劉曉鵬，朱允華，劉 清，史 齊，李合松

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學 植物激素與生長發(fā)育湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.南華大學 藥學與生物科學學院，湖南衡陽 421001)

水稻是我國最重要的糧食作物之一[1]，雜交水稻的推廣應用大幅度提高了水稻單位面積產(chǎn)量[2]，超級稻育種計劃所確立的理想株型塑造與雜種優(yōu)勢利用相結(jié)合的技術路線已取得良好效果[3]，其中培育理想株型品種被認為是提高水稻產(chǎn)量途徑中最具潛力的方法之一，相關科研工作者希望通過水稻品種設計培育出“新株型”品種，使其最大限度地提高群體光能利用率，從而實現(xiàn)增產(chǎn)目標[4]。

水稻光合能力既受環(huán)境影響，更受品種制約，在相同環(huán)境中不同品種的光合特性存在較大差異[5]。光合作用的相關產(chǎn)物既是植物自身生長發(fā)育的物質(zhì)基礎，也是作物生產(chǎn)力高低的決定性因素。蔗糖除滿足植物體內(nèi)各種生長組織和再生組織的生長需求外，還參于纖維素、儲藏物質(zhì)的生物合成，如淀粉、果聚糖、脂類等[6]。可溶性糖是植物體內(nèi)一種重要的化合物，其含量的高低反映了植物體內(nèi)可利用態(tài)物質(zhì)和能量的供應基礎[7]。比較分析不同株型水稻材料生長發(fā)育過程中光合生理特性的差異，可為新品種選育過程中，考察與光合利用效率相關的某些生理指標提供參考依據(jù)。本研究前期獲得一個水稻突變體材料CA648，該突變體表型明顯不同于對照中花11，株高可受不同生長調(diào)節(jié)劑處理而顯著改變，但其多分蘗特性非常穩(wěn)定[8]。本文對該突變體及對照的葉綠素含量、蔗糖含量、光合作用以及相關酶活性等生理指標進行比較分析，以期為后續(xù)闡明該突變體相關基因的生物學功能提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

粳稻品種中花11(ZH11)，突變體叢矮648(CA648)。其中CA648是由T-DNA插入ZH11基因組引起突變的矮桿多分蘗突變體。

1.2 方法

1.2.1 實驗設計 試驗在湖南農(nóng)業(yè)大學植物激素與生長發(fā)育湖南省重點實驗室的網(wǎng)室進行。供試種子在常溫下浸種72 h后，取發(fā)芽種子播種在鋪滿花園土的陶土盆中育苗。育苗30 d后移栽至盆缽中，單本移植，4次重復。

1.2.2 分蘗數(shù)測定 分蘗數(shù)從水稻分蘗期(以2014年7月7日為水稻分蘗期)開始，分別在分蘗期開始后10 d(分蘗前期)、20 d(分蘗盛期)、30 d(分蘗盛期)、40 d(分蘗后期)測定，共測4次。每品種測量9～12個單株，取平均值。

1.2.3 葉綠素相對含量測定 采用Konica Minolta SPAD-502進行測量，每盆測量10個水稻葉片，取平均值。

1.2.4 光合作用測定 按王惠群等[9]的方法稍作修改，在水稻分蘗后期晴朗天氣的上午 10:00～12:00，采用Li-6400便攜式光合作用系統(tǒng)測定凈光合速率、胞間CO2濃度、氣孔導度和蒸騰速率等光合作用參數(shù)，測定環(huán)境條件為開放式氣路、紅藍光源、光通量密度1000 μmol·m-2·s-1、相對濕度70%和溫度20 ℃。選取生長一致的4盆中各1株的頂下第2完全展開葉進行測定。

1.2.5 還原糖、蔗糖含量測定 還原糖的測定根據(jù)DNS比色法稍作修改。在分蘗盛期(2014年7月29日)分別取兩種材料的新鮮莖和葉置于研缽中，剪碎，加液氮研磨，磨勻后稱重并倒入容量瓶，加 20 mL 50%乙醇，45 ℃水浴2 h(重復2次)，離心并過濾收集2次上清，蒸餾水定容至100 mL。其余步驟按郝再彬等[10]的方法進行。

蔗糖含量的測定按照張遲[11]的方法。按上述還原糖測定的方法測定樣品的還原糖含量(R1)，取測完的樣品處理液50 mL，加入5 mL 6 mol·L-1鹽酸，在68～70 ℃水解15 min，冷卻后加2滴甲基紅指示劑，用5 mol·L-1氫氧化鈉溶液中和，定容至100 mL，搖勻后按上述方法測定還原糖含量(R2)。蔗糖含量的計算公式為：蔗糖含量X= (2×R2 - R1) × 0.95

1.2.6 過氧化物酶活力測定 按照張志良[12]的方法進行測定。酶活計算公式如下：

酶的比活力(0.01ΔA·g-1·min-1)＝(ΔA×D) / (0.01×W×t)

式中，ΔA為反應時間內(nèi)吸光度的變化，t為反應時間(min)，D為稀釋倍數(shù)，W為冷凍干燥樣品重(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CA648和ZH11分蘗數(shù)比較

從水稻分蘗期(四葉期)開始，分別在分蘗開始后10 d(分蘗前期)、20 d(分蘗盛期)、30 d(分蘗盛期)、40 d(分蘗后期)測定供試材料的分蘗數(shù)。由表1可知，CA648的分蘗數(shù)在分蘗期間均顯著多于ZH11，CA648的最終分蘗數(shù)可達20多個，而對照ZH11的分蘗數(shù)一般為10個左右。

表1 CA648與ZH11不同時期分蘗數(shù)比較Table1 Comparisons of tiller number in different periods between CA648 and ZH11

2.2 CA648和ZH11葉綠素相對含量比較

從水稻分蘗期(四葉期)開始，分別測定分蘗開始后10 d(分蘗前期)、20 d(分蘗盛期)、30 d(分蘗盛期)、40 d(分蘗后期)相同葉序上中上部位的葉片SPAD值。結(jié)果表明，隨著生長時間延長，CA648與ZH11的葉片SPAD值逐步增大，表明葉綠素相對含量均有所增加，對照ZH11的SPAD值在分蘗開始后 10 d(分蘗前期)、40 d(分蘗后期)均顯著高于 CA648(表 2)。

表2 CA648和ZH11葉綠素相對含量比較Table2 Comparisons of relative chlorophyll content in different periods between CA648 and ZH11

2.3 CA648和ZH11光合特性分析

表3表明，CA648在分蘗前期(10 d)，葉片的凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率均顯著低于同期的ZH11，而胞間CO2濃度卻顯著高于ZH11；分蘗盛期(20d)，CA648和ZH11植株光合生理指標差異不顯著；分蘗盛期(30d)，CA648和ZH11葉片的凈光合速率出現(xiàn)了顯著性差異，其中分蘗后期(40d)，ZH11的凈光合速率比CA648高4.1%，ZH11的氣孔導度、胞間CO2濃度和蒸騰速率都高于CA648。值得注意的是，分蘗中后期CA648分蘗數(shù)增加(表 1)。

表3 CA648與ZH11葉片光合作用及蒸騰作用比較Table3 Comparisons of photosynthesis and transpiration between CA648 and ZH11

2.4 CA648和ZH11葉片的還原糖、蔗糖含量比較

在分蘗盛期后，CA648的分蘗與ZH11存在最大差異(表1)， CA648葉片中的還原糖含量明顯比對照高；而莖桿中的還原糖含量兩者間差異不明顯(圖 1)。CA648葉片中的蔗糖含量低于對照，約為ZH11的77.5%；而莖桿中的蔗糖含量卻高于對照，比ZH11高 30.7%(圖1)。

圖1 CA648與ZH11的還原糖、蔗糖含量比較Fig.1 Comparisons of the content of reducing sugar and sucrose between CA648 and ZH11

2.5 CA648和ZH11過氧化物酶活力比較

圖2表明，進入分蘗期后CA648與ZH11葉片中過氧化物酶活性發(fā)生變化，CA648呈現(xiàn)出先升后降的趨勢。在7～14 d期間，CA648葉片中的過氧化物酶活力明顯高于ZH11，在分蘗期后14 d時，CA648過氧化物酶活力比ZH11高73.0%；14 d后活性開始下降，在21 d時其活性與ZH11無差異。ZH11葉片的酶活性變化在不同時期變化較小，變化趨勢是先下降、然后增加再緩慢下降，在28 d時活力最高(157.9 0.01ΔA·g-1·min-1)，在 28 d、35 d時葉片的過氧化物酶活力略高于CA648。

圖2可知CA648與ZH11莖桿中的過氧化物酶活性變化趨勢都是先上升后下降，且CA648莖桿中的過氧化物酶活力均高于ZH11，在14 d時，兩者差異達到了16.8%。

圖2 CA648和ZH11過氧化物酶的比活力比較Fig.2 Comparisons of peroxidase activity between CA648 and ZH11

3 討論

水稻株型對產(chǎn)量具有重要影響。水稻育種專家希望通過改良穗、葉、根等農(nóng)藝性狀來獲得“理想株型”，以盡可能提高群體的光能利用率和干物質(zhì)生產(chǎn)能力[13]。本研究的突變體CA648具有矮化、多分蘗特性，其表型在苗期與對照ZH11無差異，進入分蘗期后株高明顯低于野生型植株，而分蘗數(shù)目明顯多于野生型植株[8]。至成熟期時，CA648的不同單株均可形成20多個有效分蘗，而ZH11的有效分蘗數(shù)目一般為10個(表1)。

研究表明，引起植物葉片光合效率降低的主要因素包括氣孔部分關閉和葉肉細胞光合活性下降，前者使細胞間隙CO2濃度降低，后者則使其增高[14]。光合特性比較結(jié)果顯示，突變體CA648在分蘗初期氣孔導度顯著小于ZH11，且凈光合速率也低于ZH11，而胞間CO2濃度卻顯著高于ZH11。其原因除了與CA648葉綠素含量相對較低有關外，還可能與CA648的多分蘗特性有關。CA648比ZH11形成更多的分蘗，較多的分蘗可導致單位面積內(nèi)分蘗及葉片相互遮擋而影響光合特性。

過氧化物酶在植物生長發(fā)育中起著十分重要的作用，可以降解植物體內(nèi)IAA，而IAA可以促進細胞伸長，從而影響莖的生長，因此莖中過氧化物酶活性增高可能引起植株矮化[15]。CA648葉片中的過氧化物酶活力在分蘗前期與分蘗盛期均高于ZH11，而莖中的過氧化物酶活力在整個分蘗期均高于ZH11。過氧化物酶可降解IAA，而IAA/CTK比值是植物維持頂端優(yōu)勢的關鍵因素[16]。因此，CA648葉片及莖桿中較高的過氧化物酶活性可導致IAA含量發(fā)生改變，進而影響IAA/CTK比值，該結(jié)果與已報道的CA648、ZH11兩者間植物激素存在顯著差異的結(jié)果一致[8]，推測較高的過氧化物酶活力可能與CA648矮化多分蘗特性之間存在一定的相關性。

CA648和ZH11相關光合產(chǎn)物比較分析表明，在分蘗盛期CA648的葉片、莖桿中的還原糖、蔗糖含量均與ZH11存在差異。其原因可能是CA648需要分配更多的光合產(chǎn)物用于分蘗，也可能是光合效率降低導致光合產(chǎn)物減少而造成的結(jié)果，有待進一步研究。

[1] 虞國平.水稻在我國糧食安全中的戰(zhàn)略地位分析[J].新西部(理論版), 2009(11): 31—33.

[2] 文杜娟,陳風波.雜交水稻種植對社會經(jīng)濟的影響[J].作物研究, 2014(4): 402—405.

[3] 程式華.中國超級稻育種研究的創(chuàng)新與發(fā)展[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學學報, 2007(5): 647—651.

[4] 馮榮坤.超高產(chǎn)水稻育種中理想株型研究進展[J].河南農(nóng)業(yè)科學, 2006(7): 19—22.

[5] 唐茜,葉善蓉,單洪麗,羅學平.引進茶樹品種光合特性的比較研究[J].四川農(nóng)業(yè)大學學報, 2006,24(3): 303—308.

[6] 喬亮.水稻蔗糖合成酶基因家族的初步研究[D].濟南: 山東大學碩士學位論文, 2012.

[7] 黃雪方,金雅琴,李冬林.兩種石蒜生長發(fā)育期鱗莖可溶性糖、蛋白質(zhì)及POD活性的變化[J].亞熱帶植物科學, 2011(3):16—19.

[8] 劉清,童建華,史齊,彭克勤,王若仲,藺萬煌, Mohammed H K,沈革志,蕭浪濤.一個矮稈多分蘗水稻突變體的植物激素動態(tài)特性分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學, 2014(13): 2519—2528.

[9] 王惠群,肖浪濤,楊艷麗,童建華,康朵蘭.矮壯素對中薯 3號生理特性的影響研究[J].云南農(nóng)業(yè)大學學報, 2008,23(2):200—204.

[10] 郝再彬,蒼晶,徐仲.植物生理實驗[M].哈爾濱: 哈爾濱工業(yè)大學出版社, 2004.

[11] 張遲.抑制馬鈴薯Acid Invertase基因表達對塊莖淀粉—糖代謝的影響研究[D].武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學博士學位論文,2007.

[12] 張志良.植物生理實驗指導手冊[M].北京: 高等教育出版社, 2000.

[13] 陳庭木,王多明,方兆偉,秦德榮,樊繼偉,呂孝財,徐大勇.水稻超高產(chǎn)潛力鑒定重要農(nóng)藝性狀因子分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學, 2013(16): 7081—7085.

[14] 許大全.光合作用氣孔限制分析中的一些問題[J].植物生理學通訊, 1997,33(4): 241—244.

[15] Intapruk C, Yamamoto K, Sekine M Takano M, Shinmyo A.Regulatory sequences involved in the peroxidase gene expression in Arabidopsis thaliana[J].Plant Cell Reports, 1994,13: 123—129.

[16] 李春儉.植物激素在頂端優(yōu)勢中的作用[J].植物生理學通訊, 1995(6): 401—406.