胡曉科，孫丹紅，文　君

（成都市疾病預(yù)防控制中心，四川成都610041）

柱前衍生-高效液相色譜法檢測食品中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2

胡曉科，孫丹紅，文君

（成都市疾病預(yù)防控制中心，四川成都610041）

目的：改進柱前衍生-高效液相色譜法測定食品中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2。方法：分別用甲醇-水（8∶2，v∶v）或二氯甲烷提取食品中的黃曲霉毒素。提取液經(jīng)免疫親和柱凈化后，采用三氟乙酸（或甲酸）進行衍生，并利用高效液相色譜儀進行測定。結(jié)果：黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的檢出限分別為0.2、0.2、0.2、0.2μg/kg；在低、中、高加標(biāo)濃度下的回收率分別為81.0%～94.1%、75.6%～92.0%、75.0%～92.4%、77.6%～91.3%。結(jié)論：改進后的柱前衍生-高效液相色譜法克服了樣品基質(zhì)的干擾，測定結(jié)果更準(zhǔn)確。

食品，黃曲霉毒素，免疫親和柱，柱前衍生，高效液相色譜法

黃曲霉毒素（AFT）具有較強的毒性和致癌性，世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦食品、飼料中AFT的最高允許量標(biāo)準(zhǔn)為15μg/kg。我國目前只有B1的允許量標(biāo)準(zhǔn)頒布實施，其中玉米、花生及其制品中最高允許量為20μg/kg；豆類、調(diào)味品及嬰幼兒食品等為0.5～5μg/kg［1］。

目前，我國食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法主要有薄層色譜法［2］和高效液相色譜法（HPLC）［3-5］。其中，HPLC法準(zhǔn)確、靈敏，被廣泛采用，而薄層色譜法靈敏度差、精確度低。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法也有較多研究［6-8］，但所需設(shè)備價格昂貴，不易普及。其他檢測黃曲霉毒素的方法，如酶聯(lián)免疫吸附法［9-10］、熒光光度法［4，11］，只能測定其總量。

HPLC法檢測B1和G1時，需衍生提高其熒光強度。三氟乙酸柱前衍生法的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性通過了確證［12-13］。碘衍生、光化學(xué)衍生等柱后衍生［14-15］法雖然可以實現(xiàn)衍生和檢測同步，但需要另外配備衍生設(shè)備；另外，衍生池增加了柱后死體積，容易造成色譜峰展寬［16］。Waltking等也發(fā)現(xiàn)，在檢測玉米中的B1、G1時，不同的柱后衍生結(jié)果偏差較大［17］。

柱前衍生-HPLC法檢測食品中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2對儀器硬件的要求較低、測定結(jié)果偏差小，但往往存在較大的基體干擾，尤其是花椒、茶葉等。為了進一步提高方法的準(zhǔn)確性，擴大樣品適用性，本文改進了樣品前處理方法，包括提取溶劑、凈化方法等，克服了基質(zhì)干擾，獲得了更為準(zhǔn)確、可靠的檢測結(jié)果。發(fā)現(xiàn)甲酸與三氟乙酸的衍生效果相當(dāng)，可避免使用強揮發(fā)性試劑。通過各項技術(shù)指標(biāo)的檢驗，證明本方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好、重現(xiàn)性強。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

乙腈、甲醇色譜純；黃曲霉毒素總量免疫親和柱ROMER，AflaStarTMR；真菌毒素多功能凈化柱ROMER，MycosepTM226；黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)中國農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)督所；花生中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2質(zhì)控樣FAPAS T04233QC。

Agilent 1200高效液相色譜儀美國；SUPELCO固相萃取裝置美國；PCJ超純水儀成都品成科技公司；MTN-5800氮吹儀天津奧特賽恩斯公司。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確吸取黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)貯備液（B1：2.0μg/mL；G1：2.0μg/mL；B2：2.0μg/mL；G2：2.0μg/mL）各0、10、15、20、25、50、100、150、250μL，用乙腈稀釋定容至5.0mL。

準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)系列濃度的溶液各0.3mL，60℃氮氣吹干后，加入100μL三氟乙酸、200μL正己烷，封口后于烘箱中40℃衍生30min，40℃氮氣吹干，準(zhǔn)確加入0.3mL乙腈-水溶液（2∶8，v∶v）溶解，過0.45μm濾膜后供HPLC測定。

1.3色譜條件

色譜柱：AgilentZORBAXEclipseXDB-C18（4.6mm×250mm，5μm）column；熒光檢測器：激發(fā)波長360nm、發(fā)射波長460nm；柱溫35℃；進樣量：20μL；流動相：A：水，B：乙腈，流速為1.0mL/min，梯度洗脫變化見表1。

表1　流動相的梯度洗脫表Table 1　Gradient timetable

1.4樣品預(yù)處理

1.4.1花生、玉米、黃豆等固體樣品磨細（粒度小于2mm）、混勻，在105℃烘干至恒重；液體樣品則搖勻后直接取用。稱取20.0g樣品于250mL具塞錐形瓶中，加入5.0g氯化鈉及100mL甲醇-水溶液（8∶2，v∶v），震搖萃取30min。過濾，準(zhǔn)確移取10mL濾液，加入30mL水稀釋，用玻璃纖維濾紙過濾至濾液澄清，備用。

1.4.2茶葉、花椒等準(zhǔn)確稱取10.0g經(jīng)磨細和烘干的樣品（粒度小于2mm），加入50mL二氯甲烷萃取，準(zhǔn)確移取5mL萃取液，揮干溶劑后，剩余物用5mL甲醇溶解，再加入15mL水稀釋，備用。

將免疫親和柱（IAC）連接注射器及帶真空系統(tǒng)的固相萃取裝置。調(diào)節(jié)壓力使上述濾液以約6mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，用10mL水淋洗柱子2次，棄去淋洗液，直至2～3mL空氣通過柱體。用2mL甲醇分兩次洗脫，收集洗脫液60℃氮氣吹干。加入100μL三氟乙酸及200μL正己烷，封口后于烘箱中40℃衍生30min，40℃氮氣吹干，準(zhǔn)確加入0.3mL乙腈-水溶液（2∶8，v∶v）溶解，過0.45μm濾膜后供HPLC測定。

2　結(jié)果與分析

2.1方法線性及檢出限

按1.2中所配制的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)濃度系列，分別進樣，其中每個濃度點至少測定三次，檢測結(jié)果取其平均值。測定結(jié)果表明，各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度與色譜峰峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.998。以基線噪聲的3倍所相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)物濃度為儀器檢出限，并根據(jù)樣品前處理過程分別計算各物質(zhì)的最低檢測濃度，結(jié)果為B10.2μg/kg、G10.2μg/kg、B20.2μg/kg、G20.2μg/kg。

2.2準(zhǔn)確度和重復(fù)性實驗

取同一批花生中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的質(zhì)控樣品（FAPAS T04233QC）6份進行測定，考察方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。如表2所示，B1、B2、G1、G2的測定結(jié)果均在定值的范圍內(nèi)，可見本方法具有良好的準(zhǔn)確性。6次重復(fù)實驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為11.8%，說明雖然經(jīng)過了提取、凈化、衍生、氮吹等較復(fù)雜的前處理過程，本方法仍然具有良好的重復(fù)性。

表2　質(zhì)控樣品重復(fù)測定結(jié)果（n=6）Table 2　Reproducibility of the measured results for QC（n=6）

2.3加樣回收實驗和精密度測定結(jié)果

取花生、花椒等不同類食品，分別按低、中、高濃度加入黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)，按照1.4中樣品預(yù)處理方法對待測物進行提取、凈化和衍生，經(jīng)高效液相色譜儀分析、定量，計算出各食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的加樣回收率，結(jié)果見表3。盡管在所測樣品中均未檢出相應(yīng)的待測物，但加標(biāo)濃度在0.5～5.0μg/kg時，B1、B2、G1、G2的回收率分別為81.0%～94.1%、75.6%～92.0%、75.0%～92.4%、77.6%～91.3%。說明本方法在檢測不同類食品中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2時具有良好的準(zhǔn)確性。連續(xù)6次的測定結(jié)果顯示，B1、B2、G1、G2的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為3.2%～5.1%、3.2%～5.8%、3.5%～5.7%、3.2%～5.8%。

2.4前處理方法對檢測結(jié)果的影響

2.4.1凈化方法的對比在分析食品中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2時，專用黃曲霉毒素分離純化的多功能凈化柱（MFC）、免疫親和柱（IAC）被廣泛應(yīng)用。其中，MFC能吸附蛋白質(zhì)、脂肪等大分子雜質(zhì)，已被GB/T 5009.23-2006和AOAC 994.08采用，適用基質(zhì)為玉米、花生、堅果等；IAC與目標(biāo)毒素形成抗原-抗體，能夠特異性吸附提取液中的AFT，同時實現(xiàn)樣品的富集和凈化。目前市場化的IAC僅適合乙腈-水或甲醇-水提取溶液凈化，且有機相的比例不能過高，否則會抑制抗體的特異反應(yīng)性。

表3　黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的加標(biāo)回收率和精密度測定結(jié)果（n=6）Table 3　Recovery factors and relative standard deviation of aflatoxin B1、B2、G1、G2（RSD，n=6）

圖1　加標(biāo)花生樣品中黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的液相色譜圖Fig.1　Chromatograms of peanut sample with aflatoxin standards

通過比較MFC和IAC的凈化效果發(fā)現(xiàn)：兩者對玉米、黃豆、花生等堅果、花生油均能起到凈化的作用，但后者的凈化效果更好。以花生為例，圖1（a）、圖1（b）分別是經(jīng)MFC、IAC凈化的加標(biāo)樣品色譜圖。比較二者可以看出，經(jīng)MFC凈化的樣品仍含有一定量的雜質(zhì)，造成色譜圖的基線抬高；而經(jīng)IAC凈化的樣品則很干凈。從回收率來看，經(jīng)IAC凈化的B1、B2、G1、G2回收率也更高。另一方面，對于茶葉、花椒等樣品，MFC幾乎起不到凈化的效果。

雜質(zhì)凈化不徹底一方面會對色譜柱、檢測器造成污染，降低檢測靈敏度和精密度；另一方面還會影響檢測結(jié)果的定性，造成假陽性并最終影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，凈化樣品提取液，適宜用凈化效果更佳的免疫親和柱（IAC）。

2.4.2提取溶劑的比較由于黃曲霉毒素難溶于水，而易溶于甲醇、乙腈、氯仿等有機溶劑，因此，一般用含高濃度有機相的水溶液，如乙腈或甲醇-水溶液來提取樣品中的黃曲霉毒素［18-20］。在實際檢測過程中，用甲醇（或乙腈）-水溶液（v∶v=8∶2）提取玉米、黃豆、花生類堅果、植物油、辣椒等食品中的黃曲霉毒素，提取液經(jīng)過免疫親和柱的凈化后，基本能夠消除共提物中基質(zhì)的干擾。但是，用上述提取液處理茶葉、花椒時，卻存在較大的基質(zhì)干擾。以加標(biāo)的茶葉為例，如圖2（a）所示，存在較多與待測物保留時間接近的雜質(zhì)，即使改變色譜條件也很難將其分開。同時，雜質(zhì)也極大地影響了對待測物的回收，B1、B2、G1、G2的回收率均降至40%以下。如果改用二氯甲烷（CH2Cl2）提取，則能很好地消除基質(zhì)的干擾。如圖2（b）所示，即使不用免疫親和柱凈化提取液，也只在G1的色譜峰附近有雜質(zhì)干擾。如果要完全去除，則需要在前處理過程中進一步增加凈化步驟。具體方法為：蒸干提取液中的CH2Cl2，用甲醇溶解殘渣，加水稀釋后，再通過免疫親和柱凈化。用該方法測定茶葉、花椒等食品中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，回收率均在75%以上。

圖2　加標(biāo)茶葉中黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的液相色譜圖Fig.2　Chromatograms of tea sample with aflatoxin B1，B2，G1，G2standards

2.4.3衍生條件對檢測結(jié)果的影響取黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2濃度均為20ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照三氟乙酸衍生過程，分別在25（室溫）、40、50、60℃下衍生15、30min。結(jié)果見表4，表明：衍生溫度為25（室溫）、40℃時，B1、B2、G1、G2的定量結(jié)果一致；同時，衍生15min和30min沒有明顯的區(qū)別。但是，當(dāng)衍生溫度為50℃或更高時，B1、B2、G1、G2的定量結(jié)果反而降低。推測原因是溫度高于50℃時，三氟乙酸和正己烷攜帶待測物揮發(fā)造成損失。

表4　衍生溫度和時間的影響Table 4　Derivation results at different temperature in 15 or 30 minutes

三氟乙酸是一種強揮發(fā)性的酸，在使用過程中可能對操作者造成身體的損傷，同時對環(huán)境也不利，可以考慮用其他相對安全的有機酸，如甲酸、乙酸代替。實驗結(jié)果表明，當(dāng)保持其他衍生條件不變時，等量的甲酸與三氟乙酸的衍生效果相當(dāng)；相反，乙酸并不能有效地增強B1、G1的熒光強度。

3　結(jié)論

柱前衍生-高效液相色譜（HPLC）法測定食品中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2時，容易受到復(fù)雜樣品基質(zhì)的干擾。免疫親和柱（IAC）對提取液的凈化效果優(yōu)于多功能凈化柱（MFC）。用二氯甲烷提取茶葉、花椒類食品中的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，共提物中的干擾雜質(zhì)大大減少。在相同的衍生條件下，甲酸可以代替三氟乙酸起到同樣的衍生效果。改進后的柱前衍生-HPLC法根據(jù)樣品特點，采用不同的前處理方法，既克服了樣品基質(zhì)的干擾，保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，又能減少有毒、有害試劑的使用。該方法靈敏度高，準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性好，實用性強。

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［3］中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所.GB/T 5009.23-2006食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測定第三法高效液相色譜法［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012.

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Determination of aflatoxins B1，B2，G1，and G2in foods by high performance liquid chromatography with pre-column derivation

HU Xiao-ke，SUN Dan-hong，WEN Jun
（Chengdu Center for Disease Control and Prevention，Chengdu 610041，China）

The method was improved to determine aflatoxins B1，B2，G1，G2in foods by high performance liquid chromatograph with pre-column derivation.Samples were extracted by methanol-water solution（8∶2，v∶v）or dichloromethane according to the different food types.The extracts were cleaned up by immunoaffinity column. After derivation by CF3COOH or HCOOH，the determination of aflatoxins was performed by high performance liquid chromatography with a fluorescence detector.The detection limits of aflatoxins B1，B2，G1，G2were 0.2，0.2，0.2 and 0.2μg/kg respectively.The recoveries at different level spiked ranged from 75.0%to 94.1%. The improved method was more accurate for different foods by overcoming the matrix disturbance.

foods；aflatoxins；immunoaffinity column；pre-column derivatization；high performance liquid chromatography

TS207.3

A

1002-0306（2015）12-0049-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.001

2014－09－11

胡曉科（1976-），女，博士，主管技師，研究方向：食品衛(wèi)生理化檢驗。