水重復(fù)洗至中性，烘干得Fe3O4磁核。

1.2.2磁性海藻酸鈉明膠微球的制備參照文獻［11］的方法，并略作修改如下：3.5%海藻酸鈉與3.0%明膠以一定體積比例混合，加入一定量Fe3O4磁核，攪拌均勻，以30次/min振速振蕩混勻30min，用5mL注射器吸取上述混合液，從約10cm高度滴入2%CaCl2溶液中，形成凝膠微球。濾出微球，更換CaCl2溶液，4℃下靜置繼續(xù)硬化2h。再濾出凝膠微球，用質(zhì)量分數(shù)為0.9%NaCl洗滌，瀝干，得磁性凝膠微球，50℃下真空干燥。

1.2.3磁性復(fù)合載體固定化果膠酶的制備將磁性凝膠微球與戊二醛交聯(lián)一定時間，蒸餾水洗滌3次，50℃下真空干燥，獲得交聯(lián)磁性凝膠微球復(fù)合載體。將復(fù)合載體與果膠酶液混合，25℃下以30次/min振速振蕩固定，用蒸餾水清洗3次，獲得固定化酶，4℃下存儲備用。

1.2.4海藻酸鈉與明膠體積比對固定化酶制備的影響選擇3.5%海藻酸鈉與3.0%明膠5種體積比：3.0∶1.0、2.5∶1.0、2.0∶1.0、1.0∶1.0、0.5∶1.0，分別制備固定化酶凝膠微球，比較不同體積比下制備的凝膠微球彈性、硬度以及固定化酶活力。

凝膠微球復(fù)合載體彈性的檢測：以微球從10cm高處自由落在樹脂板面上的還彈高度來表示，還彈高度高表明制備的小球體彈性好；凝膠微球硬度的檢測：將微球用手輕捏，分易碎、較易碎和不易碎等3種不同硬度。

1.2.5Fe2+：Fe3+體積比對固定化酶制備的影響在0.5∶1、0.75∶1、1∶1、1.25∶1、1.5∶1、2∶1等6種不同F(xiàn)e2+∶Fe3+體積比下，制備Fe3O4磁核，研究Fe2+∶Fe3+體積比對固定化酶制備的影響。

表1　L9（34）正交實驗設(shè)計Table 1　Factors and levels of L9（34）orthogonal experiment

1.2.6固定化果膠酶制備條件的優(yōu)化

1.2.6.1單因素實驗設(shè)計在戊二醛體積分數(shù)為3.5%，20mg/g載體的酶量（1g載體固定20mg果膠酶），交聯(lián)時間2.0h，固定化時間60min，固定化體系pH4.0下研究1.5、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0mg/mL Fe3O4磁核量對固定化酶制備的影響；在3.0mg/mL Fe3O4磁核量、酶量為20mg/g載體，交聯(lián)時間2.0h，固定化時間60min，固定化體系pH4.0下研究1.0%、2.0%、3.0%、3.5%、4.0%、5.0%戊二醛體積分數(shù)對固定化酶制備的影響；在3.0mg/mL Fe3O4磁核量、戊二醛體積分數(shù)4.0%，交聯(lián)時間2.0h，固定化時間60min，固定化體系pH4.0下研究10、20、30、40、50、60mg/g載體的酶量對固定化酶制備的影響；在3.0mg/mL Fe3O4磁核量，戊二醛體積分數(shù)4.0%，酶量為30mg/g載體，固定化時間60min，固定化體系pH4.0下，研究1.0、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0h不同交聯(lián)時間對固定化酶制備的影響；在3.0mg/mL Fe3O4磁核量，戊二醛體積分數(shù)4.0%，酶量為30mg/g載體，交聯(lián)時間2.5h，固定化體系pH4.0下，研究20、40、60、80、100、120min不同固定化時間對固定化酶制備的影響；在3.0mg/mL Fe3O4磁核量，戊二醛體積分數(shù)4.0%，酶量為30mg/g載體，交聯(lián)時間2.5h，固定化時間60min下，研究pH3.0、3.4、3.8、4.0、4.4、5.0不同固定化體系pH對固定化酶制備的影響。

1.2.6.2正交實驗設(shè)計選擇Fe3O4磁核量、戊二醛體積分數(shù)、酶量（mg/g載體）、交聯(lián)時間（h）4個因子，按照L9（34）正交實驗設(shè)計（表1），確定磁性海藻酸鈉明膠協(xié)同固定化果膠酶的制備方案。

1.2.7果膠酶與固定化果膠酶活力的測定果膠酶活力測定方法采用次碘酸鈉滴定法［12］。固定化酶活力測定參照文獻［11］，20mL反應(yīng)體系包括：1%果膠溶液（pH4.0）10mL，蒸餾水10mL。50℃預(yù)熱15min后，加入1g固定化酶，繼續(xù)反應(yīng)lh，隔20min搖動一次，置沸水浴中滅活10min，冷卻，回收固定化酶，采用次碘酸鈉滴定法測定固定化果膠酶活力。1個酶活力單位（U）定義為：在上述條件下，每分鐘催化果膠水解生成1μmoL濃度半乳糖醛酸所需的酶量為1個酶活力單位（U）。

固定化酶活力回收率（%）＝（固定化酶總活力/溶液酶總活力）×100

1.2.8酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性測定參照文獻［13］的方法，檢測不同溫度（20～90℃）下固定化果膠酶和溶液果膠酶的酶活力，確定酶的最適溫度。再將固定化果膠酶和溶液果膠酶分別置于不同溫度下處理1h，然后取一定量處理過的酶液，在最適溫度下檢測各自酶活力，計算熱處理后的剩余酶活力（%），分析固定化酶和溶液酶的溫度穩(wěn)定性。

1.2.9酶的最適pH及酸堿穩(wěn)定性測定參照文獻［13］的方法，測定在不同pH（3.0～8.0）下固定化果膠酶和溶液果膠酶的酶活力，確定它們的最適pH。再將固定化果膠酶和溶液果膠酶分別置于不同pH的0.1mol/L檸檬酸緩沖液中，4℃下處理2h，在最適pH下檢測各自酶活力，計算酸堿處理后的剩余酶活力（%），分析固定化酶和溶液酶的酸堿穩(wěn)定性。

1.2.10酶的動力學(xué)參數(shù)測定酶米氏常數(shù)（Km）測定參照文獻［13］的方法，在固定化酶和溶液酶的測活體系中，改變底物果膠的濃度（0.7～5.0mg/mL），分別測定各底物濃度下固定化酶和溶液酶的酶活力，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法作圖，測定溶液果膠酶的Km和固定化果膠酶的表觀米氏常數(shù)（Kmapp）。

1.2.11固定化酶操作穩(wěn)定性的測定參照文獻［14］的方法，測定上述制備的1g固定化果膠酶的酶活力，固定化酶使用后，用蒸餾水清洗3次，再測定該固定化酶的酶活力，計算其相對酶活力（%）；同法連續(xù)測定10次，從固定化酶多次使用后酶活力的變化分析固定化酶的操作穩(wěn)定性。

固定化酶相對酶活力（%）=每次使用后固定化酶活力/首次固定化酶活力×100

1.3數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)分析軟件分析，采用grapher 7.0數(shù)據(jù)繪圖軟件繪圖。

2　結(jié)果與分析

2.1磁性海藻酸鈉明膠微球的制備

2.1.1海藻酸鈉與明膠體積比對固定化酶制備的影響研究了海藻酸鈉與明膠的體積比對固定化酶制備的影響。結(jié)果見表2，海藻酸鈉與明膠的體積比為1.0∶1.0時，凝膠剛好能成球，沒有拖尾現(xiàn)象，彈性差，較易碎，小于這個體積比制備的凝膠難成球且易碎，這是由于被包埋的酶量減少，酶活力反而較高。當(dāng)體積比為2.5∶1.0時，制備的球形凝膠固定化酶活力高，但隨著海藻酸鈉體積的增加，制備的固定化酶活力反而降低。說明海藻酸鈉和明膠體積比影響著載體的機械強度和成球難易，海藻酸鈉所占體積比大，凝膠成球效果好；但所占體積比若過大，制備的載體強度大，球體質(zhì)地致密而凝膠網(wǎng)孔小，吸附在凝膠網(wǎng)孔上酶量減少，底物與酶之間接觸速率和產(chǎn)物傳遞速率也降低，進而降低了酶的催化活力。因此，海藻酸鈉與明膠的體積比為2.5∶1.0是較適宜的。

表2　不同體積比的海藻酸鈉與明膠對固定化酶的影響Table 2　Effect of volume ratio of sodium alginate and gelatin on the immobilized pectinase

2.1.2Fe2+∶Fe3+體積比對固定化酶制備的影響0.5∶1、0.75∶1、1∶1、1.25∶1、1.5∶1、2∶1等6種Fe2+∶Fe3+體積比下，制備的固定化酶活力分別為3.50、4.67、4.08、3.83、3.58、3.00U。結(jié)果表明，當(dāng)Fe2+∶Fe3+體積比為0.75∶1時，制備的磁性海藻酸鈉明膠固定化酶活力較高；后隨Fe2+占比越大，制備的固定化酶活力逐漸減小。磁核Fe3O4的形成原理是：Fe2++2Fe3++8OHˉ=Fe3O4↓+4H2O，形成的Fe3O4易被氧化為Fe2O3［15］，F(xiàn)e3+可能是通過配位鍵與果膠酶上的基團結(jié)合，從而也可起到對果膠酶的固定作用，因此，F(xiàn)e2+、Fe3+配比會影響固定化酶的活力。

2.2復(fù)合載體固定化果膠酶制備的影響因素

2.2.1Fe3O4磁核量對固定化酶的影響研究了Fe3O4磁核量對固定化酶制備的影響。結(jié)果見表3，表明：隨著Fe3O4磁核量的提高，制備的固定化酶酶活力逐漸增大；當(dāng)Fe3O4磁核量為3.0mg/mL時，固定化酶活力最高為5.00U，酶活力回收率達65.22%；Fe3O4磁核量大于3.0mg/mL時，制備的固定化酶活力反而呈下降趨勢。固定化酶主要是依靠磁性微球載體的吸附及其戊二醛的交聯(lián)作用實現(xiàn)對果膠酶的固定，如果磁核量多了，磁核會滲出微球表面，影響了它們之間的交聯(lián)而使固定化酶的活力降低。

表3　Fe3O4磁核量對固定化酶酶活力與回收率的影響Table 3　Effect of concentration of Fe3O4magnetic nucleus on activity and recovery rate of immobilized pectinase

2.2.2戊二醛濃度對固定化酶的影響從表4可知，戊二醛體積分數(shù)在1.0%～4.0%范圍時，固定化酶活力隨其濃度增加而增大，戊二醛濃度為4.0%時，固定化酶活力和酶活力回收率達最大，5.0%戊二醛制備的磁性微球硬度大、易碎，酶活力較低，因此，固定化體系中采用4.0%戊二醛較為適宜。戊二醛既是交聯(lián)劑，又是酶的變性劑；戊二醛濃度過大，大量的醛基與酶分子及載體之間相結(jié)合，酶活性中心的結(jié)合位點過多，催化時產(chǎn)生了空間障礙，從而導(dǎo)致固定化酶活力下降。

表4　戊二醛體積分數(shù)對固定化酶酶活力與回收率影響Table 4　Effect of volume fraction of glutaraldehyde on activity and recovery rate of immobilized pectinase

2.2.3酶量對固定化酶的影響研究了不同固定化酶量對固定化酶制備的影響。結(jié)果見表5：1g微球載體固定的酶量小于30mg時，隨酶量增加固定化酶活力呈上升趨勢，固定化酶量超過30mg，固定化酶活力隨酶量增加反而呈逐漸下降趨勢；而酶活力回收率隨固定化酶量的增加則呈下降趨勢，1g載體固定10mg酶，酶活力回收率最高，但酶活力最小。綜合考量酶回收率與酶活力，1g微球載體固定20～30mg酶量為適宜。固定化酶與溶液酶不同，不是酶濃度越大，酶活力越高；若在固定化凝膠載體中加入過量的酶，酶在載體上的結(jié)合位點趨于飽和，酶則會堆積在載體表面或凝膠網(wǎng)孔深處，酶催化時存在空間位阻，凝膠網(wǎng)孔深處的底物擴散困難，內(nèi)擴散阻力使底物分子與活性中心的接近受阻，影響其催化活性。

表5　固定化酶量對固定化酶酶活力和回收率的影響Table 5　Effect of amount of immobilized pectinase on activity and recovery rate of immobilized pectinase

表6　交聯(lián)時間對固定化酶酶活力和回收率的影響Table 6　Effect of time of crosslink on activity and recovery rate of immobilized pectinase

2.2.4交聯(lián)時間對固定化酶的影響研究了戊二醛與微球載體交聯(lián)時間對固定化酶制備的影響，結(jié)果見表6。從表6可知，戊二醛交聯(lián)2.5h時，固定化果膠酶活力最高為5.25U，酶活力回收率高達71.59%，2.5h的交聯(lián)時間較為適宜；隨著交聯(lián)時間的延長，固定化酶活力反而逐漸下降。說明隨著凝膠載體與戊二醛間交聯(lián)時間的延長，交聯(lián)度增大，酶的結(jié)合位點較多，固定化酶的活力則提高；但交聯(lián)度若過大，可能由于空間位阻現(xiàn)象反而會影響酶在載體上的固定，而使固定化酶活力下降。

2.2.5固定化時間對固定化酶的影響研究固定化時間為20、40、60、80、100、120min下對固定化酶活力的影響，測得固定化酶活力分別為3.83、4.67、5.33、4.72、4.17、3.92U。結(jié)果顯示：固定化時間為60min時，固定化酶活力達到最大；當(dāng)固定化時間超過60min，固定化酶活力呈逐漸下降的趨勢。這是由于吸附時間過長酶則會漸漸失活，再則，過多的酶吸附于載體表面，導(dǎo)致凝膠網(wǎng)孔堵塞，酶蛋白分子互相屏蔽，酶與底物難以契合，酶活力也就降低了。因此，固定化時間60min較為適宜。

2.2.6固定化體系pH對固定化酶的影響考察了不同pH固定化體系對固定化果膠酶活力的影響。在固定化體系中pH為3.0、3.4、3.8、4.0、4.4、5.0下，測得固定化酶活力分別為3.03、3.92、4.33、5.17、4.18、3.67U。結(jié)果表明：當(dāng)固定化體系pH4.0時，固定化果膠酶活力最高，這與果膠酶最適pH接近，偏酸性。酶蛋白質(zhì)中的-NH2與戊二醛的醛基之間的加成反應(yīng)，也需要在酸性環(huán)境中進行［1］；偏離最適pH也會引起酶蛋白的部分失活，所以固定化體系應(yīng)選擇pH4.0的檸檬酸緩沖體系。

表7　L9（34）正交實驗結(jié)果與分析Table 7　Results and range analysis of L9（34）orthogonal experiment

2.3固定化果膠酶制備條件的優(yōu)化

選擇了Fe3O4磁核量、酶量、戊二醛濃度和交聯(lián)時間4個影響因素，以酶活力回收率為指標，采用L9（34）正交實驗對制備條件進行優(yōu)化，表7結(jié)果表明，R極差大小順序為D＞A＞B＞C，即固定化酶制備的主要影響因素從主到次是：交聯(lián)時間＞Fe3O4磁核量＞戊二醛濃度＞酶量，最優(yōu)組合為A3B3C1D2，即磁粉Fe3O4量為3.0mg/mL，戊二醛濃度為4.0%，1g載體加入20mg酶量，交聯(lián)時間2.5h。此條件下制備的載體與果膠酶在pH4.0下固定60min，固定化酶活力回收率可達至78.69%，這比用磁性殼聚糖微載體固定的果膠酶酶活力回收率（68.4%）大［11］。

2.4固定化果膠酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性研究了溫度對果膠酶活力的影響，結(jié)果見圖1。圖1表明，固定化果膠酶的最適溫度為50℃，大于溶液酶的最適溫度（40℃）。溶液酶在20～40℃區(qū)域內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性，在40℃后，酶活力呈現(xiàn)明顯下降趨勢；而固定化果膠酶在20～50℃區(qū)域內(nèi)穩(wěn)定性較好，超過50℃后，固定化酶活力開始下降；90℃時固定化酶剩余活力為20.3%，溶液酶則只剩3.82%，說明固定化酶的溫度穩(wěn)定性有一定程度的提高。溫度升高使酶變性失活，是由于維持酶蛋白空間構(gòu)象的次級鍵發(fā)生斷裂引起酶分子伸展變形所致，而固定化后的酶分子與載體間多點連接，可防止熱引起的酶分子伸展變形作用。

圖1　溶液酶與固定化酶的最適溫度Fig.1　The optimum temperature of soluble pectinase and immobilized pectinase

表8　固定化酶的操作穩(wěn)定性Table 8　Operation stability of immobilized pectinase

2.4.2酶的最適pH及酸堿穩(wěn)定性研究了pH對果膠酶活力的影響。結(jié)果表明：固定化果膠酶與溶液酶的最適pH均為4.0。固定化果膠酶在pH3.0～7.0范圍內(nèi)相對穩(wěn)定，而溶液酶在pH3.0～5.5范圍內(nèi)較穩(wěn)定；pH7.0下處理2h，固定化酶剩余活力為67.0%，溶液酶則只剩20.2%，說明固定化酶比溶液酶較耐酸堿。可能原因為：酶蛋白活性中心上的帶電基團與海藻酸鈉明膠載體和戊二醛上的基團之間發(fā)生相互作用，導(dǎo)致酶活性中心解離基團不易受環(huán)境中pH變化的影響；固定化緩沖液體系中的帶電基團與海藻酸鈉明膠載體上帶電基團的結(jié)合，削弱了pH變化對酶蛋白活性中心解離基團的影響；固定化后酶分子與載體多點連接，可防止酸堿變化引起的酶分子伸展變形作用。

2.4.3固定化果膠酶的動力學(xué)參數(shù)改變果膠底物的濃度，在測活體系下分別測定了固定化酶和溶液酶的酶活力，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，以底物濃度倒數(shù)（y）對反應(yīng)速度倒數(shù)（x）作圖。得固定化酶的線性方程為：y=0.623x+0.197，求得固定化酶表觀米氏常數(shù)Kmapp=3.162mg/mL；溶液酶的線性方程為：y=0.350x+0.331，求得溶液酶的米氏常數(shù)Km= 1.057mg/mL。說明磁性海藻酸鈉明膠協(xié)同固定的果膠酶對底物的親和力降低。

2.4.4固定化酶的操作穩(wěn)定性對制備的固定化酶進行10批次的使用，從表8可知，重復(fù)使用6次后，酶活力回收率為56.8%；重復(fù)使用10次后，酶活力還剩余51%，而且磁性球形載體還保持較好彈性，破碎現(xiàn)象少；而用磁性殼聚糖微載體固定的果膠酶，重復(fù)使用6次后，酶活力只剩余4%［11］。說明以海藻酸鈉明膠協(xié)同固定化的果膠酶不僅酶活力回收率高，還具有較好的操作穩(wěn)定性。

2.4.5固定化酶的儲存穩(wěn)定性固定化酶在4℃和25℃下分別儲存30d，每隔5d，測其剩余酶活力（%）。圖2結(jié)果顯示，固定化酶在4℃下儲存10d，酶活力還保持81%的較高水平，而在25℃下儲存，剩余酶活力為74%；但4、25℃下儲存30d后，固定化酶活力分別只剩42%、34%，說明隨著儲存時間的延長，固定化酶活力逐漸喪失，磁性海藻酸鈉明膠協(xié)同固定化果膠酶在4℃下儲存相對較好。

圖2　固定化酶的儲存穩(wěn)定性Fig.2　Storage stability of immobilized pectinase

3　結(jié)論

5mol/L FeCl2和5mol/L FeCl3以0.75∶1.0的體積比，在過量的NaOH中制備Fe3O4磁核。3.5%海藻酸鈉與3.0%明膠以2.5∶1.0的體積比，加入3.0mg/mL Fe3O4磁核量，在2%氯化鈣中成磁性球體后，在體積分數(shù)4.0%戊二醛中交聯(lián)2.5h，1g磁球載體中加入20mg酶量，在pH4.0檸檬酸緩沖體系下固定60min，此條件下可制得磁性海藻酸鈉明膠協(xié)同固定化果膠酶，磁性微球載體彈性好，不易碎，酶活力回收率可達至78.69%；固定化酶重復(fù)使用10次后，酶活力還剩51%，4℃下儲存30d后，固定化酶活力剩余42%。

磁性海藻酸鈉明膠協(xié)同固定化果膠酶其最適pH為4.0，最適溫度為50℃，在pH 3.0～7.0、20～50℃溫度范圍內(nèi)酶相對穩(wěn)定，固定化酶表觀米氏常數(shù)Kmapp為3.162mg/mL。

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Immobilization and enzymological property of pectinase on the magnetic composite support

LIN Jian-cheng，CHEN Yue-li
（College of Environment&Biological Engineering，Putian University，Putian 351100，China）

The magnetic microspheres were prepared with Fe3O4magnetic nucleus and sodium alginate-gelatin. Pectinase was immobilized while magnetic microspheres were crosslinked with glutaraldehyde.The preparation conditions of immobilized pectinase were optimized through orthogonal experiments based on single factor，and the properties of immobilized enzyme were investigated.The results showed that Fe3O4magnetic nucleus could be made out when Fe2+（5mol/L）∶Fe3+（5mol/L）was 0.75∶1（volume ratio）.When sodium alginate（3.5%）∶gelatin（3.0%）was 2.5∶1（volume ratio），the concentration of Fe3O4magnetic nucleus was 3.0 miligram per millilitre，crosslinked with volume fraction of 4.0%glutaraldehyde for 2.5 hours，and following mixed with 20 miligram pectinase per gram supporter，the process time was one hour，pH value for 4.0，the recovery rate of immobilized pectinase activity could reach to 78.69%.The optimum pH and optimum temperature of immobilized pectinase for the hydrolysis of pectin were determined to be pH4.0 and 50℃，respectively.The immobilized pectinase was stable in a pH range from 3.0 to 7.0 and at temperature 20～55℃.The apparent Michaelis constant of immobilized pectinase Kmappequaled to 3.162mg/mL.The relative activity of immobilized enzyme remained 51.0%after continuous use for ten times，and that of remaining 81%after stored ten days.The results indicated the immobilized pectinase prepared with composite support were good enough for the strength，the flexibility and the recovery rate，and had good operation stability.

magnetic composite support；pectinase；immobilization；properties of enzymology

TS201.1

A

1002-0306（2015）14-0220-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.037

2014－10－20

林建城（1966-），男，碩士，教授，主要從事生物化學(xué)、酶學(xué)與食品生物技術(shù)方面的研究。

福建省高校服務(wù)海西重點建設(shè)項目（2008HX02）；福建省教育廳資助省屬高?？蒲谢痦椖浚↗K2012046）。