謝欣　易韋　于燕妮　陳祎　張著學(xué)　楊迎春　文安智　褚明亮

IMP3、IGF2在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系☆

謝欣*易韋*于燕妮△陳祎*張著學(xué)*楊迎春*文安智*褚明亮*

目的探討胰島素樣生長因子IImRNA結(jié)合蛋白3（insulin-like growth factor-II mRNA-binding protein 3，IMP3）及胰島素樣生長因子-2（Insulin-like growth factor-2，IGF2）在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及對臨床預(yù)后的影響。方法 采用免疫組化S-P法檢測171例腦膠質(zhì)瘤組織及20例非瘤腦組織中IMP3、IGF2及Ki-67的表達(dá)情況；分析IMP3、IGF2及Ki-67表達(dá)強(qiáng)度間的相關(guān)性；Kaplan-Meier生存分析及多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析膠質(zhì)瘤患者生存狀況的影響因素。結(jié)果 非瘤腦組織、膠質(zhì)瘤組織中IMP3、IGF2和Ki-67的表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。且膠質(zhì)瘤組織中IMP3、IGF2蛋白及Ki-67表達(dá)均隨腫瘤病理級別升高而增高（P均＜0.05）。Spearman相關(guān)分析顯示，IMP3、IGF2與Ki-67表達(dá)水平皆呈正相關(guān)，且IMP3蛋白的表達(dá)與IGF2蛋白的表達(dá)水平呈正相關(guān)（P均＜0.05）。Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示IMP3、IGF2的表達(dá)與臨床預(yù)后密切相關(guān)（P＜0.05）。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析示，腫瘤病理分級、IMP3、IGF2及Ki-67均為膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P均＜0.05）。結(jié)論 IMP3和IGF2蛋白的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的組織病理分級、腫瘤細(xì)胞增殖及患者臨床預(yù)后密切相關(guān)，針對二者的靶點(diǎn)治療有望成為膠質(zhì)瘤的有效治療方案。

人腦膠質(zhì)瘤 免疫組化 IGF2 IMP3 Ki-67

腦膠質(zhì)瘤約占全部顱內(nèi)腫瘤40%～50%［1］。成人發(fā)病率約為3/10萬～6/10萬，僅有5%的患者生存時(shí)間超過5年［2］。因其早期就已呈浸潤性生長并向周圍腦組織侵襲，手術(shù)難以完全切除，故術(shù)后多與放、化療相結(jié)合，但治療效果仍不樂觀。胰島素樣生長因子IImRNA結(jié)合蛋白3（insulin-like growth factor-II mRNA-binding protein 3，IMP3）是癌胚mRNA結(jié)合蛋白，為VICKZ家族［3］成員，其在胚胎早期組織中高度表達(dá)，但于成人正常組織中表達(dá)極低。胰島素樣生長因子2（Insulin-like growth factor-2，IGF2）是一種胚胎生長因子，在胚胎時(shí)期高表達(dá)，出生后隨即降低甚至消失［4］。在腫瘤發(fā)展中，IMP3是IGF-IImRNA的翻譯激活子，通過上調(diào)IGF-IImRNA的翻譯進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖［5］。研究表明，IGF2為IMP3的作用靶點(diǎn)，其在膠質(zhì)瘤發(fā)展中其轉(zhuǎn)錄水平無明顯改變，僅在翻譯水平上有所提高［6］。Ki-67與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，是目前公認(rèn)的可準(zhǔn)確反映腫瘤細(xì)胞增殖活性狀態(tài)的腫瘤增殖標(biāo)志物之一［7］。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化檢測膠質(zhì)瘤組織中IMP3、IGF2蛋白及Ki-67的表達(dá)，探討IMP3和IGF2蛋白的表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理分級、腫瘤細(xì)胞增殖及患者臨床預(yù)后的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1一般資料 收集2008年1月至2013年12月貴州省人民醫(yī)院病理科膠質(zhì)瘤石蠟組織標(biāo)本171例，其中男105例，女66例。年齡6～75歲，中位年齡48歲。患者術(shù)前均未行放、化療。按2007年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級標(biāo)準(zhǔn)，分為低級別組（I-II級）77例，高級別組（III-IV級）94例。另取因腦血管畸形手術(shù)切除中的非瘤腦組織（白質(zhì)）20例作為對照組。聯(lián)系貴州省人民醫(yī)院腦外科收集2012年至2013年臨床膠質(zhì)瘤患者65例臨床資料進(jìn)行隨訪，入組標(biāo)準(zhǔn)：膠質(zhì)瘤初發(fā)病例，診斷明確，臨床資料完整；手術(shù)鏡下全切除；術(shù)后未行化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：確診膠質(zhì)瘤，同時(shí)患有其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾??；膠質(zhì)瘤組織石蠟標(biāo)本過小的病例。隨訪內(nèi)容包括：一般情況，臨床癥狀，術(shù)后是否接受放療、化療，是否復(fù)發(fā)及復(fù)發(fā)后是否繼續(xù)治療。本實(shí)驗(yàn)獲醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2免疫組化方法 采用S-P二步法檢測低級別組、高級別組及對照組中IMP3、IGF2蛋白及Ki-67的表達(dá)情況，主要試劑：兔抗人IMP3多克隆抗體（工作濃度1:100）、兔抗人IGF2多克隆抗體（工作濃度1:100）、兔抗人Ki-67單克隆抗體（工作濃度1: 100）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。以PBS代替一抗作為陰性對照，試劑公司提供陽性對照。

1.3結(jié)果判斷 IMP3蛋白和IGF2蛋白陽性信號(hào)均定位在腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，為棕黃色顆粒。根據(jù)著色強(qiáng)度及陽性百分比進(jìn)行評分［8］：無色為0分，淡黃色（弱陽性）為1分，棕黃色（中等強(qiáng)度）為2分，棕褐色（強(qiáng)陽性）為3分；陽性細(xì)胞≤10%為1分，＞10%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分。兩者相乘為免疫組化半定量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：0～2分為陰性（-），3～4分為弱陽性（+），5～6分為中等陽性（++），＞6分為強(qiáng)陽性（+++），根據(jù)結(jié)果＜4分為低表達(dá)，≥4分為高表達(dá)。Ki-67陽性著色定位于細(xì)胞核，著色棕黃色。以陽性細(xì)胞數(shù)≤5%為低增殖活性，＞5%為高增值活性。

1.4隨訪方法 采用電話聯(lián)系方式進(jìn)行隨訪，截止時(shí)間2015年5月?？偵嫫谟?jì)算從患者第一次手術(shù)時(shí)間開始到隨訪截止日期或患者死亡的日期為止。共獲訪65例，隨訪截止共有54例患者死亡，11例生存，無失訪病例。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0處理數(shù)據(jù)，差異性分析采用χ2檢驗(yàn)，關(guān)聯(lián)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析，采用Kaplan-Meier生存分析及多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析生存情況的影響因素，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1IMP3、IGF2及Ki-67在膠質(zhì)瘤組織和非瘤腦組織中的表達(dá)情況 IMP3、IGF2、Ki-67在20例非瘤腦組織中均有少量表達(dá)，三者在171例膠質(zhì)瘤組織中陽性表達(dá)均明顯高于非瘤腦組織中的陽性表達(dá)（χ2=5.326，χ2=7.425，χ2=5.326，P均＜0.05）。

2.2IMP3、IGF2蛋白及Ki-67在低級別組和高級別組膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況 膠質(zhì)瘤組織中IMP3、IGF2蛋白及Ki-67表達(dá)均隨腫瘤病理級別升高而增高（rs=0.522，rs=0.301，rs=0.538，P均＜0.05），在低級別和高級別組中的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.93，χ2=4.395，χ2=16.19，P均＜0.05，見表1）。

表1　各組IMP3、IGF2及K i-67的表達(dá)情況

圖1　免疫組化染色檢測IMP3、IGF2和Ki-67在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)（×400）。A：IMP3在非瘤腦組織中陰性表達(dá)；B：IGF2在非瘤腦組織中陰性表達(dá)；C：Ki-67在非瘤腦組織中陰性表達(dá)；D：IMP3在低級別膠質(zhì)瘤中弱表達(dá)；E：IGF2在低級別膠質(zhì)瘤中弱表達(dá)；F：Ki-67在低級別膠質(zhì)瘤中的低表達(dá)；G：IMP3在高級別膠質(zhì)瘤中高表達(dá)；H：IGF2在高級別膠質(zhì)瘤中高表達(dá)；I：Ki-67在高級別膠質(zhì)瘤中高表達(dá)

2.3IMP3、IGF2及Ki-67表達(dá)強(qiáng)度間的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析顯示，IMP3、IGF2與Ki-67表達(dá)水平皆呈正相關(guān)（rs=0.310，rs=0.228，P均＜0.05），且IMP3蛋白表達(dá)與IGF2蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)（rs=0.203，P＜0.05）。

2.4IMP3和IGF2表達(dá)對患者生存期的影響Kaplan-Meier生存分析顯示，65例隨訪患者中，IMP3、IGF2高表達(dá)的患者總生存時(shí)間均顯著低于低表達(dá)患者（Log-rank=10.088，Log-rank=9.958，P均＜0.01，圖2A，圖2B）。且兩者共同高表達(dá)的患者生存時(shí)間最短，較兩者同時(shí)低表達(dá)者生存時(shí)間顯著縮短（Log-rank=17.542，P＜0.001），較兩者單獨(dú)高表達(dá)差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-rank=5.987，Log-rank=5.731，P均＜0.05，圖2C）。

2.5Cox比例風(fēng)險(xiǎn)逐步回歸分析影響膠質(zhì)瘤預(yù)后的危險(xiǎn)因素運(yùn)用多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析影響膠質(zhì)瘤預(yù)后的危險(xiǎn)因素顯示，膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后與年齡和性別無關(guān)，與腫瘤病理分級、IMP3、 IGF2及Ki-67均有關(guān)（P均＜0.05，見表2，表3）。

3　討論

IGF2基因?yàn)閮?nèi)源性印記基因，其表達(dá)、調(diào)控不遵循孟德爾定律，正常情況下多為母源印記［9］，即為父源等位基因表達(dá)。其基因的印跡丟失（Loss of impringting，LOI）已經(jīng)在肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，在IGF2轉(zhuǎn)基因的小鼠中，這些腫瘤發(fā)生率是明顯增高的［10］。本研究結(jié)果顯示，IGF2蛋白在膠質(zhì)瘤組織中陽性表達(dá)較高，明顯高于在非瘤腦組織中的表達(dá)，且低級別組、高級別組中表達(dá)差異明顯（χ2=4.395，P＜0.05），與此同時(shí)，Spearman相關(guān)性分析也顯示，IGF2蛋白陽性程度與膠質(zhì)瘤級別呈明顯正相關(guān)（rs= 0.301，P＜0.05），這與王文斐等［11］的研究結(jié)果相一致，進(jìn)一步提示IGF2蛋白的表達(dá)隨腫瘤惡性程度的增高而增高，與膠質(zhì)瘤的病理級別及腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，充分說明了IGF2對膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮一定的作用。

圖2　膠質(zhì)瘤組織中IMP3和IGF2蛋白表達(dá)與患者生存時(shí)間關(guān)系A(chǔ)：IMP3高表達(dá)患者生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)患者；B：IGF2高表達(dá)患者生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)患者；C：IMP3與IGF2共同高表達(dá)的患者生存時(shí)間明顯低于其他各組

表2　Cox回歸自變量賦值情況

表3　Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型結(jié)果

IMP3基因編碼產(chǎn)物可通過結(jié)合目的信使RNA如ACTB（β-Actin），IGF-2，MYC等調(diào)控RNA的轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后控制［12］。目前已有研究者在肺癌，宮頸鱗狀細(xì)胞癌，肝細(xì)胞癌［13-15］等腫瘤組織中檢測出IMP3的高表達(dá)。本研究亦顯示，IMP3蛋白在膠質(zhì)瘤組織呈高表達(dá)，明顯高于非瘤腦組織中的陽性表達(dá)（χ2=5.326，P＜0.05），在低級別組與高級別組中的表達(dá)有顯著差異（χ2=18.93，P＜0.001），提示IMP3在膠質(zhì)瘤惡性增殖過程中起著重要作用，與膠質(zhì)瘤的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)，惡性程度越高其表達(dá)越強(qiáng)。據(jù)此認(rèn)為，在膠質(zhì)瘤的臨床病理中，IMP3蛋白的檢測有助于其臨床輔助診斷。作IMP3與IGF2相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，兩者呈明顯正相關(guān)，這在Suvasini等［6］研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步佐證IMP2激活I(lǐng)GF2mRNA的機(jī)制。

Ki-67是一種核增殖抗原，本研究擬引用Ki-67作為腫瘤核增殖情況的判斷指標(biāo)。結(jié)果顯示Ki-67的表達(dá)很好的反應(yīng)了膠質(zhì)瘤的增殖狀態(tài)，其與膠質(zhì)瘤惡性程度呈明顯著正相關(guān)（rs=0.538，P＜0.01），這與江曉珍等［16］研究結(jié)果相一致。同時(shí)，Spearman相關(guān)分析顯示，IMP3、IGF2分別與Ki-67的表達(dá)水平呈明顯正相關(guān)（rs=0.310，rs=0.228，P均＜0.05），從而推測IMP3及IGF2蛋白的表達(dá)在腫瘤細(xì)胞核增殖中發(fā)揮重要作用。

膠質(zhì)瘤術(shù)后易復(fù)發(fā)，預(yù)后不甚滿意。隨著對膠質(zhì)瘤發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究，小分子靶向藥物治療也逐漸被推上醫(yī)療前線。目前在GBM（glioblastoma）的臨床靶向治療領(lǐng)域中，貝伐株單抗被列為較為重要的藥物應(yīng)用于復(fù)發(fā)患者，特別是于病程較晚階段使用，雖不能提高患者總體生存期，但可延長患者無進(jìn)展生存期3～4月［17］，對患者預(yù)后有一定影響。本研究Kaplan-Meier生存分析顯示，IMP3及IGF2蛋白高表達(dá)的患者總生存時(shí)間均明顯低于低表達(dá)的患者（Log-rank=10.088，Log-rank=9.958，P均＜0.01）。聯(lián)合IMP3和IGF2檢測發(fā)現(xiàn)，二者同時(shí)呈高表達(dá)的患者生存時(shí)間最短，較兩者單獨(dú)低表達(dá)者有明顯差異（P均＜0.05）。進(jìn)一步作多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析結(jié)果顯示IMP3、IGF2均為膠質(zhì)瘤預(yù)后的獨(dú)立影響因素（P均＜0.05）。這些均充分說明IMP3和IGF2蛋白表達(dá)對膠質(zhì)瘤患者預(yù)后有顯著影響。同時(shí)本研究結(jié)果還顯示，腫瘤病理級別和Ki-67的表達(dá)亦為膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素，這與文獻(xiàn)報(bào)道相符［16］。

綜上所述，IMP3和IGF2蛋白與膠質(zhì)瘤的病理分級、腫瘤細(xì)胞增殖及預(yù)后關(guān)系密切，二者聯(lián)合檢測可能成為膠質(zhì)瘤生物標(biāo)記的新指標(biāo)，可能成為膠質(zhì)瘤基因治療的潛在靶點(diǎn)，為臨床制定更為合理和有效的治療方案提供依據(jù)。

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Expressions of IM P3 and IGF2 in human brain glioma and their relationships w ith the prognosis.

XIE Xin，YI Wei，YU Yanni，CHEN Yi，ZHANG Zhuxue，YANG Yingchun，WEN Anzhi，CHU Mingliang.Department of Pathology，People's Hospital of Guizhou Province，Guiyang 550002，China.Tel：0851-85923917.

Objective To investigate the expression of IMP3 and IGF2 and their influence on the prognosis of human brain glioma.M ethods Expression of IMP3，IGF2 and Ki-67 protein was examined using S-P immunohistochemsitry in 171 cases of gliomas and 20 cases of normal brain tissues.Kaplan-Meier and multivariate analysis of Variance were used to analysis the survival rate of patients with gliomas.Results Positive Expression levels of IMP3，IGF2 and Ki-67 in glioma tissue were significantly higher than those in normal brain tissue（both P＜0.05）.The expression levels of IMP3，IGF2 and Ki-67 were positively correlated with the pathologic stage（P＜0.05）.Meanwhile，there was a significantly positive correlation between IMP3 and IGF2（rs=0.203，P＜0.05）.Further analysis of the results showed that both IMP3 and IGF2 positive expression levels were significantly associated with decreased overall survival（both P＜0.05）.Moreover，the expression of IMP3 and IGF2-positivity was a poor prognostic indicator for overall survival.Histological grading and expression of IMP3，IGF2 and Ki-67 were the independent risk factors of prognosis of gliomas（both P＜0.05）.Conclu-sion:IMP3 and IGF2 contribute to the progression of gliomas and influence the prognosis of patients with gliomas and the detection of IMP3 and IGF2 may be helpful to evaluate the course of disease and prognosis.They might be possible novel targets for molecular treatment of gliomas.

Glioma Immunohistochemistry IMP3 IGF2 Ki-67

R739.41

A

2015-06-18）

（責(zé)任編輯:甘章平）

10.3969/j.issn.1002-0152.2015.12.002

☆ 貴州省科技廳項(xiàng)目（編號(hào)：黔科合字LH［2014］7017號(hào)）資助

*貴州省人民醫(yī)院病理科（貴陽 550002）

△貴州醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室