楊鳳嬌，李紅英，盧存福，陳玉珍

（北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 林木育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 林木花卉遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

玉米自交系（AS-9）耐鹽突變體的遺傳變異分析

楊鳳嬌，李紅英，盧存福，陳玉珍

（北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 林木育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室 林木花卉遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

以玉米基礎(chǔ)自交系（AS-9）及其化學(xué)誘變自交系M4為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行耐鹽性鑒定，同時(shí)利用44對(duì)可能與根系性狀有關(guān)聯(lián)的SSR引物進(jìn)行遺傳變異分析。結(jié)果表明，誘變M4幼苗經(jīng)200和250 mmol·L-1NaCl鹽脅迫處理7 d后，IV400、IV1600根數(shù)比AS-9對(duì)照分別增加23.1%、19.1%，誘變IV1600初生根1、2、3根長(zhǎng)分別為對(duì)照的1.33、1.70、2.15倍；同時(shí)在M4玉米試材中擴(kuò)增出多態(tài)性條帶的引物25對(duì)，占引物總數(shù)的56.82%；誘變自交系M4與AS-9的遺傳相似系數(shù)平均值為0.6563，遺傳相似系數(shù)中心化后，數(shù)據(jù)在-0.04處可把材料分為三個(gè)類群，基礎(chǔ)材料AS-9為Ⅰ類，M4代IV1400、IV1600、IV2000聚為Ⅲ類，其余誘變系為Ⅱ類。此外，6對(duì)引物的SSR-PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列差異檢測(cè)，結(jié)果產(chǎn)生新的基元和基元重復(fù)次數(shù)變化，說(shuō)明系列化學(xué)誘變已使玉米自交系A(chǔ)S-9產(chǎn)生了顯著的遺傳變異。

玉米；自交系；化學(xué)誘變；SSR標(biāo)記；遺傳變異

目前，人工誘變被廣泛運(yùn)用到植物育種工作中，主要包括離子束、X射線、γ射線等物理誘變方法，疊氮化物、烷化劑等化學(xué)誘變方法以及T-DNA、轉(zhuǎn)座子等生物誘變方法［1—2］?；瘜W(xué)誘變突變率高，突變位點(diǎn)具一定的特異性，出現(xiàn)的分子水平變化較多，不會(huì)引起染色體畸變或損傷，且致死率低、價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)單［2—3］。目前，通過(guò)化學(xué)誘變方法獲得了多種植物如水稻、玉米、黃瓜、花生等的多種突變體［4—6］。

DNA分子標(biāo)記可以直接反映核苷酸序列上的差異，檢測(cè)結(jié)果精確。分子標(biāo)記技術(shù)如RFLP、RAPD、AFLP、SSR等已用于各種實(shí)驗(yàn)材料的遺傳變異研究。SSR分子標(biāo)記具有染色體上分布均勻、共顯性、多態(tài)性較為豐富、分辨率高且不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、目標(biāo)性狀基因定位、遺傳圖譜構(gòu)建及種子純度分析等研究［7—10］。研究產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆性等數(shù)量性狀對(duì)農(nóng)作物遺傳改良具有重要意義，隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展，把數(shù)量性狀的復(fù)雜遺傳剖析推向新的高度［11—12］。關(guān)聯(lián)分析將標(biāo)記（或候選基因）的遺傳變異與目標(biāo)的表型性狀聯(lián)系起來(lái)［13—14］，目前在小麥［12］、玉米［15］、水稻［16—17］等植物中應(yīng)用較廣泛。

本研究以數(shù)據(jù)庫(kù)資源豐富的基因組測(cè)序植物玉米的基礎(chǔ)自交系 AS-9及化學(xué)誘變系 M4為實(shí)驗(yàn)材料，檢驗(yàn)幼苗經(jīng)鹽脅迫后的生物學(xué)效應(yīng)，并以與根系性狀可能有關(guān)聯(lián)的SSR 標(biāo)記研究各誘變系與基礎(chǔ)材料間的遺傳差異，以此驗(yàn)證化學(xué)誘變對(duì)實(shí)驗(yàn)材料遺傳變異的影響，為合理利用化學(xué)誘變創(chuàng)造新的種質(zhì)資源提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

以玉米自交系A(chǔ)S-9為基礎(chǔ)自交系，經(jīng)系列化學(xué)誘變后獲得自交第4代（M4）誘變系，分別為IV200、IV400、IV800、IV1200、IV1400、IV1600、IV2000。自交系A(chǔ)S-9與誘變系同時(shí)種植至第4代命名為IVCK。用于SSR分子標(biāo)記的實(shí)驗(yàn)材料取自玉米自交系IVCK和誘變系M4各株系未作任何鹽脅迫處理正常生長(zhǎng)的幼苗。

1.2發(fā)芽實(shí)驗(yàn)

上述實(shí)驗(yàn)材料種子在75%酒精溶液中消毒5 min，次氯酸鈉溶液（2.5%有效氯）消毒3 min，無(wú)菌水清洗3～5次，培養(yǎng)皿中發(fā)芽。每培養(yǎng)皿50粒，重復(fù)3次，于25 ℃進(jìn)行暗發(fā)芽。幼苗生長(zhǎng)30 d后，采用200 mmol·L-1和250 mmol·L-1NaCl各處理7 d，進(jìn)行芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)及根數(shù)等形態(tài)學(xué)指標(biāo)檢測(cè)。

1.3SSR標(biāo)記引物篩選及PCR體系擴(kuò)增

1.3.1引物篩選根據(jù)玉米數(shù)據(jù)庫(kù)MaizeGDB公布的引物序列及已有文獻(xiàn)資料［18—20］，合成可能與根系發(fā)育有關(guān)的引物44對(duì)，篩選出擴(kuò)增穩(wěn)定、條帶清晰、重復(fù)性高、多態(tài)性好的25對(duì)引物用于實(shí)驗(yàn)，目標(biāo)引物占總合成引物數(shù)的56.82%。

1.3.2基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增采用李紅英等［21］的方法提取基因組DNA。PCR擴(kuò)增體系（20 μL）：F-primer與R-primer各0.5 μL（10 μmol·L-1），dNTP 0.4 μL（2.5 mmol·L-1），Taq酶0.2 μL（2.5 U·μL-1），DNA 6 μL （15 ng·μL-1），ddH2O 10.4 μL，Buffer（10×） 2 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，28個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，并于4 ℃保存。

1.4擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)

6%變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，對(duì)3次電泳完全一致的條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.5數(shù)據(jù)分析

采用Excel和SPSS19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用NTSYSpc 2.10e軟件計(jì)算SSR遺傳相似系數(shù)（Dice）；應(yīng)用SAHN程序中的UPGMA方式構(gòu)建樹狀圖，完成聚類分析［21］。利用Popgene1.32 計(jì)算Simpson多樣性指數(shù)（也稱位點(diǎn)多態(tài)信息量PIC）以及Shannon-weaver多樣性指數(shù)（也稱基因型多樣性H）［21—22］。

2　結(jié)果與分析

2.1化學(xué)誘變對(duì)M4代種子生物學(xué)效應(yīng)的影響誘變自交系 M4代幼苗生長(zhǎng)30 d后，采用200、250 mmol·L-1NaCl各處理 7 d，誘變自交系 M4代IV400、IV1600根數(shù)增加23.1%、19.1%，誘變自交系IV1600初生根（最早長(zhǎng)出的根）根長(zhǎng)1、根長(zhǎng)2、根長(zhǎng)3分別為對(duì)照的1.33、1.70、2.15倍；大部分誘變系M4代的芽長(zhǎng)降低，只有IV400與對(duì)照差異不顯著。鹽脅迫后，誘變M4代多數(shù)芽長(zhǎng)降低而根數(shù)增加，說(shuō)明化學(xué)誘變改變了玉米誘變系的生根能力，根長(zhǎng)增加及根數(shù)增多為提高其抗逆能力奠定了基礎(chǔ)（表1，圖1）。

表1　鹽脅迫對(duì)誘變玉米自交系 M4代幼苗生長(zhǎng)的影響Table 1　Effects of salt stress on seedling growth of M4 maize

圖1　化學(xué)誘變后代玉米自交系幼苗抗鹽性的變化Fig. 1　The seedling salt resistance results of untreated maize line AS-9 and M4 generation of mutagenic line generated from AS-9 treated with mutagens

2.2化學(xué)誘變后代的遺傳變異分析

2.2.1誘變后代SSR標(biāo)記分析采用44對(duì)可能與根系發(fā)育有關(guān)的SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出擴(kuò)增穩(wěn)定、條帶清晰、重復(fù)性高、多態(tài)性好的引物。根據(jù)篩選出的25 對(duì)SSR引物對(duì)基礎(chǔ)材料（IVCK）和7個(gè)誘變玉米自交系擴(kuò)增條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，共擴(kuò)增得到69個(gè)等位基因，其中，多態(tài)性條帶總數(shù)為50個(gè)，多態(tài)性百分率達(dá) 72.46%，單個(gè)引物擴(kuò)增帶變幅 1～2個(gè)。位點(diǎn)的多態(tài)信息量（PIC）和基因型多樣性（H）變化范圍分別為0.1103～0.3750和0.2338～0.6931，平均值分別為0.3062和0.5697 （表2）。結(jié)果表明，基礎(chǔ)自交系A(chǔ)S-9與其誘變自交系之間存在較高的遺傳差異。

2.2.2SSR標(biāo)記遺傳相似性分析利用25個(gè)可能與根系相關(guān)的多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（表3），所有實(shí)驗(yàn)材料間的遺傳相似系數(shù)在0.5797～0.8841之間。其中，7個(gè)誘變系間的遺傳相似系數(shù)為0.5942～0.8841；各誘變系與AS-9遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.5797～0.7101，表明誘變 M4代與AS-9的遺傳相似性較低。誘變系IV1400、IV2000與AS-9遺傳相似性最低，為0.5797，可見IV1400、IV2000誘變效果明顯；誘變系IV400、IV1200盡管與AS-9的相似性最高，可遺傳相似系數(shù)僅為0.7101，充分說(shuō)明采用系列化學(xué)誘變獲得的M4代已發(fā)生較為明顯的遺傳變異。

表2　25對(duì)引物在8個(gè)自交系中檢測(cè)到的遺傳變異信息Table 2　Genetic variation information for 25 loci detected in 8 maize inbred lines

表3　玉米自交系A(chǔ)S-9及誘變 M4代遺傳相似系數(shù)Table 3　Genetic similarity coefficient of maize inbred lines AS-9 and mutagenesis M4 generation

2.2.3SSR標(biāo)記的聚類分析聚類分析顯示（圖2），遺傳相似系數(shù)進(jìn)行中心化后，數(shù)據(jù)在-0.04處，可將自交系玉米材料分為三個(gè)類群，基礎(chǔ)自交系IVCK為Ⅰ類；誘變系IV800和IV1200的聚類完全重疊在一起，與IV200、IV400為Ⅱ類；誘變M4代IV1400、IV1600、IV2000聚為Ⅲ類。利用可能與根系相關(guān)的標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，誘變M4與AS-9之間發(fā)生了顯著的遺傳變異，SSR標(biāo)記的聚類分析結(jié)果與遺傳相似性分析結(jié)果基本一致。

圖2　玉米自交系A(chǔ)S-9及誘變自交系M4代進(jìn)行聚類分析結(jié)果Fig. 2　A UPGMA dendrogram ofmaize inbred lines AS-9 andmutagenesis M4 generationbased on 25 SSR markers

2.2.4不同誘變系部分引物 SSR-PCR產(chǎn)物序列變化選取具有擴(kuò)增多態(tài)性，清晰穩(wěn)定性好的部分引物進(jìn)行測(cè)序，其中 6對(duì)引物 bnlg339、umc1064、umc2365、phi10412、bnlg391、umc1993可能與根系的發(fā)生及數(shù)目關(guān)聯(lián)度較高（表4）。

將SSR-PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與NCBI和MaizeGDB數(shù)據(jù)庫(kù)的序列進(jìn)行比對(duì)（表4），結(jié)果顯示，不同玉米自交系的短片段序列重復(fù)兩端是高度保守的，由于實(shí)驗(yàn)采用的基礎(chǔ)自交系A(chǔ)S-9與數(shù)據(jù)庫(kù)的玉米自交系不同，因此SSR-PCR產(chǎn)物基元類型和重復(fù)次數(shù)表現(xiàn)不同。6對(duì)引物均使基礎(chǔ)自交系和誘變系的基元重復(fù)次數(shù)發(fā)生了一定的變化，其中標(biāo)記引物bnlg339、umc1064、phi10412、bnlg391發(fā)生了基元重復(fù)次數(shù)的變化，而umc2365、umc1993不但發(fā)生了基元重復(fù)的變化，同時(shí)出現(xiàn)了新的重復(fù)基元。此外，從擴(kuò)增片段大小的差異來(lái)看，umc2365、phi10412、umc1993三對(duì)引物檢測(cè)出基礎(chǔ)自交系和誘變系發(fā)生非常顯著的遺傳變異，其中誘變系IV800、IV1200、IV1400、IV1600、IV2000與基礎(chǔ)自交系的遺傳差異最為明顯，這與前述的聚類分析結(jié)果一致。

表4　6對(duì)SSR引物擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果Table 4　The sequencing results of amplified fragment based on 6 SSR markers

圖3　樣品在凝膠圖譜中的位置Fig. 3　The positions of the samples in the gel maps

3　討論

化學(xué)誘變育種具有經(jīng)濟(jì)方便、加快遺傳基因重組、提高突變頻率、擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)材料的突變譜等優(yōu)點(diǎn)，能夠較快地創(chuàng)造有利用價(jià)值的突變體。SSR共顯性標(biāo)記能直接在分子水平上反映實(shí)驗(yàn)材料的遺傳與變異，且不受環(huán)境影響［10，23］，因此被廣泛應(yīng)用于遺傳變異研究。

對(duì)實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行表型性狀差異分析是鑒定各種誘變產(chǎn)生遺傳變異的有效方法［24］。實(shí)驗(yàn)表明，化學(xué)誘變系M4種子的發(fā)芽率、芽長(zhǎng)和根數(shù)普遍高于對(duì)照［21］；幼苗經(jīng)200、250 mmol·L-1NaCl鹽脅迫各處理7 d后，誘變系 M4中 Ⅳ400、Ⅳ1600根數(shù)比AS-9增加23.1%、19.1%，誘變系Ⅳ1600初生根1、2、3根長(zhǎng)分別為對(duì)照1.33、1.70、2.15倍（圖1，表1）?？梢娬T變處理顯著提高了誘變后代實(shí)驗(yàn)材料的種子活力、發(fā)芽率，根數(shù)和芽長(zhǎng)明顯增加，同時(shí)鹽處理后根部性狀差異較大，誘變系生物學(xué)性狀的變化為增強(qiáng)其抗逆能力奠定了基礎(chǔ)。

利用各種誘變方法處理玉米自交系后，均產(chǎn)生了不同程度的遺傳變異。李奇等［23］利用60Co-γ處理玉米自交系（R08、48-2）種子，選育101份M3株系，與對(duì)照平均遺傳相似系數(shù)為0.8194～0.8373；喬曉等［22］將玉米自交系（K305、K169、698-3）進(jìn)行航天育種實(shí)驗(yàn)，獲得的118個(gè)誘變后代與各自對(duì)照遺傳相似系數(shù)平均值為 0.6894～0.7924；覃鴻妮等［4］利用 52對(duì)SSR引物進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)大部分誘變系與對(duì)照的玉米自交系“082”平均遺傳相似系數(shù)為0.823，表示化學(xué)誘變前后遺傳距離較近；Kostova等［25］利用SSR分子標(biāo)記分析化學(xué)誘變玉米的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)化學(xué)誘變使開花時(shí)間、產(chǎn)量、顆粒類型、蛋白含量等表型性狀及非生物脅迫耐受性等發(fā)生了變化，誘變使遺傳多樣性水平從原始自交系材料的0.608增加到0.651。本實(shí)驗(yàn)玉米化學(xué)誘變自交系 M4與AS-9遺傳相似系數(shù)變化范圍為0.5797～0.7101，平均值為0.6563（表2），同時(shí)位點(diǎn)的多態(tài)信息量（PIC）、基因型多樣性（H）（表2）、聚類分析（圖2）以及SSR-PCR產(chǎn)物序列測(cè)序結(jié)果（表4）均表明，本實(shí)驗(yàn)系列化學(xué)誘變獲得的誘變系純合度較高，且在分子水平上發(fā)生了較大程度的變異。

Tuberosa等［18］研究Lo964 × Lol0l6的F3家系在水培條件下玉米根系相關(guān)性狀的QTL，同時(shí)還研究了水分脅迫條件下該家系產(chǎn)量性狀的QTL，進(jìn)而分析根系相關(guān)性狀對(duì)產(chǎn)量的影響。張微［19］采用845對(duì)SSR引物對(duì)親本綜3和87-1進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，利用覆蓋玉米全基因組的分析標(biāo)記連鎖圖，進(jìn)行玉米苗期根系性狀的QTL定位，發(fā)現(xiàn)研究中所定位的QTL與其他群體所定位根系相關(guān)的QTL具有相同或相似的染色體區(qū)間，同時(shí)闡明了控制玉米根系的QTL與控制水稻根系的QTL存在廣泛同源性關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)化學(xué)誘變系在鹽脅迫下根部性狀與基礎(chǔ)自交系差異顯著。采用篩選出的25對(duì)與根系性狀可能相關(guān)的引物對(duì)化學(xué)誘變系M4進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，誘變系發(fā)生了顯著的遺傳變異。但由于數(shù)量性狀在遺傳上非常復(fù)雜，性狀與基因組之間的關(guān)系受多種因素調(diào)控，同時(shí)基因與基因、基因與環(huán)境之間還存在明顯的互作關(guān)系，其表達(dá)還受遺傳背景的影響［11，26—27］，因此化學(xué)誘變與根部相關(guān)性狀之間的關(guān)聯(lián)還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Genetic Variation Analysis of Salt-tolerant Mutant from Maize Inbred Lines （AS-9）

YANG Feng-jiao， LI Hong-ying， LU Cun-fu， CHEN Yu-zhen
（National Engineering Laboratory for Tree Breeding， Key Laboratory of Genetics and Breeding in Forest Trees and Ornamental Plants， Ministry of Education， College of Biological Sciences and Biotechnology， Beijing Forestry University， Beijing 100083， China）

Chemical mutation was an effective way of creating new germplasm resources. To analyze the impact of chemical mutagenesis on AS-9 maize inbred offspring， the salt tolerance and genetic variation between mutant M4 and the corresponding original material （AS-9） were evaluated by using 44 pairs of SSR markers that may be associated with root traits. Seed germination， bud length and root number of M4 were higher than that of AS-9. After treatment with 200 and 250 mmol·L-1NaCl for 7 days， root numbers of IV400 and IV1600 seedlings were higher than that of AS-9， with increases of 23.1% and 19.1%， respectively. IV1600 primary root lengths of 1， 2， 3 were 1.33， 1.70，and 2.15 times longer than that of AS-9， respectively. Twenty five pairs of SSR primers gave profiles amplified in sample of M4 mutants， accounting for 56.82% of the total pairs of primers. The average value of genetic similarity coefficient between IVCK and M4 was 0.6563. With the centered genetic similarity coefficient of -0.04 by UPGMA， the maize inbred line materials were divided into three groups： the original material （IVCK）， the M4 mutants including IV1400， IV1600， IV2000， and other M4 mutants （IV200， IV400， IV800， IV1200）. Principal component analysis and clustering results were similar. In addition， SSR-PCR products amplified by six pairs of primers were sequenced， the results showed that there was distinct variation between AS-9 and the induced M4， indicating chemical mutagenesis made maize inbred AS-9 produce a wide range of genetic variation.

maize； inbred lines； chemical mutagenesis； SSR markers； genetic variation

10.3969/j.issn.1009-7791.2015.01.001

S513

A

1009-7791（2015）01-0001-07

2014-12-24

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAI13B06）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31270737） ；北京市自然科學(xué)基金（6112016）

楊鳳嬌，碩士研究生，從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail： yfj0704029@163.com

注：楊鳳嬌與李紅英為同等貢獻(xiàn)作者；陳玉珍為通訊作者。E-mail： chenyuzhen@bjfu.edu.cn