馬利云 龔國利 王娜

（陜西科技大學生命科學與工程學院，西安 710021）

纖維堆囊菌SoF5-76產(chǎn)埃博霉素B分批發(fā)酵動力學研究

馬利云 龔國利 王娜

（陜西科技大學生命科學與工程學院，西安 710021）

埃博霉素發(fā)酵生產(chǎn)體系復雜，且生產(chǎn)菌株較難操作，導致發(fā)酵參數(shù)測定困難，迄今為止未見關于埃博霉素發(fā)酵動力學方面的報道。利用5 L發(fā)酵罐，對纖維堆囊菌（Sorangium cellulosum）產(chǎn)埃博霉素B（Epothilone B）的分批發(fā)酵動力學進行了研究，整個發(fā)酵過程中維持溫度30℃、pH7.4。發(fā)酵結束時，菌體干重達3.00 g/L，埃博霉素B產(chǎn)量達18.20 mg/L，葡萄糖含量為0.049 g/L?；贚ogistic方程和Luedking-Piret方程，利用MATLAB軟件對其進行非線性擬合，構建了菌體生長、埃博霉素B合成和葡萄糖消耗的動力學模型。結果表明，該組模型能較好的擬合發(fā)酵過程。

纖維堆囊菌；埃博霉素B；分批發(fā)酵；動力學模型；MATLAB；非線性擬合

埃博霉素（Epothilones）是微生物粘細菌產(chǎn)生的一類次級代謝產(chǎn)物［1］，其殺死腫瘤機制與紫杉醇相似，能夠在癌癥晚期抑制紡錘體和紡錘絲的形成，從而抑制有絲分裂，阻止癌細胞增殖，具有廣譜的抗癌療效。埃博霉素化學結構簡單，易于進行修飾，來源不受限制，可以通過大規(guī)模的工業(yè)發(fā)酵進行制備等，其有望成為繼紫杉醇之后更為有效的抗腫瘤藥物，具有廣闊的市場前景，因此受到學術界和企業(yè)界的密切關注。目前已有一個埃博霉素藥物（BMS-247550，Ixabepilone）用于卵巢癌的治療，且注射劑已上市，另外其它埃博霉素藥物（ABJ-879，Patupilone、BMS-310705、KOS-862、KOS-1584和ZK-EPO等）正在進行臨床研究［2，3］，但埃博霉素發(fā)酵產(chǎn)量較低及成本較高，極大地限制了該類抗腫瘤藥的開發(fā)應用，因此如何提高生產(chǎn)菌株的產(chǎn)埃博霉素能力仍是目前該藥物研發(fā)的一大熱點。發(fā)酵動力學是研究菌體生長速率、基質消耗速率、產(chǎn)物生成速率的相互關系，并用一定形式的數(shù)學模型將發(fā)酵過程中的有關因素進行定量描述，對進一步確定發(fā)酵過程中最佳發(fā)酵工藝條件和設計合理的發(fā)酵過程有極大幫助［4］。由于埃博霉素發(fā)酵生產(chǎn)體系復雜且難以控制，發(fā)酵動力學研究比較困難。目前國內外有關埃博霉素發(fā)酵生產(chǎn)的研究報道大都是基于搖瓶試驗的結果［5-10］，只有少量文獻在發(fā)酵罐水平進行描述［11，12］，未見發(fā)酵動力學的研究報告。本試驗是基于實驗室所保藏的纖維堆囊菌以葡萄糖為底物，進行5 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素B的動力學研究，分別建立菌體生長、底物消耗、產(chǎn)物生成的動力學模型，采用MATLAB軟件對其進行非線性擬合，旨在得到相對應的動力學參數(shù)估計值，為后續(xù)補料分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵動力學研究奠定良好基礎，對利用中小試數(shù)據(jù)進行大型發(fā)酵工藝設計提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 本實驗室所保存的菌纖維堆囊菌SoF5-76（Sorangium cellulosum SoF5-76）。來源：由本實驗室從土壤中篩選，經(jīng)基因組重組技術選育獲得，埃博霉素B搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量為35.24 mg/L［5-7］。

1.1.2 培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯淀粉3.9，脫脂奶粉2.2，豆餅粉1.5，MgSO4·7H2O 2.5，CaCl21.3，葡萄糖1，EDTA-Fe3+3 mL/L，微量元素液0.5 mL/L，pH7.4，115℃滅菌30 min。

M26種子培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯淀粉8，豆蛋白胨2，葡萄糖2，酵母粉2，MgSO41，CaCl21，EDTA-Fe3+1 mL/L，pH7.2，115℃滅菌30 min。

斜面保藏培養(yǎng)基（g/L）：KNO30.5，Na2HPO40.25，MgSO4·7H2O 1，EDTA-Fe3+1 mL/L，微量元素液 1 mL/L，瓊脂2%，pH7.2，121℃滅菌30 min。

1.1.3 試驗儀器 BIOF-6000B發(fā)酵罐：上海高機生物工程有限公司制造；Waters-2487-2420-1535高效液相色譜儀，美國waters公司；Hitachi himac CR21G高速冷凍離心機（日本，日立）。大孔吸附樹脂XAD-16，Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1.2.1.1 種子培養(yǎng) 將保藏的纖維堆囊菌SoF5-76接入放有已滅菌濾紙片的CNST平板上，30℃恒溫培養(yǎng)5-7 d，之后按一定的接種量轉接到M26培養(yǎng)基中，裝液量為50 mL/250 mL，恒溫搖床（170 r/min），30℃培養(yǎng)72 h，獲得發(fā)酵種子液。

1.2.1.2 發(fā)酵培養(yǎng) 以8%（V/V）接種量將所得種子液接種到5 L發(fā)酵罐中，裝液量為60%。發(fā)酵條件為：溫度30℃、pH7.4、攪拌轉速200 r/min、通氣量1.0 vvm，罐壓控制在0.01 MPa。培養(yǎng)7 d，每隔1 d取樣，分別測定菌體干重、還原糖濃度和埃博霉素B產(chǎn)量。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 發(fā)酵過程中參數(shù)的測定 生物量的測定：采用菌體干重法［13］。還原糖的測定：用 3，5-二硝基水楊酸（DNS）法［14］。

埃博霉素B提取及含量測定：將獲得的樣品進行離心，收集樹脂，經(jīng)10倍體積甲醇浸提、濃縮后，采用HPLC對其含量進行定量分析。高效液相色譜條件［15］：C18色譜柱（YWG，10 μm，250×4.6 mm），柱溫30℃；紫外檢測波長為249 nm；流動相為甲醇∶水（含0.2%乙酸）=65∶35；上樣體積為20 μL；時間為30 min；流速為1 mL/min。埃博霉素B的定量采用本實驗室通用標準曲線。方程為：y=0.132x+0.0035（y：埃博霉素B的產(chǎn)量（mg/L），x：峰面積）。利用HPLC檢測埃博霉素B得到峰面積，根據(jù)上述標準曲線換算出埃博霉素B的產(chǎn)量。

1.2.2.2 數(shù)據(jù)的處理 利用MATLAB軟件對實際測得的纖維堆囊菌SoF5-76分批發(fā)酵實驗數(shù)據(jù)進行擬合，求得模型相關參數(shù)，建立動力學模型。再通過Origin8.0軟件將所得模型定義為擬合函數(shù)，采用的算法是修正的高斯-牛頓法（Levenberg-Marquardt），以誤差平方和最小為目標，可以獲得模型參數(shù)初估值，然后要不斷對其進行修正直到獲得最優(yōu)值。

2 結果

2.1 埃博霉素B發(fā)酵過程的代謝變化

圖1顯示，0-2 d菌體干重有所增加，但增長緩慢，可能是種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基時，需要適應新的環(huán)境，需經(jīng)歷短暫的遲滯期。3-4 d菌體干重迅速增長，菌體進入對數(shù)生長期。第5天菌體干重基本維持不變，進入穩(wěn)定期。埃博霉素B的大量產(chǎn)生主要集中在發(fā)酵第4-5天。其產(chǎn)量高峰出現(xiàn)和結束比細胞進入對數(shù)生長期和穩(wěn)定期的時間分別推遲1 d。

分析還原糖的變化曲線可知，0-2 d還原糖濃度略有降低，發(fā)酵前期與菌體生長相適應，第2天開始還原糖消耗明顯加快，第3-4天進入快速耗糖期，從第5天至發(fā)酵結束還原糖濃度降低緩慢；從埃博霉素B生成曲線得知，其生成與還原糖消耗基本相對應。0-2 d只產(chǎn)生極少的埃博霉素B，第2天后產(chǎn)生速度有所加快，從第3天開始到第5天進入埃博霉素B快速產(chǎn)生期，第5天后埃博霉素B的產(chǎn)生速度開始減慢，直到發(fā)酵結束埃博霉素B產(chǎn)量維持不變；通過分析菌體生長與產(chǎn)物合成的變化曲線，埃博霉素B進入快速產(chǎn)生期滯后于菌體進入對數(shù)生長期，當菌體處于穩(wěn)定期時，埃博霉素B產(chǎn)量仍處于快速生產(chǎn)期。因此得出：纖維堆囊菌SoF5-76產(chǎn)埃博霉素B發(fā)酵屬于產(chǎn)物形與菌體生長部分偶聯(lián)。

圖1 發(fā)酵罐發(fā)酵過程曲線

2.2 發(fā)酵動力學模型的建立及求解

2.2.1 細胞生長動力學 微生物菌體生長動力學模型采用Logistic［16］方程：

其中，μm為最大比生長速率（h-1）；Xm為菌體生長上限（g/L），X為菌體濃度（g/L）。

Logistic模型是微生物發(fā)酵過程中普遍存在的一個典型S型曲線，能很好地反映分批發(fā)酵過程中因菌體濃度的增加對自身生長存在的抑制作用［16-17］。發(fā)酵初始，菌體濃度很低，菌體濃度（X）遠遠沒有達到菌體生長上限（Xm），因此X/Xm項可忽略，此時模型表示菌體呈對數(shù)生長；菌體在對數(shù)期結束后進入穩(wěn)定生長期，此時菌體濃度（X）近似于最大菌體濃度（Xm），表示菌體生長停止。

在初始條件t=0時，有X=X0，對式（1）求微分方程，得：

利用MATLAB軟件對實際測得的纖維堆囊菌SoF5-76菌體干重數(shù)值進行擬合并通過參數(shù)修正，求解得出：X0=0.051 g/L；μm=1.547 h-1；Xm=2.945 g/L。分別將X0、μm和Xm的值代入（2）式，得到菌株SoF5-76生長動力學模型為：

將試驗所測數(shù)據(jù)與式（3）的擬合曲線相比較，結果（圖2）顯示，該菌體的生長擬合模型與實測值擬合情況比較理想，能較好地反應菌體SoF5-76的生長情況，在95%的置信區(qū)間內，模型的F檢驗的相關系數(shù)R2=0.997，說明該模型可以解釋99.7%試驗所得菌體干重的變化，表明模型擬合良好，試驗結果和預測值之間具有較好的一致性。這說明該方程可作為菌株SoF5-76的細胞生長動力學模型。

圖2 細胞生長的擬合曲線與實驗測得值比較圖

2.2.2 產(chǎn)物生成動力學模型 根據(jù)分批發(fā)酵產(chǎn)物生成和菌體細胞生長之間的關系，Garden將產(chǎn)物形成分成3類：產(chǎn)物生成與生長相關、部分相關和不相關。因此，將產(chǎn)物生成動力學模型分為3種類型［18］：（I）生長相耦聯(lián)型，只有在菌體生長的情況下才有產(chǎn)物形成；（II）部分耦聯(lián)型，菌體生長時有一些產(chǎn)物生成，部分或大部分產(chǎn)物是在穩(wěn)定期形成的，此階段菌體生長處于停止期；（III）非生長偶聯(lián)型，產(chǎn)物形成與菌體是否生長沒有關系。根據(jù)上述纖維堆囊菌SoF5-76發(fā)酵過程曲線推斷出菌株SoF5-76為部分偶聯(lián)型，Luedeking-Piret方程可以對其產(chǎn)物形成動力學模型進行描述：

其中，α是與菌體生長有關的產(chǎn)物形成比例常數(shù)，β為與菌體濃度有關的產(chǎn)物形成比例系數(shù)（h-1）；αdx/dt表示與菌體生長率相關的產(chǎn)物形成率；βx是與非伴隨菌體生長的產(chǎn)物形成率，p為產(chǎn)物濃度（g/L）。

將式（1）代入式（4）得：

在初始條件t=0時，埃博霉素B濃度P=0。對式（5）積分得：

其中，P為產(chǎn)物埃博霉素B濃度（g/L）；μm為最大比生長速率（h-1）；X0為菌體初始濃度（g/L）；Xm為菌體生長上限（g/L）；α和β為常數(shù)。

利用MATLAB軟件對實際測得的產(chǎn)物埃博霉素B產(chǎn)量數(shù)值進行擬合并通過參數(shù)修正，求得α=3.232，β=0.803；分別將α、β、X0、μm和 Xm的值代入模型方程，經(jīng)整理得到埃博霉素B生成動力學模型為：

將式（7）的埃博霉素B生成擬合曲線與實驗測得值相比較，結果（圖3）顯示，該產(chǎn)物擬合模型與實測值擬合情況比較理想，能夠較好地反應埃博霉素B的生成情況。在95%的置信區(qū)間內，模型經(jīng)F檢驗，相關系數(shù)為R2=0.964，即模型在96.4%的概率水平上是非常顯著的。這說明該方程可作為SoF5-76的埃博霉素B的生成動力學模型公式。

圖3 埃博霉素B生成擬合曲線與實驗測得值的比較

2.2.3 底物消耗動力學模型 在發(fā)酵過程中，底物消耗主要有3個方面：細胞生長的消耗，合成新的細胞；細胞維持基本生命活動的消耗；合成代謝產(chǎn)物的消耗。因此底物消耗動力學可用如下模型描述：

式中，yx/s是碳源用于菌體生長的得率常數(shù)；yp/s是碳源用于產(chǎn)物積累的得率常數(shù)；mx是微生物碳源的維持常數(shù)，s為底物濃度（g/L）。

用于產(chǎn)生能量供細胞維持生命活動所消耗的底物很少，為建模簡化起見，可以將其忽略。埃博霉素B分批發(fā)酵過程中底物的消耗就分為細胞生長和埃博霉素B生成兩部分。因此底物消耗動力學模型用（9）式表述：

將式（4）代入式（8），整理后得

在初始條件t=0時，S=S0。求解式（12）的微分方程，可得：

其中，S為底物濃度（g/L）；S0為底物初始濃度（g/L）；μm為最大比生長速率（h-1）；X0為菌體初始濃度（g/L）；Xm為菌體生長上限（g/L）；利用MATLAB軟件對實際測得的產(chǎn)物埃博霉素B產(chǎn)量數(shù)值進行擬合并通過參數(shù)修正，求得：k1=0.063 8；k2=0.013；分別將k1、k2、μm、X0和Xm的值代入式（12），經(jīng)整理得到菌株SoF5-76的埃博霉素B生成動力學模型為：

將底物消耗擬合曲線與實驗所測值相比較，結果（圖4）顯示，底物消耗擬合模型曲線與實驗數(shù)據(jù)擬合情況比較理想，能夠較好地反映分批發(fā)酵過程中底物（葡萄糖）消耗的情況。模型在95%的置信區(qū)間內，經(jīng)F檢驗后顯著性很高，R2=0.995，即模型在99.5%的概率水平上是非常顯著的。表明方程擬合較好，實驗結果與預測值之間具有較好的一致性。這說明該模型可作為SoF5-76的底物消耗動力學模型公式。

圖4 底物消耗擬合曲線與實驗測得值的比較

2.3 模型的驗證

在與上述相同發(fā)酵條件下，重復進行分批發(fā)酵實驗，通過實驗值與計算值相比較結果（表1）顯示，菌體干重、埃博霉素B產(chǎn)量和葡萄糖消耗模型計算值與實測值的平均相對誤差分別為2.36%、5.89%和 5.24%，能夠較好地反映實際的發(fā)酵過程。

表1 分批發(fā)酵動力學模型誤差檢驗

3 討論

根據(jù)實驗室保藏的纖維堆囊菌SoF5-76在5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵生成埃博霉素B的實驗數(shù)據(jù)，構建了動力學模型，埃博霉素B發(fā)酵除個別數(shù)據(jù)點外，大部分數(shù)據(jù)都能很好地擬合（計算值與實驗值之間的相對誤差低于10%），因此該模型能較好地描述纖維堆囊菌SoF5-76發(fā)酵過程規(guī)律。但實驗中存在一些問題和不足有待解決：其一，初始菌體數(shù)量較少，產(chǎn)量較低，并且菌體與樹脂很難充分分離，致使測量上有一定的誤差，計算模型平均誤差時可以忽略；其二，數(shù)據(jù)測定存在誤差，如在攪拌過程中，剪切力及樹脂之間的相互碰撞對其物理結構和性能產(chǎn)生較大的影響，導致樹脂的利用率大大降低［11］；其三，樹脂對發(fā)酵液中其他物質的非特異性吸附，導致其對埃博霉素B的吸附量減少，使得計算值與實驗值之間存在偏差；其四，粘細菌特殊的多細胞行為，在發(fā)酵液中成團生長［19］，且在發(fā)酵罐中發(fā)酵時，菌體在發(fā)酵罐內壁粘附，并逐漸向上蔓延，貼壁菌體無法回到發(fā)酵液中，極大地影響了菌體的生長［20］；此外，在發(fā)酵即將結束階段，由底物消耗方程得到的最終底物濃度較實測值低，使得實際發(fā)酵時間比模型預測發(fā)酵時間有所延長。這些問題極大地限制了埃博霉素B的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。龔國利等［21］曾在搖瓶試驗中將多孔陶瓷應用于固定化纖維堆囊菌發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素B，使埃博霉素B的產(chǎn)量與未采用多孔陶瓷相比提高了近4倍。于是我們提出以下假設：在發(fā)酵罐中采用固定化技術，使菌體附著于固體表面生長，代謝產(chǎn)物則在發(fā)酵液中，這不僅可以解決菌體在發(fā)酵罐內壁粘附，而且可以替代樹脂在發(fā)酵過程中吸附率下降等問題。

4 結論

本研究以Logistic、Luedeking-Piret等方程為基礎，建立了埃博霉素B發(fā)酵過程中菌體生長模型、產(chǎn)物生成模型和底物糖消耗模型，并利用MATLAB軟件進行非線性擬合。結果表明，各模型擬合的相關系數(shù)R2分別為0.997、0.964和0995，均接近1，說明擬合結果良好，并通過實驗進一步進行模型驗證，相對誤差都較小。所構建模型一定程度上能較好反映纖維堆囊菌分批發(fā)酵埃博霉素B過程規(guī)律，可以為工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模化應用提供理論依據(jù)。

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（責任編輯 馬鑫）

Kinetics of Batch Fermentation of Epothilone B by Sorangium cellulosum SoF5-76

Ma Liyun Gong Guoli Wang Na
（College of Life Science and Engineering，Shaanxi University of Science & Technology，Xi’an 710021）

The fermentation system produced epothilone is complex， and the production strain is more difficult to operate， leading to difficulties in fermentation parameters measured， so far there is no reporting on Epothilone fermentation kinetics. In this paper， the batch fermentation kinetics of the epothilone B produced by Sorangium cellulosum SoF5-76 was studied in a 5 L fermentor. During the process， the temperature and pH were almost constant， 30℃， 7.4. When the fermentation finished， the dry cell weight， epothilone B production and residual glycerol could reach 3.00 g/L， 18.20 mg/L and 0.049 g/L. On the bases of Logistic and Luedking-Piret equation， the models of cell growth，epothilone B production and substrate consumption were established， and the non-line fitting was employed to model the kinetics of fermentation by software MATLAB. The results show that the kinetic models were in good agreement with the fermentation process.

Sorangium cellulosum；epothilone B；batch fermentation；kinetic models；MATLAB；non-line fitting

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.030

2014-06-23

國家自然科學基金項目（20906058），陜西科技大學學術骨干培育項目（XSG2010009）

馬利云，男，碩士，研究方向：微生物制藥；E-mail：mayun919585594@163.com

龔國利，男，博士，教授，研究方向：工業(yè)微生物發(fā)酵工程技術；E-mail：gongguoli@sust.edu.cn