周廣彪 許如蘇 魏霜 段建發(fā) 陳文婉

（汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局 廣東汕頭 515031）

利用鎖核酸探針技術(shù)快速檢測(cè)肉制品中豬源性成分

周廣彪 許如蘇 魏霜 段建發(fā) 陳文婉

（汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局 廣東汕頭 515031）

［目的］建立快速檢測(cè)肉制品中豬源性成分的鎖核酸探針熒光PCR檢測(cè)方法。［方法］基于豬線粒體基因組的保守序列，設(shè)計(jì)特異性引物和鎖核酸探針，建立快速檢測(cè)肉制品中豬源性成分的鎖核酸熒光PCR檢測(cè)方法。通過(guò)特異性、靈敏度、重復(fù)性測(cè)試及應(yīng)用檢測(cè)對(duì)建立的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。［結(jié)果］建立的鎖核酸熒光PCR方法對(duì)牛、羊、馬、雞、鴨、鵝均無(wú)非特異性擴(kuò)增；該法可檢測(cè)低至1.20 pg的豬肉DNA，重復(fù)檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)均小于1%。應(yīng)用該法檢測(cè)市售肉制品50份，32份標(biāo)示含有豬肉成分樣本的檢測(cè)結(jié)果均與預(yù)期相符，另發(fā)現(xiàn)1份羊肉丸為豬肉制備、2份雞肉火腿腸中摻有豬源性成分而未標(biāo)示。［結(jié)論］本研究建立的方法具有特異、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，適用于大規(guī)?？焖贆z測(cè)肉制品中豬源性成分。

豬源性成分；鎖核酸探針；肉制品

1 前言

隨著一些以豬肉假冒牛羊肉、鼠肉假冒豬肉等不法事件的曝光，人們對(duì)此類食品安全問(wèn)題的關(guān)注也大為增加，食品中豬源性成分檢測(cè)的意義也逐漸為人知曉。雖然有環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）等新型應(yīng)用檢測(cè)技術(shù)，但縱觀現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR技術(shù)或普通PCR技術(shù)仍是豬源性成分檢測(cè)的主流［1-5］，其中熒光PCR技術(shù)因?yàn)椴僮鞅憬?、無(wú)需接觸EB等DNA顯色類毒性物質(zhì)，應(yīng)用越來(lái)越廣泛。

瑣核酸（Locked Nucleic Acid，LNA）是一種近幾年發(fā)展起來(lái)的核酸化學(xué)修飾技術(shù)（第三代反義寡聚核苷酸），即通過(guò)一個(gè)亞甲基橋?qū)⒑颂堑?'氧原子和4'碳原子連接起來(lái)，形成鎖狀結(jié)構(gòu)。相比較被廣泛使用的Taqman探針，LNA探針具有較好的熱穩(wěn)定性和雜交的特異性，可避免普通DNA探針設(shè)計(jì)缺陷而無(wú)法解決的特殊序列問(wèn)題，在病原檢測(cè)［6-9］、基因突變檢測(cè)［10，11］等方面已有成功應(yīng)用的例子，但未見(jiàn)在動(dòng)物源性成分檢測(cè)領(lǐng)域的研究報(bào)道。本研究旨在利用LNA熒光探針的上述優(yōu)點(diǎn)，建立肉制品中豬源性成分的Taqman-LNA熒光PCR檢測(cè)方法，為動(dòng)物源性成分的檢測(cè)提供新的技術(shù)手段。

2 材料與方法

2.1材料

2.1.1實(shí)驗(yàn)材料

測(cè)試樣本均購(gòu)自汕頭本地超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。取牛、羊、馬、雞、鴨、鵝鮮肉樣本進(jìn)行特異性檢測(cè)；取肉腸、肉松、肉丸等肉制品50份進(jìn)行應(yīng)用檢測(cè)；以屠宰場(chǎng)現(xiàn)殺豬肉為豬源性成分檢測(cè)的陽(yáng)性樣本。

2.1.2主要試劑

核酸提取試劑盒：達(dá)安基因，DA-Z146；2×PCR Master Mix：Takara，RR390A；Real Time PCR Porcine DNA Detection Kit（豬源性成分檢測(cè)試劑盒）：Takara，RR912；無(wú)水乙醇：分析純，廣州化學(xué)試劑廠。2.1.3主要儀器和設(shè)備

LightCycler?480型熒光定量PCR儀：Roche；高速離心機(jī)：Beckman；恒溫干熱器：Eppendorf。

2.2方法

2.2.1樣品制備和DNA提取

取樣品25-30 g，參照文獻(xiàn)［12］制成1∶4（M/V）肉漿。吸取50μL中層懸濁液，使用核酸提取試劑盒進(jìn)行DNA提取。

2.2.2Taqman-LNA熒光PCR擴(kuò)增檢測(cè)

2.2.2.1引物和探針

從GenBank上查找并下載家豬線粒體基因組全序列（Sus scrofa domesticus mitochondrion，complete genome），再獲取近五年的各地及各類豬線粒體DNA全序列120份，使用ClustalX軟件進(jìn)行序列比對(duì)。再依據(jù)篩選出長(zhǎng)度超過(guò)80 bp的保守序列，使用Primer Express軟件設(shè)計(jì)引物探針。設(shè)計(jì)出的引物和探針在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行同源性比對(duì)，從理論上測(cè)試和驗(yàn)證序列的種屬特異性并據(jù)此調(diào)整引物和探針的設(shè)計(jì)。

確定的上游引物為5'-CAGCAACCGTATTCACAGGAT-3'，下游引物為5'-GGCTACTG GTTGAATAAATAGGC-3'，LNA探針5'-FAM-TT TCTACCACAA+GGAACACCCGCC-BHQ1-3'，引物和探針均由上海輝睿生物科技公司合成。

2.2.2.2最適引物和探針濃度的篩選

根據(jù)反應(yīng)體系酶的特性、熒光PCR儀的特點(diǎn)和引物Tm值設(shè)定的預(yù)反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性1 min；95℃5 s，60℃25 s（熒光采集FAM通道），共循環(huán)40次。設(shè)置PCR總體系20 μL，使用確證樣本DNA模版1 μL，測(cè)試引物濃度（0.4-1.2 μmol/L）、探針濃度（0.1-0.8 μmol/L）的兩兩配對(duì)反應(yīng)，根據(jù)Ct值的大小、擴(kuò)增曲線的形狀和熒光增量大小確定最適引物和探針濃度。

2.2.2.3退火溫度的優(yōu)化

使用陽(yáng)性樣本DNA，以1℃為變化范圍測(cè)試52℃-67℃區(qū)間的退火溫度對(duì)Taqman-LNA熒光PCR擴(kuò)增的影響。根據(jù)Ct值的大小、擴(kuò)增曲線的形狀和熒光增量大小確定最佳退火溫度。

2.2.2.4特異性試驗(yàn)

以馬、牛、羊、雞、鴨、鵝的DNA為模板，進(jìn)行Taqman-LNA熒光PCR試驗(yàn)以驗(yàn)證方法的特異性。

2.2.2.5靈敏度和重復(fù)性測(cè)試

將陽(yáng)性樣本DNA做10×系列稀釋，制備相對(duì)含量分別為100%、10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%及0.0001%的7個(gè)梯度測(cè)試樣本，各重復(fù)檢測(cè)3次，考察方法的靈敏度，并計(jì)算不同濃度DNA檢測(cè)Ct值的變異系數(shù)CV：CV=標(biāo)準(zhǔn)差（SD）/Ct的平均值（X）。

2.2.2.6應(yīng)用檢測(cè)

按2.2.1提取50份市售肉制品的DNA，采用本方法進(jìn)行豬源性成分檢測(cè)，并用前述商品化Taqman熒光PCR試劑盒（Takara，RR912）進(jìn)行驗(yàn)證比對(duì)。

3 結(jié)果

3.1引物和探針濃度的優(yōu)選

引物和探針的兩兩配對(duì)結(jié)果顯示，當(dāng)上、下游引物終濃度為1.0 μmol/L、探針終濃度為0.3 μmol/L時(shí)，擴(kuò)增效率高，Ct值較小，且可獲得典型的倒S形擴(kuò)增曲線。故將此引物和探針濃度設(shè)為Taqman-LNA熒光PCR檢測(cè)方法的最佳組合。

3.2退火溫度的優(yōu)選

結(jié)果表明，當(dāng)退火溫度在57℃-61℃之間時(shí)，Ct值和擴(kuò)增曲線的熒光增量差異不明顯，但以59℃時(shí)的Ct值、熒光增量及倒S形曲線為最佳。63℃以上和55℃以下的Ct值明顯增大或擴(kuò)增曲線形狀欠佳。

3.3Taqman-LNA熒光PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的確定

根據(jù)3.1和3.2的試驗(yàn)結(jié)果，確定Taqman-LNA熒光PCR的反應(yīng)體系為：2×PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）1.0μL，探針（10 μmol/L）0.3 μL，DNA模板1 μL，補(bǔ)水至20 μL；反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃1 min；95℃5 s，59℃25 s（收集FAM熒光信號(hào)），40個(gè)循環(huán)。

3.4特異性試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果只有豬肉的陽(yáng)性樣本出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，而牛、羊、馬、雞、鴨、鵝均無(wú)擴(kuò)增曲線，詳見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，本研究所設(shè)計(jì)的引物和探針具有很好的特異性。

圖1　特異性試驗(yàn)擴(kuò)增曲線

3.5靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)中各梯度測(cè)試樣本的模板DNA量分別為120ng、12ng、1.2ng、0.12ng、0.012ng、1.2pg和0.12pg，相當(dāng)于豬肉含量為100%、10%、1%、0.1%、0.01%、 0.001%和0.0001%。反應(yīng)的擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，本方法可檢測(cè)到豬肉DNA最低含量為1.2 pg，相當(dāng)豬肉含量為0.001%（以陽(yáng)性樣本DNA做10×系列稀釋為計(jì)）。

圖2　豬肉DNA 10倍系列稀釋的Taqman-LNA熒光PCR擴(kuò)增曲線

3.6重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

將上述靈敏度測(cè)試所得的3次重復(fù)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算不同濃度檢測(cè)Ct值的變異系數(shù)如表1。從表1中可見(jiàn)，當(dāng)豬肉DNA含量在1.2 pg及其以上時(shí)，重復(fù)檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)均小于1%，表明該方法具有較好的穩(wěn)定性。

表1　重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3.7應(yīng)用檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用該法檢測(cè)本市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和超市銷售的肉丸、肉腸、肉松等肉制品50份，其中32份標(biāo)示含有豬肉成分樣本的檢測(cè)結(jié)果均與預(yù)期相符，在1份羊肉丸中未檢測(cè)到羊源性成分但有豬源性成分，2份雞肉火腿腸中摻有豬源性成分而未標(biāo)示。所有檢測(cè)結(jié)果均與商品化Taqman熒光PCR檢測(cè)試劑盒（Takara，RR912）的驗(yàn)證結(jié)果相一致。

4 討論

4.1目的基因的選擇

在動(dòng)物源性成分檢測(cè)領(lǐng)域，核基因組DNA和線粒體DNA均有較多的檢測(cè)應(yīng)用［13-17］。相對(duì)而言，線粒體基因具有拷貝數(shù)高、不易降解破壞等優(yōu)點(diǎn)，更適用于加工肉制品的檢測(cè)。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《明膠中牛、羊、豬源性成分的定性檢測(cè)方法-實(shí)時(shí)熒光PCR法》（GB/T 25165-2010）檢測(cè)的是豬核基因組朊蛋白基因，本研究用該標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)市售生鮮豬肉的Ct值為25左右，擴(kuò)增效率明顯偏低，在檢測(cè)一些豬肉含量較低的肉腸和肉丸樣本時(shí)，很難區(qū)分弱陽(yáng)性結(jié)果和假陽(yáng)性結(jié)果。所以，本研究以線粒體基因?yàn)榘行蛄?，匯總GeneBank上百余種豬線粒體DNA全序列，借助序列比對(duì)和引物設(shè)計(jì)軟件篩選出引物和探針序列，特異性擴(kuò)增豬線粒體DNA保守序列，進(jìn)行肉制品中豬源性成分的檢測(cè)。

4.2制樣方式及DNA提取初始量的選擇

本方法取樣品25-30 g與水按照1∶4（M/V）制備勻漿，再取50 μL中層懸濁液進(jìn)行DNA提取，相當(dāng)于DNA提取的初始量為10 mg。因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，使用常規(guī)的制樣設(shè)備很難直接將某些肉制品（如牛筋丸）徹底破碎，這給后續(xù)的DNA提取帶來(lái)較大偏差，而加水后勻漿可容易制備相對(duì)均一的懸濁液。使用50 μL制樣（相當(dāng)10 mg）進(jìn)行DNA提取，是因?yàn)榻⒌腡aqman-LNA熒光PCR擴(kuò)增效率較高，使用較少的樣本量便可穩(wěn)定重現(xiàn)測(cè)試結(jié)果，也可降低檢測(cè)過(guò)程中發(fā)生污染的可能性。

4.3應(yīng)用檢測(cè)情況

本研究共檢測(cè)市售肉制品50份，陽(yáng)性結(jié)果的ct值大約在21-23之間，略高于新鮮豬肉的ct值結(jié)果（ct值＜20）。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)1份羊肉丸實(shí)為豬肉丸，另有2份雞肉火腿腸含有豬源性成分而未標(biāo)識(shí)，其余的陽(yáng)性結(jié)果均與標(biāo)識(shí)成分相符。該檢測(cè)情況也與多位學(xué)者的報(bào)道一致，一方面部分肉制品中添加了較多的其他成分，豬肉含量較低；另一方面加工處理又破壞了部分DNA的完整性，某些配料或添加劑也可能會(huì)影響DNA的提取或抑制PCR反應(yīng)，這些應(yīng)該是導(dǎo)致上述檢測(cè)差別的主要原因。所有檢測(cè)結(jié)果均與商品化Taqman熒光PCR檢測(cè)試劑盒（Takara，RR912）的驗(yàn)證結(jié)果一致，但Taqman-LNA熒光PCR法的試劑成本卻不足市售試劑盒的六分之一（8元/反應(yīng)vs.50元/反應(yīng)），具有明顯的價(jià)格優(yōu)勢(shì)，更適用于大規(guī)模的檢測(cè)應(yīng)用。

5 結(jié)論

建立的Taqman-LNA熒光PCR方法具有很好的特異性；方法的靈敏度高，可檢測(cè)0.001%的豬源性成分；重復(fù)性檢測(cè)和應(yīng)用檢測(cè)效果良好；成本低，適用于大規(guī)模檢測(cè)應(yīng)用。

［1］SN/T 3730.8-2013食品及飼料中常見(jiàn)畜類品種的鑒定方法第八部分：豬成分檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法［S］.

［2］GB/T 25165-2010明膠中牛、羊、豬源性成分的定性檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法［S］.

［3］SN/T 2051-2008食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測(cè)方法實(shí)時(shí)PCR法［S］.

［4］GB/T 21101-2007動(dòng)物源性飼料中豬源性成分定性檢測(cè)方法PCR方法［S］.

［5］GB/T 21103-2007動(dòng)物源性飼料中哺乳動(dòng)物源性成分定性檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR方法［S］.

［6］郭安，劉志文，修賀明，等.基于通用探針庫(kù)的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)快速檢測(cè)陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶中的細(xì)菌病原體［J］.生物技術(shù)世界，2014，11：1-3.

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［10］曾勇彬.建立等位基因特異性鎖核酸實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HBV YIDD耐藥突變及其臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)［D］.福建醫(yī)科大學(xué)，2014.

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Development of a LNA-qPCR Method for Rapid Detecting Pig-Derived Ingredients in Meat and Products

Zhou Guangbiao，Xu Rusu，Wei Shuang，Duan Jianfa，Chen Wenwan
（Shantou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shantou，Guangdong，515031）

［Objective］To develop a LNA-qPCR method for rapid detection of pig-derived ingredients in meat and products.［Method］A LNA-qPCR method was developed for rapid detection of pig-derived ingredients in meat and products，using the pig-specific primers and locked nucleic acid probe designed for the conservative domain gene of pig mtDNA，and evaluated by sensibility，specificity，reproducibility and Practicability.［Results］The method had no cross-reaction with the ingredients derived from beef，mutton，horse，chicken，duck and goose.It could detect pig DNA as little as 1.20 pg and it was repeatable that the coefficients of variation were both less than 1%.The pig-derived ingredients were found in 32 meat products when detecting 50 meat products，which were in line with expectations.Also found 1 mutton pills was made of pork and 2 chicken ham sausage had pig-derived ingredients without any pigmeat in identification.［Conclusion］The LNA-qPCR established method was specific，sensitive，repeatable and accurate，and it was fit for large detecting pig-derived ingredients in meat and products rapidly.

Pig-Derived Ingredients；Locked Nucleic Acid Probe；Meat and Products

TS207.3

E-mail：stjszxjy@st.gdciq.gov.cn

廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014GDK24）

2015-04-20