彭　健，張海德，董安華，許英豪，蔡　濤，王偉濤，劉長玲

（海南大學食品學院，海南?？?70228）

木瓜蛋白酶在PEG-IDA-Fe3+（/NH4）2SO4雙水相體系中親和分配行為研究

彭健，張海德*，董安華，許英豪，蔡濤，王偉濤，劉長玲

（海南大學食品學院，海南海口570228）

目的：研究木瓜蛋白酶在PEG-IDA-Fe3+/（NH4）2SO4親和雙水相體系中分配行為。方法：采用濁點法，構(gòu)建雙水相相圖，考察各成相劑對木瓜蛋白酶活性的影響；研究不同PEG4000和（NH4）2SO4的質(zhì)量分數(shù)、不同PEG-IDA-Fe3+的取代量時，木瓜蛋白酶在兩相體系中分配行為的變化；用響應(yīng)面法優(yōu)化親和雙水相萃取木瓜蛋白酶的最佳分離條件；同時對木瓜蛋白酶在萃取體系中的結(jié)構(gòu)進行表征。結(jié)果：當兩相體系中pH6.9，PEG4000質(zhì)量分數(shù)16%，（NH4）2SO4質(zhì)量分數(shù)20%，PEG-IDA-Fe3+為3%時，木瓜蛋白酶的上相酶活性回收率達90.5%，蛋白分配系數(shù)達1.85，而其在PEG/（NH4）2SO4中的酶活回收率及蛋白分配系數(shù)都低于PEG-IDA-Fe3+/（NH4）2SO4親和雙水相體系。結(jié)論：PEG-IDA-Fe3+/（NH4）2SO親和雙水相系統(tǒng)能有效提高木瓜蛋白酶的分配效果，采用Fe3+螯合PEG成相劑的雙水相萃取木瓜蛋白酶條件溫和，不影響酶的特征結(jié)構(gòu)。

親和雙水相，PEG-IDA-Fe3+，木瓜蛋白酶，分配行為

木瓜蛋白酶（EC3.4.22.2）是由212個氨基酸殘基組成的一種含巰基（-SH）肽鏈的內(nèi)切酶，有耐高溫、穩(wěn)定性好、蛋白質(zhì)水解能力強等特征，作為一種工業(yè)酶制劑廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、細胞分離、食品、清潔劑、皮革紡織和制藥［1］。但粗木瓜蛋白酶制品，即使經(jīng)過分離純化，其純度仍然不高，難以在醫(yī)藥、精細化工等方面得到廣泛應(yīng)用。因此，對木瓜蛋白酶分配行為和機制的研究非常緊迫。雙水相體系（Aqueous twophase system）是指某些親水性的高分子聚合物與聚合物或聚合物與無機鹽溶解在水中，形成互不相溶的兩相或多相的體系［2］。生物物質(zhì)通過氫鍵、電荷作用、范德華力、疏水力、空間效應(yīng)等與雙水相體系產(chǎn)生相互作用，從而達到萃取分離的目的。親和雙水相主要有兩種存在形式：一是制備親和成相劑，在成相聚合物中接入具有親和作用的金屬離子或基團［3-4］，二是添加游離的親和配基［5-6］。Ling YQ等［7］將親和染料Reactive Red 120添加到PEG/（NH4）2SO4雙水相系統(tǒng)中，發(fā)現(xiàn)游離親和染料Reactive Red 120對木瓜蛋白酶的分配無明顯影響。HSC Barbosa等［8］，發(fā)現(xiàn)PEGIDA-Cu2+的添加量能有效提高DNA的純化效果；肖進新等［9］實驗證明親和配基的引入極大地增強了蛋白質(zhì)分配的選擇性。

本文擬采用PEG4000制備PEG-IDA-Fe3+，代替PEG/（NH4）2SO4雙水相體系中的部分PEG，形成親和雙水相，探討木瓜蛋白酶在PEG-IDA-Fe3+/（NH4）2SO4親和雙水相中的分配行為，并對萃取體系中的木瓜蛋白酶進行結(jié)構(gòu)表征，為高純度、高活力木瓜蛋白酶的制取提供理論指導。

表1　酪氨酸標準溶液Table 1　Tyrosine standard solution

1　材料與方法

1.1材料與儀器

聚乙二醇4000（CP）、干酪素（CP）、硫酸銨（AR）、G-250國藥集團化學試劑有限公司；木瓜蛋白酶（3500U/mg） 生工生物有限公司；PEG-IDA-Fe3+（螯合率0.6mol/mol）實驗室參照Lin等［10］的方法制備；其他試劑均為市售分析純。

PL303分析天平梅特勒—托利多（上海）有限公司；TU1901紫外可見分光光度計北京普析通用有限責任公司；TENSOR27傅里葉變換紅外光譜儀德國Bruker公司；DK-98-1型恒溫水浴鍋天津泰斯特儀器有限公司；PHS-3C型pH計上海雷磁儀器廠；SHA-2恒溫振蕩器常州澳華儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1木瓜蛋白酶活性的測定配制100μg/mL標準酪氨酸原液，按表1所示稀釋，測其在275nm處的吸光值，繪制標準曲線。以酪蛋白為底物，測木瓜蛋白酶在10min內(nèi)水解產(chǎn)生的酪氨酸在275nm處吸光值，計算上相中木瓜蛋白酶的酶活濃度［11］。

1.2.2蛋白含量的測定采用Bradford方法［12］，以牛血清蛋白（BSA）為基準蛋白。配制100μg/mL蛋白原溶液，按表2稀釋，在595nm處測吸光度，繪制標準曲線。

表2　牛血清蛋白標準溶液Table 2　Bovine serum albumin standard solution

1.2.3雙水相相圖的制備將PEG4000、PEG-IDAFe3+和（NH4）2SO配成50%的原溶液，準確稱量一定質(zhì)量的PEG4000原溶液于50mL小燒杯中，邊振蕩邊滴加（NH4）2SO4原溶液，至混合液出現(xiàn)混濁，再加入適量的去離子水，使體系變澄清，繼續(xù)加入（NH4）2SO4原溶液，使體系再次變混濁，反復(fù)操作多次，分別記錄每次加入的（NH4）2SO4和去離子水質(zhì)量，計算體系達到混濁時PEG4000和（NH4）2SO4在體系中的質(zhì)量分數(shù)，繪制PEG4000/（NH4）2SO4雙節(jié)線圖。

1.2.4親和雙水相萃取木瓜蛋白酶配制一定質(zhì)量分數(shù)的PEG4000、PEG-IDA-Fe3+和（NH4）2SO4原溶液，調(diào)節(jié)至所需pH。根據(jù)不同的雙水相體系，計算加入PEG4000、PEG-IDA-Fe3+和（NH4）2SO4原溶液的量，加入2mL酶含量為10mg/mL酶溶液，然后加去離子水至20.0g。常溫下振蕩30min后，靜置45min，使分相清晰。測定上下相體積，分取上下相，稀釋后分別測定其酶活性和蛋白含量。計算上下相蛋白分配系數(shù)Kp和酶活性回收率Y（%）。公式如下：

Kp=上相蛋白濃度/下相度蛋白濃度

Y（%）=上相酶活性濃度×上相體積/加入系統(tǒng)酶活性總量×100

1.3單因素實驗設(shè)計

1.3.1各雙水相組分對木瓜蛋白酶活性的影響配制質(zhì)量分數(shù)分別為1%、3%、5%、7%、9%的PEG-IDAFe3+，質(zhì)量分數(shù)分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%的PEG4000和（NH4）2SO4溶液，各取9mL分別加入1mL酶含量為10mg/mL的酶液，渦旋混合后靜置45min。取0.25mL稀釋40倍后，按1.2.1的方法測定木瓜蛋白酶的活性，對照組中不同質(zhì)量分數(shù)溶液用水代替。

酶活比X（%）=成相劑存在時酶活性/對照組酶活性×100

1.3.2（NH4）2SO4對分配行為的影響固定雙水相中PEG的質(zhì)量分數(shù)為20.0%（w/w），pH7.0，酶添加量1.0mg/g，考察不同質(zhì)量分數(shù)（NH4）2SO4對分配行為的影響。

1.3.3PEG4000對分配行為的影響固定雙水相中（NH4）2SO4的質(zhì)量分數(shù)為21.0%（w/w），pH7.0，酶添加量1.0mg/g，考察不同質(zhì)量分數(shù)PEG4000對分配行為的影響。

1.3.4PEG-IDA-Fe3+取代量對分配行為的影響確定雙水相中（NH4）2SO4和PEG4000的最佳萃取條件后，分別用PEG-IDA-Fe3+取代原雙水相中的部分PEG4000，考察不同PEG-IDA-Fe3+的取代量對分配行為的影響。

1.4響應(yīng)面實驗設(shè)計

在預(yù)實驗與單因素的實驗基礎(chǔ)上，采用BBD（Box-behnken Design）實驗設(shè)計，對pH（X1）、PEG質(zhì)量分數(shù)（X2）、（NH4）2SO4質(zhì)量分數(shù)（X3）、PEG-IDA-Fe3+質(zhì)量分數(shù)（X4）四個因素進行優(yōu)化，選取酶活性回收率（Y%）和分配系數(shù)（Kp）為考察指標，以獲得親和雙水相萃取木瓜蛋白酶的最佳條件，實驗因素的水平編碼表見表3。

表3　響應(yīng)面實驗因素與水平編碼表Table 3　List of coded factors and levels for RSM

1.5結(jié)構(gòu)表征

分別取含酶親和雙水相的上相、木瓜蛋白酶液以及不含酶的雙水相上相1mL，稀釋10倍，在260～320nm進行光譜掃描。分別取3mg木瓜蛋白酶、PEG4000以及含酶雙水相中上相干燥粉末，與一定量的KBr研磨，用壓片機壓片后，在400～4000cm-1范圍內(nèi)進行FT-IR光譜檢測。

1.6數(shù)據(jù)處理

使用Design Expert 8.0和Origin 8.0對實驗數(shù)據(jù)進行處理和分析，每組實驗均重復(fù)3次。

2　結(jié)果與分析

2.1酪氨酸標準曲線

酪氨酸標準曲線如圖1所示：y=0.0073x+0.0006，R2=0.9991，符合實驗要求。

圖1　酪氨酸標準曲線Fig.1　Tyrosine standard curve

2.2牛血清蛋白標準曲線

牛血清蛋白標準曲線如圖2所示：y=0.0076x+ 0.0178，R2=0.9968，符合實驗要求。

2.3PEG-IDA-Fe3+和PEG4000相圖的比較

綜合文獻［3］報道，選擇10%的PEG被PEG-IDAFe3+取代，繪制雙節(jié)線圖如圖3所示，親和成相劑加入后，上下兩相間的差異變大，相圖不對稱性增強。這是因為PEG螯合金屬離子后，分子上的極性基團（羥基）被部分取代，導致PEG分子極性程度減弱，PEG溶液和（NH4）2SO4溶液之間的憎水性差別增大，造成更大的分相推動力，導致雙結(jié)點曲線與原相圖曲線有所不同。但是親和成相劑的加入，對該體系相圖的雙節(jié)點曲線的影響不大，相圖的構(gòu)建，為本研究中雙水相系統(tǒng)成相劑濃度的選擇提供依據(jù)。

圖2　牛血清蛋白標準曲線Fig.2　Bovine serum albumin standard curve

圖3　10%的PEG4000被PEG-IDA-Fe3+取代的PEG/（NH4）2SO4系統(tǒng)相圖Fig.3　Phase diagrams of PEG/（NH4）2SO4with 10%PEG4000 substituted by PEG-IDA-Fe3+

2.4成相劑對酶活的影響

圖4　不同質(zhì)量分數(shù)的PEG-IDA-Fe3+對酶活性的影響Fig.4　Effect of concentration of PEG-IDA-Fe3+on the activity of enzyme

圖5　不同質(zhì)量分數(shù)的PEG4000和硫酸銨對酶活性的影響Fig.5　Effect of concentration of PEG4000 and（NH4）2SO4on the activity of enzyme

各成相劑對酶活影響，如圖4和圖5所示，PEGIDA-Fe3+對木瓜蛋白酶活性產(chǎn)生微弱的抑制作用，當其添加量達到9%時，酶活比仍在95%以上；PEG4000對酶活性幾乎沒有影響，高濃度的（NH4）2SO4也會對酶活產(chǎn)生一定抑制，這種抑制一般是可逆的。在實驗過程中PEG-IDA-Fe3+添加量不會超過9%，（NH4）2SO4濃度不會超過22%，因此由各組分形成的雙水相體系，不會對酶的活性造成太大影響。

2.5體系中各組分質(zhì)量分數(shù)對分配行為的影響

2.5.1（NH4）2SO4對分配行為的影響（NH4）2SO4質(zhì)量分數(shù)對酶分配影響，結(jié)果如圖6所示：Y和Kp隨著（NH4）2SO4濃度的增大而迅速增大，在19%～21%存在最大值。說明在雙水相萃取過程中，鹽析作用也是使木瓜蛋白酶趨于上相的重要原因之一；但隨著鹽濃度的增大，一方面對酶活性產(chǎn)生了一定抑制，另一方面鹽含量的增加也使相比減小，使上相酶含量降低。綜上，選取中間值20%作為響應(yīng)面實驗的零水平。

圖6?。∟H4）2SO4質(zhì)量分數(shù)對木瓜蛋白酶分配行為的影響Fig.6　Effect of（NH4）2SO4concentration on partitioning behavior

2.5.2PEG4000對分配行為的影響PEG4000質(zhì)量分數(shù)對酶分配的影響結(jié)果如圖7所示：Y和Kp隨著PEG4000濃度的增大而增大，在濃度為19%時達到最大而后又隨之減小。這是由于PEG4000的濃度增大，系線長度增加，體系兩相性質(zhì)差別增大，木瓜蛋白酶趨于分配在上相，而濃度繼續(xù)增大則上相粘度增加，酶分子與PEG4000在兩相界面形成一層乳狀膜，使酶向上相轉(zhuǎn)移困難而集中在兩相之間。因后期響應(yīng)面實驗要加入PEG-IDA-Fe3+，故降低PEG4000的濃度進行后續(xù)實驗，因此選擇16%進行響應(yīng)面實驗。

圖7　PEG4000質(zhì)量分數(shù)對木瓜蛋白酶分配行為的影響Fig.7　Effect of PEG4000 concentration on partitioning behavior

2.5.3PEG-IDA-Fe3+取代量對分配行為的影響固定雙水相體系PEG4000 19%、（NH4）2SO421%、pH7.0、酶添加量1.0mg/g，用實驗室制備的PEG-IDA-Fe3+取代體系中的PEG4000，考察PEG-IDA-Fe3+的取代量對分配行為的影響。圖8可以看出，采用PEG-IDA-Fe3+代替部分原雙水相中的PEG4000能有效的提高酶在上相的回收率和蛋白濃度比。當體系中PEG-IDAFe3+含量在3%～5%時有最好效果，其上相回收率可由原來的72.16%提高到80.43%，蛋白分配比由1.58提高到1.68。因此，響應(yīng)面實驗中選效果較好的3.5%為PEG-IDA-Fe3+作為零水平。過渡金屬離子與蛋白質(zhì)分子表面氨基酸殘基，會產(chǎn)生配位結(jié)合、π鍵、靜電力作用，因此添加一定量金屬螯合親和成相劑能有效提高酶的分配效果［13］；但取代量增大時，酶與金屬離子的親和接近飽和狀態(tài)，并且PEG-IDA-Fe3+的取代量增大，酶活受到一定的影響而導致分配效果下降，實驗結(jié)果與陸瑾、林東強等［14］利用EOPO/PES/EOPOIDA-Cu2+雙水相體系萃取納豆激酶的結(jié)果相似。

圖8　PEG-IDA-Fe3+取代量對分配行為的影響Fig.8　Effect of PEG-IDA-Fe3+replacement on partitioning behavior

2.6PEG-IDA-Fe3+/（NH4）2SO4親和雙水相系統(tǒng)的響應(yīng)面優(yōu)化及結(jié)果分析

對表4數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合，得到兩個響應(yīng)值的二次多項回歸模型：

Y（%）=89.92-0.49X1-3.23X2+4.72X3-3.81X4+ 0.86X1X2-4.5X1X3+0.58X1X4-3.46X2X3-14.4X2X4-7.95X3X4-12.07X12-11.88X22-26.54X32-20.68X42式（1）

Kp=1.83-0.015X1-0.082X2+0.097X3-0.14X4+ 0.030X1X2-0.11X1X3+0.007X1X4-0.073X2X3-0.32X2X4-0.21X3X4-0.23X12-0.25X22-0.57X32-0.44X42式（2）

方程（1）和方程（2）的R2為0.95和0.97，說明實驗值和預(yù)測值之間相關(guān)度高，模型擬合性良好；校正R2分別為0.91和0.94，表明90%以上的實驗數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來解釋。

對表4實驗數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果見表5。兩個回歸模型的p值都小于0.01，回歸方程極顯著，擬合的二次回歸方程合適。對式（1）中Y（%）回歸方程中一次項系數(shù)的絕對值進行比較，得各因子影響從大到小依次為：（NH4）2SO4質(zhì)量分數(shù)、PEG-IDA-Fe3+質(zhì)量分數(shù)、PEG4000質(zhì)量分數(shù)和pH；式（2）中各因子對Kp影響大小依次為：PEG-IDA-Fe3+質(zhì)量分數(shù)、（NH4）2SO4質(zhì)量分數(shù)、PEG4000質(zhì)量分數(shù)和pH。表5的分析結(jié)果表明，在所選的各因素水平范圍內(nèi)，X2、X3、X4、X2X4、X3X4、X12、X22、X32、X42對Y（%）和Kp影響顯著；X1X3對Kp影響顯著而對Y（%）影響不顯著；X1對Y（%）和Kp影響都不顯著。這表明pH對酶在雙水相中的分配行為影響不大，從側(cè)面反映了木瓜蛋白酶有較寬的pH適應(yīng)性。

對Y（%）和Kp的響應(yīng)面圖進行分析結(jié)果見圖9，如圖9（a）和圖9（b）所示：PEG4000質(zhì)量分數(shù)、（NH4）2SO4質(zhì)量分數(shù)、PEG-IDA-Fe3+的質(zhì)量分數(shù)對酶活回收率Y（%）的影響均類似拋物線，即隨著PEG4000、（NH4）2SO4和PEG-IDA-Fe3+質(zhì)量分數(shù)的增加，酶活回收率有先增后減的趨勢。由圖9（c）和圖9（d）可知，PEG4000質(zhì)量分數(shù)、（NH4）2SO4質(zhì)量分數(shù)和PEG-IDA-Fe3+的質(zhì)量分數(shù)對蛋白分配比Kp影響也呈拋物線形，因此在實際應(yīng)用過程中，應(yīng)控制PEG4000、（NH4）2SO4和PEGIDA-Fe3+的用量。圖9中，Y（%）和Kp的最大值處于各因素條件變化范圍之內(nèi)，表明所選變化范圍合理有效。

表4　響應(yīng)面實驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 4　Experimental design and result of RSM（Actual）

圖9　Y（%）和Kp的響應(yīng)面Fig.9　3D responsive surface of Y（%）and Kp

在已建立的模型基礎(chǔ)上，設(shè)定優(yōu)化目標響應(yīng)值Y（%）和Kp最大，通過Design Expert預(yù)測模型的最優(yōu)條件為：pH=6.9、PEG4000質(zhì)量分數(shù)16%、（NH4）2SO4質(zhì)量分數(shù)20%、PEG-IDA-Fe3+質(zhì)量分數(shù)3%，此時酶活回收率（Y）和蛋白濃度比（Kp）分別為90.50%和1.85。通過3次平行實驗驗證，得到Y(jié)和Kp的實驗值分別為91.25%和1.87，實驗值和預(yù)測值一致性良好，采用響應(yīng)面法對木瓜蛋白酶在親和雙水相中分配條件的優(yōu)化是有效的。

2.7木瓜蛋白酶在萃取體系中的結(jié)構(gòu)表征

UV-vis光譜如圖10所示，雖然上相介質(zhì)對木瓜蛋白酶270nm以下的吸收光譜造成了一定的干擾，但木瓜蛋白酶在富集的上相和純水中的最大吸收峰都出現(xiàn)在278nm處，且峰型基本一致，與不含酶的上相介質(zhì)峰型完全不同。表明萃取到上相的木瓜蛋白酶沒有與萃取介質(zhì)反應(yīng)，紫外吸收特征明顯，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

表5　實驗結(jié)果方差分析Table 5　Variance analysis of test result

圖10　木瓜蛋白酶在不同條件下的UV-vis吸收光譜Fig.10　UV spectra of papain in different conditions

傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）作為一種分析分子結(jié)構(gòu)的有效手段，具有所需樣品少、操作簡便、測量速度快、易測定蛋白質(zhì)的瞬間結(jié)構(gòu)等眾多優(yōu)點［15］。蛋白質(zhì)的紅外吸收光譜主要是由一系列酰胺吸收帶組成，其中，酰胺I帶（Amide I 1600～1700cm-1）主要是C=O伸縮振動吸收，酰胺II帶（Amide II 1480～1575cm-1）主要是C-N伸縮振動吸收，常用于多肽和蛋白質(zhì)的構(gòu)象研究［16］。從圖11可以看出：萃取前木瓜蛋白酶的Amide I吸收峰在1650cm-1，Amide II吸收峰在1539cm-1；萃取后，在木瓜蛋白酶和親和雙水相上相的混合體系中，木瓜蛋白酶的兩個吸收峰仍在相同的位置識別到，并無新的吸收峰形成。說明在親和雙水相中木瓜蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)并未發(fā)生變化，這與Zhiwen Bai等［17］研究離子液體雙水相萃取蛋白質(zhì)有相同的結(jié)論。由此可見，親和雙水相體系萃取蛋白質(zhì)的條件溫和。

圖11　木瓜蛋白酶、親和雙水相上相、富含木瓜蛋白酶的上相FT-IR吸收光譜Fig11　FT-IR spectra of papain，top phase of ATPS，papain in the top phase of ATPS

3　結(jié)論

木瓜蛋白酶在PEG/（NH4）2SO4和PEG-IDA-Fe3+/（NH4）2SO4雙水相體系中分配行為的對比，表明金屬螯合親和雙水相能有效地提高雙水相對木瓜蛋白酶的萃取效果。響應(yīng)面確定PEG-IDA-Fe3+/（NH4）2SO4親和雙水相萃取木瓜蛋白酶的最佳條件：pH6.9、PEG400質(zhì)量分數(shù)為16%、（NH4）2SO4質(zhì)量分數(shù)為20%、PEGIDA-Fe3+質(zhì)量分數(shù)3%，此時木瓜蛋白酶上相酶活性回收率（Y）達90.5%，蛋白分配比（Kp）達1.85，得到的回歸模型擬合度高，能很好的預(yù)測木瓜蛋白酶在雙水相中的分配行為。對比體系中木瓜蛋白酶的UV-vis光譜和FT-IR光譜，其特征吸收峰未發(fā)生改變，表明親和雙水相萃取蛋白質(zhì)的條件溫和，不會破壞蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。

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Study of affinity partition behavior of papain in PEG-IDA-Fe3+/（NH4）2SO4aqueous two-phase system

PENG Jian，ZHANG Hai-de*，DONG An-hua，XU Ying-hao，CAI Tao，WANG Wei-tao，LIU Chang-ling
（Department of Food College，Hainan University，Haikou 570228，China）

Objective：To study the partion behavior of papain in affinity aqueous two-phase system（ATPS）which compossed of PEG，PEG-IDA-Fe3+and（NH4）2SO4.Methods：Investigated the phase diagrams of these two type of ATPS.Considered the influence of reagents on papain activity，and the effect of PEG4000 and（NH4）2SO4concentration，replacement rate of PEG-IDA-Fe3+on partition behavior were investigated.Optimization conditions of papain affinity partitioning were annalyzed using response surface methodology，and enzyme conformation before and after extraction was examinated.Results：The recovery（Y）and partition coefficient（Kp）of papain were achieved 90.5%and 1.85 respectively under the condition of pH6.9，PEG4000 16%（W/W），ammonium sulfate 20%（W/W），PEG-IDA-Fe3+3%（w/w）.Conclusion：PEG-IDA-Fe3+/（NH4）2SO4system could significantly improve the recovery（Y）and partition coefficient（Kp）of papain.The condition of affinity aqueous two-phase system which compossed of PEG-IDA-Fe3+were mild，would not damage the structure features of papain.

affinity aqueous two-phase system；PEG-IDA-Fe3+；papain；partion behavior

TS201.1

A

1002-0306（2015）14-0205-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.034

2014－09－26

彭?。?989-），男，碩士研究生，主要從事食品分離技術(shù)方面的研究。

張海德（1970-），男，博士，教授，主要從事食品分離技術(shù)方面的研究。

國家自然科學基金資助項目（31260401）；海南大學服務(wù)地方經(jīng)濟社會發(fā)展項目（HDSF201306）；海南大學2014年研究生科技創(chuàng)新項目。