徐麗萍，杜寶磊，2，李春陽，劉曉林（.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱50000；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所，江蘇南京20000；.徐州林泉綠色食品飲料廠，江蘇徐州227）

桑葚汁復(fù)合酶法制取工藝的優(yōu)化研究

徐麗萍1，杜寶磊1，2，李春陽2，*，劉曉林3
（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150000；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所，江蘇南京210000；3.徐州林泉綠色食品飲料廠，江蘇徐州221711）

本文對復(fù)合酶法制取桑葚汁進(jìn)行了研究。通過對多種酶的篩選，選定果膠酶、纖維酶為復(fù)合對象。在單因素基礎(chǔ)上，對酶的復(fù)配比例、酶解pH、酶解溫度、酶解時間進(jìn)行組合實驗，采用響應(yīng)曲面分析，對復(fù)合酶法制取桑葚汁工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：酶的復(fù)配比例1.0∶1.36、酶解pH5.0、酶解溫度49.5℃、酶解時間2.6 h，此時桑葚出汁率最高為86.13%，較果膠酶酶解出汁率提高了10.92%。

桑葚汁，復(fù)合酶法，響應(yīng)面法，出汁率

桑葚（Mulberry）又名桑果、桑葚子、桑棗等，為多年生?？茖僦参锍墒旃麑嵉慕y(tǒng)稱，已被列為我國首批“既食品又是藥品”［1-2］。桑葚中含有豐富的活性蛋白、維生素A、維生素B、氨基酸、酒石酸、礦物質(zhì)鈣、鋅、磷、鐵、多酚、花色苷、白藜蘆醇等營養(yǎng)成分。桑葚能夠顯著提高人體免疫力，預(yù)防動脈硬化、高血壓、高血脂、瘰疬關(guān)節(jié)不利等疾病，具有延緩衰老、烏發(fā)明目、促進(jìn)消化、補(bǔ)血益陰、固精安胎等功效，被醫(yī)學(xué)界譽(yù)為“21世紀(jì)的最佳保健果品”［3-5］。

桑葚果柔軟多汁，成熟后含水量在80%以上，由于沒有堅硬的外殼保護(hù)，其采后十分容易腐爛［6］，且每年桑葚采收季短，產(chǎn)量大，致使大量桑葚資源浪費。目前，桑葚加工產(chǎn)品已有桑葚汁飲料、果醬、糕點等，其中桑葚汁飲料生產(chǎn)占了很大的比重，并且飲料的市場需求量呈逐年上升趨勢。

在果汁加工中，由于水果細(xì)胞壁和細(xì)胞膜是由果膠、纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)等物質(zhì)構(gòu)成，傳統(tǒng)壓榨工藝難將原料中果膠、纖維素、淀粉等大分子物質(zhì)形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞，且得到果漿粘稠，壓榨取汁困難，出汁率低。酶法出汁是當(dāng)前較為新穎的提高果蔬出汁率的技術(shù)，但大部分采用單一酶酶解處理技術(shù)，如利用果膠酶、纖維素酶等酶法提高水果出汁常有報道［7-10］。而在桑葚汁加工中仍常采用壓榨法出汁，此法不僅出汁率低，并且殘渣過多，難以處理［11-12］。

本研究樣品桑葚中含有粗纖維、蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)化糖等多種成分［13］，通過綜合分析，最終從多種酶中選取果膠酶、纖維素酶、蛋白酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶進(jìn)行酶解實驗，并對其作用效果進(jìn)行評價，通過篩選得到酶解效果較優(yōu)的兩種酶作為復(fù)合目標(biāo)酶，并進(jìn)行單因素實驗和響應(yīng)面優(yōu)化實驗，得到最優(yōu)復(fù)合酶酶解制取桑葚汁條件，旨在為桑葚汁的酶法制取工藝提供一定的理論基礎(chǔ)和依據(jù)，同時為桑葚的深加工開辟一條新途徑。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

桑葚果由江蘇海苑食品有限公司提供；果膠酶（酶活30000 IU/g）、纖維素酶（酶活20000 IU/g）、蛋白酶（酶活50000 IU/g）、木聚糖酶（酶活85000 IU/g）、β-葡聚糖酶（酶活38000 IU/g）、檸檬酸、碳酸鈉湖南尤特爾生化有限公司，均為分析純。

組織搗碎機(jī)江陰市保利科研儀器有限公司；DD-5M湘儀離心機(jī)湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司；HJ-6A磁力加熱攪拌器、XH-C型漩渦混合器金壇市白塔新寶儀器廠；CHD-0515低溫恒溫槽金壇市維誠實驗器有限公司；分析天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV5500紫外可見分光光度計上海元析儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1工藝流程冷凍桑葚→挑選→解凍→搗碎→桑葚漿→調(diào)節(jié)pH→添加酶→酶解→85℃滅酶→過濾→桑葚汁。

1.2.2單酶篩選將桑葚解凍、組織搗碎后，稱取桑葚漿50 g，加入一倍質(zhì)量的去離子水，篩選目標(biāo)酶為果膠酶、纖維素酶、蛋白酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶，各酶最大添加量為0.20%（以桑葚漿質(zhì)量計），酶解條件為：溫度50℃、時間2 h、pH以各酶最適pH為準(zhǔn)，以出汁率評價酶解效果［14］。選取酶解效果較好的兩種酶。

1.2.3復(fù)合酶組合酶解單因素實驗

1.2.3.1酶的復(fù)配比例對桑葚汁出汁率的影響在酶解溫度50℃、pH4.0基礎(chǔ)上，改變酶的復(fù)配比例為1.0∶0.5、1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0、1.0∶2.5、1.0∶3.0（酶的復(fù)配比例1.0∶1.0時，果膠酶添加量為0.06%，纖維素酶添加量為0.14%，以桑葚漿重量計，在改變酶的復(fù)配比例時，固定果膠酶添加量為0.06%），恒溫酶解2 h，取出后加熱至85℃滅酶5 min，經(jīng)過濾，得到桑葚汁，測定出汁率。出汁率計算公式如下：

1.2.3.2酶解pH對桑葚汁出汁率的影響在酶的復(fù)配比例1.0∶1.5、酶解溫度50℃基礎(chǔ)上，改變酶解pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，恒溫酶解2 h，取出后加熱至85℃滅酶5 min，經(jīng)過濾，得到桑葚汁，測定出汁率。

1.2.3.3酶解時間對桑葚汁出汁率的影響在酶的復(fù)配比例1.0∶1.5、酶解溫度50℃、酶解pH4.0的基礎(chǔ)上，恒溫酶解，改變酶解時間為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h，取出后加熱至85℃滅酶5 min，經(jīng)過濾，得到桑葚汁，測定出汁率。

1.2.3.4酶解溫度對桑葚汁出汁率的影響在酶的復(fù)配比例1.0∶1.5、酶解pH4.0基礎(chǔ)上，改變酶解溫度值為35、40、45、50、55、60℃，恒溫酶解2 h，取出后加熱至85℃滅酶5 min，經(jīng)過濾，得到桑葚汁，測定出汁率。

1.2.4酶解條件優(yōu)化方案在單因素實驗基礎(chǔ)上，選取酶的復(fù)配比例（A）、酶解pH（B）、酶解時間（C）、酶解溫度（D）作為響應(yīng)曲面的考察因素，以1、0、-1分別代表高、中、低水平，以出汁率（R1）為響應(yīng)值，設(shè)計4因素3水平29個實驗點的響應(yīng)曲面實驗，各響應(yīng)因子的實驗水平見表1。根據(jù)實驗表進(jìn)行實驗，對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到回歸方程。

表1　中心組合設(shè)計因素水平Table 1　Factors and levels of central composite design

1.3數(shù)據(jù)處理

實驗設(shè)計和數(shù)據(jù)處理使用Design-Expert 8.06.1軟件完成［15］。

2　結(jié)果與討論

2.1單酶篩選結(jié)果與分析

由單酶篩選所得到的圖1可以看出，與無酶條件相比，果膠酶酶解作用效果最優(yōu)，出汁率可達(dá)75.21%，其次為纖維素酶，出汁率可達(dá)74.55%，其他三種酶酶解出汁率均小于兩者，故選果膠酶、纖維素酶作為復(fù)合目標(biāo)酶，研究其最優(yōu)酶解工藝條件。

圖1　不同水解酶對桑葚汁出汁率的影響Fig.1　The effect of different enzymes on the yield of mulberry juice

2.2單因素實驗結(jié)果與分析

2.2.1酶的復(fù)配比例對桑葚汁出汁率的影響由圖2可知，桑葚出汁率隨酶的復(fù)配比例的增大而增大，是由于果膠酶能夠使聚半乳糖醛酸分解成游離的半乳糖醛酸，破壞組織結(jié)構(gòu)，纖維素酶破壞纖維素鏈的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，破壞細(xì)胞壁，從而促使細(xì)胞液流出，提高出汁率［16-17］。

當(dāng)酶的復(fù)配比例為1.0∶1.5時，出汁率達(dá)到80.41%，此時，繼續(xù)增大果膠酶、纖維素酶的添加比例，其出汁率不再增加，因為此時酶用量已經(jīng)趨于飽和，水解環(huán)境中能夠與果膠反應(yīng)的果膠酶分子，與纖維素、半纖維素等反應(yīng)的纖維素酶分子已基本達(dá)到酶解結(jié)合反應(yīng)體系穩(wěn)態(tài)。致使多余的酶無法與底物發(fā)生催化作用，從而不能起到提高催化效果的作用，出汁率沒有產(chǎn)生明顯變化。

根據(jù)出汁率的變化情況，選擇果膠酶、纖維素酶的復(fù)配比例1.0∶1.0～1.0∶2.0作為優(yōu)化范圍。

圖2　果膠酶、纖維素酶復(fù)配比例對桑葚汁出汁率的影響Fig.2　The effect of the ratio of pectinase and cellulose enzyme complex on the yield of mulberry juice

2.2.2酶解pH對桑葚汁出汁率的影響由圖3可知，在pH為3.5～4.5時，桑葚出汁率隨酶解pH的增大而增大，當(dāng)解pH為4.5時，出汁率達(dá)到80.80%。本文中所用為酸性果膠酶、酸性纖維素酶，最適pH分別為3.5和4.5，繼續(xù)增高pH，果膠酶、纖維酶的活力將會受到抑制，造成酶活力下降，同時會破壞酶的空間構(gòu)象，改變酶分子與底物分子的帶電基團(tuán)狀態(tài)，無法完成酶催化作用。pH的改變影響酶活中心基團(tuán)的解離狀態(tài)和底物的解離狀態(tài)，使得底物不能與其結(jié)合，造成酶促反應(yīng)無法發(fā)生［18］，還能影響酶活性中心催化基團(tuán)的解離，使得底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物過程受到影響，從而使得單位時間內(nèi)分解底物量減少，導(dǎo)致細(xì)胞溶出物降低，出汁率下降。

圖3　酶解pH對桑葚汁出汁率的影響Fig.3　The effect of pH of enzymolysis solution on the yield of mulberry juice

根據(jù)出汁率的變化情況，選擇酶解pH4.0～5.0作為優(yōu)化范圍。

2.2.3酶解溫度對桑葚汁出汁率的影響由圖4可知，桑葚出汁率隨酶解溫度值的增大而增大，因為溫度升高，底物活化能增加，分子熱運動加快，鄰近效應(yīng)、靜電結(jié)合效應(yīng)［19］及分子內(nèi)催化反應(yīng)增強(qiáng)，提高了酶與底物的結(jié)合率，促進(jìn)了酶解反應(yīng)的發(fā)生，出汁率增加。

當(dāng)酶解溫度為50℃時，桑葚汁的出汁率為79.23%，此時溫度繼續(xù)升高，會造成局部酶解環(huán)境差異，導(dǎo)致催化的部分基團(tuán)出現(xiàn)狀態(tài)不一的解離；并會破壞酶與底物某些基團(tuán)形成的不穩(wěn)定共價中間物，導(dǎo)致共價結(jié)構(gòu)解除，無法完成酶催化反應(yīng)；還可能導(dǎo)致部分酶分子發(fā)生變性甚至失活，導(dǎo)致酶分子與底物結(jié)合效率下降［20］，酶解速率降低，從而使出汁率呈下降趨勢。

根據(jù)出汁率的變化情況，選擇酶解溫度45～55℃作為優(yōu)化范圍。

圖4　酶解溫度對桑葚汁出汁率的影響Fig.4　The effect of enzymolysis hydrolysis temperature on the yield of mulberry juice

2.2.4酶解時間對桑葚汁出汁率的影響由圖5可知，桑葚出汁率隨酶解時間的增大而增大，當(dāng)酶解時間2.5 h時，桑葚汁的出汁率為81.70%，隨著時間的延長，出汁率沒有明顯變化。這是由于在相同底物濃度的情況下，經(jīng)過一定時間酶解反應(yīng)后，底物中能夠與酶結(jié)合的有效反應(yīng)物質(zhì)已經(jīng)得到充分分解，酶解作用基本趨于最終態(tài)。從而造成持續(xù)延長時間對酶解效果無明顯影響，出汁率變化不明顯。

圖5　酶解時間對桑葚汁出汁率的影響Fig.5　The effect of enzymolysis time on the yield of mulberry juice

據(jù)出汁率的變化情況，選擇酶解時間1.5～2.5 h作為優(yōu)化范圍。

2.3響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析

由響應(yīng)曲面實驗，得出以下結(jié)果，見表2。

表2　Box-behnken實驗方案與結(jié)果Table 2　Box-behnken design and results

由表2中實驗數(shù)據(jù)得到如下出汁率回歸方程：

Y=84.25+1.03A+2.22B+0.35C+0.16D-0.140AB-0.87AC+2.62AD-0.13BC+0.34BD-0.41CD-2.10A2+ 0.16B2-2.04C2-3.54D2

出汁率回歸模型的相關(guān)系數(shù)平方R2=0.9590，說明回歸擬合度良好，可以對出汁率進(jìn)行分析和預(yù)測。

方程中各項系數(shù)絕對值大小直接反應(yīng)各因素對響應(yīng)值的影響程度，根據(jù)以上兩個方程中系數(shù)絕對值大小對比，可知影響因子的主效應(yīng)順序為：B＞A＞C＞D，即酶解pH＞酶的復(fù)配比例＞酶解時間＞酶解溫度。

對回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗、方差分析及各因素最佳點分析，結(jié)果見表3。

表3　回歸方程ANOVA分析出汁率結(jié)果Table 3　ANVOA analysis of regression equation

用Design-Expert軟件對表3進(jìn)行二次多元回歸擬合，并對各個模型的回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗、方差分析及各因素最佳點分析，可以得到酶的復(fù)配比例與酶解pH、酶解溫度交互作用顯著，所得的二次回歸方程的響應(yīng)曲面見圖6～圖7。

圖6　酶的復(fù)配比例、酶解pH交互作用影響出汁率曲面圖Fig.6　Response surface plot of the ratio of enzyme complex，enzymolysis solution pH on the yield of juice

圖7　酶的復(fù)配比例、酶解溫度交互作用影響出汁率曲面圖Fig.7　Response surface plot of the ratio of enzyme complex，enzymolysis hydrolysis temperature on the yield of juice

由圖6可知，當(dāng)固定酶的復(fù)配比例時，桑葚出汁率在pH5.0之前隨pH的增大而增大，當(dāng)pH超過5.0時，持續(xù)增大pH，出汁率出現(xiàn)下降趨勢，這是由于酶解環(huán)境酸堿度的變化，會影響酶分子活性部位上有關(guān)基團(tuán)的解離，從而影響酶與底物的結(jié)合或催化，使酶活性降低，造成桑葚出汁率下降［21］；當(dāng)固定酶解pH，出汁率隨酶的復(fù)配比例增大而增大，果膠酶、纖維素酶復(fù)配加入比例逐漸達(dá)到飽和時，出汁率趨于平緩。

由圖7可知，當(dāng)固定酶的復(fù)配比例時，隨著酶解溫度的升高，出汁率升高，當(dāng)溫度達(dá)到49.54℃時，繼續(xù)升高溫度，出汁率下降。這是由于升高溫度雖能夠增強(qiáng)酶解效果，但當(dāng)溫度超過最適酶解溫度時，酶活力會受到抑制，從而導(dǎo)致了出汁率下降。當(dāng)固定酶解溫度不變時，隨著雙酶復(fù)配比例增加，出汁率出現(xiàn)先增加后下降趨勢，當(dāng)果膠酶、纖維素酶復(fù)配比例達(dá)到1.0∶1.36時，出汁率達(dá)到最大值。

2.4驗證實驗

通過對桑葚汁出汁率的二次項數(shù)學(xué)模型解逆矩陣，得出在酶的復(fù)配比例1.0∶1.36、pH5.0、溫度49.54℃、時間2.63 h的工藝條件下，桑葚汁出汁率預(yù)測值為86.55%。為方便實驗將參數(shù)修改為：酶的復(fù)配比例1.0∶1.36、pH5.0、溫度49.5℃、時間2.6 h。按上述最優(yōu)條件進(jìn)行酶解實驗，3次實驗測得的桑葚汁平均出汁率為86.13%，理論值和實驗值的相對誤差為0.42%，基本與預(yù)測值保持一致，因此采用響應(yīng)曲面優(yōu)化得到的提取條件準(zhǔn)確可靠，具有使用價值。

3　結(jié)論

通過對5種酶單酶酶解桑葚出汁效果的篩選，得到果膠酶、纖維素酶單酶酶解效果明顯，出汁率分別可達(dá)75.21%、74.55%，從而選取兩者作為復(fù)合目標(biāo)酶，將兩種酶復(fù)配后，根據(jù)單因素和響應(yīng)曲面分析，得出復(fù)合酶酶解最優(yōu)工藝參數(shù)為果膠酶、纖維素酶的復(fù)配比例1.0∶1.36、pH5.0、酶解溫度49.5℃、酶解時間2.6 h，此時酶解桑葚出汁率可達(dá)86.13%，較果膠酶單酶酶解出汁率提高了10.92%。

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Optimum technology of preparing mulberry juice by compound enzymolysis method

XU Li-ping1，DU Bao-lei1，2，LI Chun-yang2，*，LIU Xiao-lin3
（1.College of Food Science and Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150000，China；2.Agricultural Products Processing Institute of Jiangsu Academy of Agricultural Science，Nanjing 210000，China；3.Xuzhou Linquan Green Food Beverage Factory，Xuzhou 221711，China）

The conditions of preparing mulberry juice by compound enzymolysis were studied.The pectinase and cellulose were regard as compound object by selecting of enzymes.On the basis of single-factor-test，process parameters of mulberry juice were optimized by combination experiments，with response surface methodology analysis was employed to explore the effect of the ratio of enzyme complex，enzymolysis solution pH，enzymolysis hydrolysis temperature，enzymolysis time on the yield of mulberry syrup.The results showed that the optimal parameters were as follows：the ratio of enzyme complex was 1.0∶1.36，enzymolysis pH5.0，enzymolysis temperature 49.5℃，enzymolysis time 2.6 h，the juice yield was 86.13%，compared with the pectinase enzyme hydrolysis rate increased by10.92%.

mulberry juice；compound enzymolysis；response surface methodology；juice yield

TS201.1

A

1002-0306（2015）18-0165-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.025

2014－12－05

徐麗萍（1963-），女，碩士，研究方向：食品營養(yǎng)與安全，E-mail：xuliping@126.com。

李春陽（1966-），男，博士，研究員，研究方向：營養(yǎng)與活性物質(zhì)，農(nóng)產(chǎn)品精深加工，E-mail：lichunyang968@126.com。

2014年國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201503147）；2014江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新基金（CX（14）2120）；2014江蘇省蘇北科技專項資金（富民強(qiáng)縣）項目（BN2014088）。