劉莉李岳亭張萌萌楊予濤徐志卿

（1.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，北京 100069；2.嘉興出入境檢驗檢疫局，嘉興 314001）

人Pokemon蛋白鋅指結構域的表達與純化

劉莉1李岳亭1張萌萌2楊予濤1徐志卿1

（1.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，北京 100069；2.嘉興出入境檢驗檢疫局，嘉興 314001）

旨在原核表達Pokemon基因的鋅指結構域，純化獲得GST-Zinc finger的融合蛋白。以人膠質瘤T98G細胞的cDNA為模板，利用PCR擴增帶有BamH I和Sal I 酶切位點的人Pokemon基因的鋅指結構域，然后將其克隆到pGEX-4T-1原核表達載體中。將正確的重組載體轉入大腸桿菌BL21（DE3），用IPTG誘導表達，再利用MagneGST particles親和純化Zinc finger融合蛋白，最后通過Western blot鑒定此融合蛋白。結果顯示，成功構建pGEX-4T-1-Zinc finger原核表達載體；30℃條件下，0.2 mmol/L的IPTG能誘導出大量的可溶性GST-Zinc finger蛋白；經(jīng)MagneGST particles純化的GST-Zinc finger蛋白可被識別Pokemon鋅指結構域的抗體特異識別。純化的GST-Zinc finger蛋白可用于后續(xù)的生物學研究。

Pokemon；鋅指結構域；原核表達；蛋白純化

Pokemon，即POK紅系髓性致癌因子（POK erythroid myeloid Ontogenic factor），也被稱為LRF、FBI-1、OCZF，最初被認為是一種HIV-1的啟動子結合蛋白，隨后被作為PLZF的同源物而被克?。?］。Pokemon是POK家族成員之一，其編碼的產物具有BTB/POZ域和鋅指結構，BTB/POZ域位于氨基末端，而鋅指結構位于其羧基末端。人Pokemon基因編碼區(qū)全長1 752 bp，編碼584個氨基酸，分子量約為64 kD。由于Pokemon蛋白中存在一些sumo化翻譯后修飾位點［2］，免疫印跡試驗中其分子量大小約為72 kD。

近年來的研究表明Pokemon在腫瘤的發(fā)生過程中起到十分重要的作用。Pokemon不僅在淋巴瘤中高表達，而且在乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、小細胞性肺癌和膠質瘤等腫瘤中也高水平表達［3-7］。Pokemon可以通過抑制Sp1蛋白與Sp1位點的結合和募集轉錄負阻遏物，如N-CoR和SMRT，從而降低抑癌基因Rb的表達［8］。此外，Pokemon也可以通過抑制Sp1蛋白和p53蛋白的轉錄激活和募集轉錄負阻遏物而降低細胞周期蛋白激酶抑制因子p21CIP1的表達［9］。近年來的研究表明Pokemon也可以通過與AR的相互作用而調節(jié)雄激素信號通路［10］。

鋅指結構域是鋅指蛋白的重要構成部分，主要參與DNA的識別與結合，從而調控下游靶基因的表達。越來越多的研究表明，鋅指結構域除了參與DNA特異識別外，還介導了一些蛋白與蛋白的相互作用［11］，如鋅指蛋白BCL6通過其鋅指結構域與Smad4的相互作用從而招募HDAC5調控TGF-β信號通路［12］。因此，純化與表達Pokemon的鋅指結構域，不僅有助于闡述Pokemon的作用機理，而且也有助于豐富Pokemon蛋白的相互作用網(wǎng)絡。本研究通過原核表達Pokemon基因的鋅指結構域，純化獲得GST-Zinc finger融合蛋白，旨在為后續(xù)生物學研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

pGEX-4T-1質粒、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21（DE3）均為本實驗室保存；高保真、熱啟動Taq聚合酶購于NEB公司；質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR純化試劑盒購于MN公司；反轉錄試劑盒購于Invitrogen 公司；各種限制性內切酶購于NEB公司；針對Pokemon鋅指結構域的抗體購于Sigma公司；MagneGST particles購于Promega公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖（IPTG）、考馬斯亮藍R-250購于北京普利萊公司；預染分子量標準蛋白marker購于Thermo公司；引物合成由北京奧克鼎盛生物科技有限公司進行。

1.2 方法

1.2.1 T98G細胞總RNA的提取 將培養(yǎng)的T98G細胞用PBS洗3遍，加入1 mL的Trizol，充分裂解，將裂解液轉移至無RNase的離心管中。加入0.2 mL的氯仿，震蕩混勻，室溫放置3 min。4℃，12 000×g離心10 min，將上層水相轉移至無RNase的離心管中。加入0.5 mL的異丙醇，室溫靜置20 min。4℃，12 000×g離心10 min，并用75%的乙醇洗滌RNA沉淀，等沉淀干燥后，加入50 μL無RNase的水，使沉淀溶解。利用紫外分光光度計測定總RNA的濃度，用甲醛變性膠檢測總RNA的質量。

1.2.2 T98G細胞總RNA的反轉錄 在一個無RNase的離心管中加入3 μg的總RNA，1 μL的Oligo-dT，并用無RNase的水調節(jié)體積到12 μL。70℃水浴變性6 min后，將離心管快速置于冰上。加入4 μL的 5×reaction buffer，1 μL的RNase inhibitor，2 μL 10 mmol/L dNTP和 1 μL的 SuperScript? III Reverse Transcriptase，42℃水浴60 min。加入1 μL RNase H，37℃溫浴10 min。將RT產物稀釋到100 μL，-20℃保存。

1.2.3 質粒的構建 構建pGEX-4T-1-Zinc fing載體的上游引物為：5'-TACTCGGATCCCGAGCCAAGGCCTTCCAGAAG-3'，下游引物為：5'-ATCACGTCGACCAGTCTATTAGGCGAGTCCGGCTGTGAA-3'（下劃線分別為BamH I和Sal I酶切位點）。以T98G細胞的cDNA為模板，利用以上引物，進行PCR擴增。將擴增到的PCR產物和pGEX-4T-1載體分別用Sal I內切酶和BamH I內切酶進行雙酶切，并將酶切后的PCR片段與剩余載體片段用T4 DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌DH5α，菌落PCR驗證陽性克隆，并酶切鑒定，然后將陽性克隆送往北京奧克鼎盛科技有限公司進行測序。

1.2.4 GST-Zinc finger融合蛋白的誘導表達 將構建成功的pGEX-4T-1-Zinc finger載體轉化大腸桿菌BL21（DE3）原核表達菌中，37℃培養(yǎng)至OD600=0.6時，分別加入1 mol/L的IPTG，至終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L。30℃誘導4 h，同時設未經(jīng)IPTG誘導的菌液做對照。取1 mL誘導后的菌液，6 000 r/min離心3 min，收集菌體，然后加入40 μL的1×SDS上樣緩沖液，沸水煮5 min，然后6 000 r/min離心2 min，取上清用于SDS-PAGE凝膠電泳和考馬斯亮藍染色，檢測GST-Zinc finger融合蛋白的表達情況。

1.2.5 GST-Zinc finger融合蛋白的純化 收集1 mL誘導后的細菌，加入1 mL的裂解液，混勻，在室溫搖動40 min。同時，在另一個離心管中加入20 μL的MagneGST particles，利用磁架，將上清吸去，再加入250 μL的Binding/Washing buffer，懸浮磁粉，利用磁架，吸去上清，平衡磁粉。將平衡好的MagneGST particles加 入100 μL的Binding/Washing buffer，再加入100 μL的細菌裂解液，室溫搖動60 min。利用磁架，吸去上清，加入250 μL的Binding/ Washing buffer洗滌3次，吸取上清。用30 μL的0.1 mol/L谷胱甘肽洗脫融合蛋白，并在洗脫液中加入8 μL的5×SDS上樣緩沖液，沸水煮6 min，6 000 r/min離心2 min，利用SDS-PAGE凝膠電泳檢測融合蛋白的純化效果。

1.2.6 GST-Zinc finger融合蛋白的鑒定 將純化后GST-Zinc finger融合蛋白和T98G細胞總蛋白經(jīng)SDSPAGE凝膠電泳后，電轉至PVDF膜上。用5%的BSA封閉1 h，按1∶2 000的比例加入Pokemon的多克隆抗體，孵育2 h后，洗去一抗，再加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗，孵育40 min后，洗去二抗，再利用ECL顯色發(fā)光試劑盒并結合膠片顯影觀察試驗結果。

2 結果

2.1 Pokemon基因Zinc finger區(qū)段的PCR擴增

使用Invitrogen公司的Trizol試劑，提取T98G細胞的總RNA，電泳檢測RNA完整性良好，可用于反轉錄試驗。以T98G細胞的cDNA為模板，使用已合成的Zinc finger區(qū)段的上、下游引物，利用NEB公司的高保真、熱啟動的Taq聚合酶，PCR擴增Pokemon的Zinc finger結構域（第376-584位氨基酸）。擴增條件為：94℃預變性3 min；94℃ 30 s，53℃ 30 s，72℃ 1 min 45 s，31個循環(huán)。擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察到600 bp左右的擴增產物，與Pokemon基因Zinc finger結構域區(qū)段的大小一致（圖1）。

圖1 Pokemon基因Zinc finger區(qū)段的PCR擴增結果

2.2 pGEX-4T-1-Zinc finger原核表達載體的構建

將擴增的Pokemon基因的Zinc finger片段和pGEX-4T-1載體分別用Sal I內切酶和BamH I內切酶進行雙酶切，電泳并回收酶切后的Zinc finger片段和pGEX-4T-1載體的大片段，通過T4 DNA連接酶將Zinc finger片段正向插入pGEX-4T-1載體中。將菌落PCR鑒定為陽性的1個重組子進行酶切鑒定，這個重組子經(jīng)酶切鑒定后得到兩條目的帶（圖2），約為600 bp和4 900 bp，初步證明重組載體構建正確，并將此重組子進行測序。經(jīng)過與GenBank的序列對比后，證明Zinc finger片段已經(jīng)成功插入pGEX-4T-1載體，pGEX-4T-1-Zinc finger載體構建成功。

圖2 重組質粒pGEX-4T-1-Zinc finger酶切的鑒定

2.3 GST-Zinc finger融合蛋白的誘導表達及可溶性分析

將重組載體pGEX-4T-1-Zinc finger轉化大腸桿菌BL21（DE3）。37℃下，培養(yǎng)至OD600=0.6后，分別用終濃度為0.2、04、0.6、0.8和1.0 mmol/L的IPTG在30℃下誘導4 h，同時以未誘導的表達菌為對照。分別收集菌體，進行SDS-PAGE凝膠電泳，再用考馬斯亮藍染色。結果（圖3）顯示，5個GST-Zinc finger誘導組在43 kD處均出現(xiàn)明顯條帶，與預期結果相符，而未誘導的GST-Zinc finger表達菌在相應位置幾乎無目的蛋白條帶出現(xiàn)，說明融合基因在大腸桿菌中得到有效的表達。但是，隨著IPTG濃度的增高，融合蛋白的表達量并未增強。同時，分別將上述不同濃度的IPTG誘導下的表達菌進行裂解，并收集上清和沉淀，再利用SDS-PAGE凝膠電泳檢測其可溶性。結果（圖4）顯示，GSTZinc finger的融合蛋白主要在上清中表達，其中0.2 mmol/L IPTG誘導的可溶性融合蛋白相對較多。

圖3 不同濃度IPTG誘導下GST-Smad4 融合蛋白的表達分析

圖4 不同濃度 IPTG誘導下GST-Zinc finger 融合蛋白在上清和沉淀中的對比

2.4 GST-Zinc finger融合蛋白的純化

將0.2 mmol/L IPTG誘導的GST-Zinc finger表達菌在-80℃放置1 h，將其融化，加入1 mL裂解液，超聲破碎后，收集上清，加入MagneGST particles，通過結合、洗滌等步驟后，用0.1 mol/L的谷胱甘肽洗脫GST-Zinc finge融合蛋白，并將純化的GST-Zinc finger融合蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后考馬斯亮藍染色。結果（圖5）顯示，GST-Zinc finger融合蛋白得到較好的純化，純度較高。

圖5 GST-Zinc finger 融合蛋白的純化

2.5 GST-Zinc finger融合蛋白的鑒定

為了驗證純化的GST-Zinc finger融合蛋白具有Pokemon蛋白鋅指結構域的免疫學特性，分別將T98G細胞總蛋白和純化的GST-Zinc finger融合蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，再將其轉移到PVDF膜上，通過Western blot，檢測融合蛋白能否被Pokemon抗體特異識別。由于GST-Zinc finger蛋白比Zinc finger蛋白多了一個GST標簽（約20 kD），其分子量預計在43 kD左右。如圖6所示，GST-Zinc finger融合蛋白的條帶出現(xiàn)在預期位置，說明識別鋅指結構域的Pokemon特異性抗體可以識別GST-Zinc finger融合蛋白，暗示GST-Zinc finger融合蛋白可用于后續(xù)的研究。

圖6 GST- Zinc finger 融合蛋白的鑒定

3 討論

Pokemon是POK家族的重要成員，作為一種轉錄抑制因子，參與多種生物學過程。目前，已經(jīng)在人類基因中發(fā)現(xiàn)了40多種POK蛋白?，F(xiàn)已證明POK蛋白在胚胎的發(fā)生、分化和腫瘤形成中起到十分重要的作用［7，13，14］。Pokemon基因位于第19號染色體短臂1區(qū)3帶中的第3亞帶（19p13.3），具有2個外顯子和2個內含子，mRNA全長4 456 bp，其編碼的產物具有BTB/POZ結構域和鋅指結構域，其鋅指結構屬于Krüppel型的鋅指結構。

Pokemon的BTB/POZ結構域是一段高度保守的蛋白與蛋白的相互作用域，介導同源或異源二聚體的形成，主要招募轉錄的負阻遏物和組蛋白去乙?；浮Ｆ銫-末端的鋅指結構介導特異的DNA的識別和結合，并通過增加HDAC的招募和調控染色質重構而發(fā)揮轉錄抑制作用［7］。

最早的研究發(fā)現(xiàn)Pokemon在前脂肪的分化中有著重要的作用。如果在鼠脂肪細胞系3T3-L1中持續(xù)表達Pokemon，可以導致脂肪形成加速，并降低有絲分裂相關蛋白，如：cyclinA等蛋白的表達［15］。2005年，Maeda等［7］發(fā)現(xiàn)過量表達Pokemon可以引起細胞的轉化，同時也可以特異性的抑制抑癌基因ARF的表達，進而抑制ARF-p53通路，從而影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此，Pokemon在細胞的分化和腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到重要的作用。

Pokemon除了在淋巴瘤中高水平表達外，在一些實體瘤中，如：乳腺癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌等表達水平也很高［3-7］。研究發(fā)現(xiàn)敲低Pokemon的表達通過抑制PI3K/Akt信號通路而抑制肝癌細胞HepG2和Huh-7的增生［16］。我們近期的研究發(fā)現(xiàn)，過量表達Pokemon可以增加前列腺癌LNCaP細胞的增生［10］。因此，Pokemon對腫瘤細胞的增殖有著重要的調節(jié)作用。

前期的研究表明Pokemon主要作為一種轉錄因子而調節(jié)下游基因的表達。如：Pokemon通過與Sp1蛋白的相互作用而干擾Sp1蛋白與Sp1位點的結合而降低ADH5/FDH基因的表達［17］，通過競爭Sp1蛋白與Sp1位點的結合和募集轉錄負阻遏物而降低抑癌基因Rb的表達［8］，通過抑制Sp1蛋白和p53蛋白的轉錄激活和募集轉錄負阻遏物而降低p21CIP1的表達［9］。但是，我們最近的研究發(fā)現(xiàn)Pokemon可以通過與AR的相互作用和招募轉錄負阻遏物SMRT和NCOR而調控AR信號通路［10］。因此，Pokemon可以通過兩種方式來調節(jié)下游基因的表達。

鋅指蛋白作為一種重要的轉錄因子，在基因的表達調控中發(fā)揮了重要的作用。鋅指蛋白主要通過其C-末端的鋅指結構域負責識別特異的DNA序列，進而調控下游基因的表達。但是，越來越多的研究表明鋅指結構域也可介導蛋白與蛋白的相互作用［11］。鑒于Pokemon在細胞分化和腫瘤中的重要作用，表達和純化其C-末端的鋅指結構域，有助于進一步闡明Pokemon的作用機理。

IPTG的濃度對外源蛋白的表達影響很大，但過高濃度的IPTG會對細胞產生毒性，同時也影響蛋白的表達量和表達形式。本研究摸索了不同濃度的IPTG對GST-Zinc finger融合蛋白表達的影響。研究發(fā)現(xiàn)，隨著IPTG濃度的增加，GST-Zinc finger融合蛋白表達變化不大。因此，本試驗選擇0.2 mmol/L為IPTG誘導的濃度。同時，分別檢測了在不同濃度IPTG誘導下，GST-Zinc finger融合蛋白在BL2（DE3）表達菌裂解液的上清和沉淀的分布，發(fā)現(xiàn)低濃度的IPTG誘導下，GST-Zinc finger融合蛋白可溶性表達的豐度較高。

4 結論

本研究成功構建了pGEX-4T-1-Zinc finger原核表達載體，摸索了GST-Zinc finger融合蛋白誘導表達的適宜條件，并獲得了具有Pokemon免疫活性的GST-Zinc finger融合蛋白。

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（責任編輯 馬鑫）

Prokaryotic Expression and Purification of Zinc Finger Domain of Human Pokemon Protein

Liu Li1Li Yueting1Zhang Mengmeng2Yang Yutao1Xu Zhiqing1
（1. School of Basic Medical Sciences，Capital Medical University，Beijing 100069；2. Jiaxing Entry-Exit Inspection and Quarantine，Jiaxing 314001）

It was to express human Zinc finger domain of Pokemon gene in prokaryotic cells and purify the GST-Zinc finger fusion protein. The segment of zinc finger domain of Pokemon gene was amplified by PCR and cloned into prokaryotic expression vector pGEX-4T-1. The recombinant plasmid pGEX-4T-1-Zinc finger was transformed into E.coli BL21（DE3）and exogenous protein was induced by IPTG. After purification using MagneGST particles， the GST-Zinc finger fusion protein was further identified by Western blot. Results showed that the recombinant plasmid pGEX-4T-1-Zinc finger was constructed successfully. When BL21（DE3） cells transformed with pGEX-4T-1-Zinc finger were cultured at 30℃ and induced with 0.2 mmol/L IPTG， GST-Zinc finger protein was obtained in a large quantity in supernatant. The purified GST-Zinc finger was further identified specifically by Pokemon antibody. Therefore， it proved that GST-Zinc finger fusion protein was successfully expressed and purified， and could be used for further study of the function of Pokemon.

Pokemon；Zinc finger；prokaryotic expression；protein purification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.033

2014-08-08

國家“973”計劃（2010CB912003），國家自然科學基金項目（31271154，31171032），高等學校博士學科點專項科研基金項目（20111107120011），北京市教委科技發(fā)展計劃（KM201310025001）

劉莉，女，碩士研究生，研究方向：神經(jīng)生物學；E-mail：emil_lily@163.com

楊予濤，博士，副教授，研究方向：神經(jīng)生物學；E-mail：yutaoy@ccmu.edu.cn徐志卿，博士，教授，研究方向：神經(jīng)生物學；E-mail：zhiqingx@ccmu.edu.cn