李娜娜 吳曉英 吳振強(qiáng)

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510006）

液態(tài)烷烴氧載體對(duì)粘紅酵母發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素的影響

李娜娜 吳曉英 吳振強(qiáng)

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510006）

研究正己烷、正十二烷、正十六烷3種液態(tài)烷烴作為氧載體對(duì)粘紅酵母生長(zhǎng)和番茄紅素合成的影響，發(fā)現(xiàn)氧載體不僅使菌體生物量提高，同時(shí)使單位細(xì)胞的番茄紅素產(chǎn)率增大，從而提高粘紅酵母合成番茄紅素的能力。3種液態(tài)烷烴中正十二烷作為氧載體效果較好，試驗(yàn)結(jié)果表明，在發(fā)酵第0 h時(shí)添加4%的正十二烷，細(xì)胞生物量達(dá)到16.49 g/L，番茄紅素合成量達(dá)到42.32 mg/L分別比對(duì)照組提高了26.2%和50.17%。

粘紅酵母；番茄紅素；液態(tài)烷烴；氧載體；傳遞效率

番茄紅素是一種具有11個(gè)共軛雙鍵和兩個(gè)非共軛雙鍵的不飽和碳?xì)浠衔?，是許多類胡蘿卜素生物合成的中間體，其經(jīng)過(guò)環(huán)化后可形成其他種類的類胡蘿卜素，如β-胡蘿卜素、玉米黃素、蝦青素等［1］。番茄紅素具有很強(qiáng)的抗氧化作用，其對(duì)單線氧的清除能力是β-胡蘿卜素的2倍，在類胡蘿卜素中最強(qiáng)［2］，同時(shí)番茄紅素還具有對(duì)自由基的清除、抵擋UV導(dǎo)致的皮膚光傷害［3-5］、阻斷形成亞硝胺、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、減少 DNA 損傷以及促進(jìn)細(xì)胞間隙連接通訊等作用［6，7］，故其在淬滅單線態(tài)氧、消除氧自由基、降低癌癥發(fā)病率、增強(qiáng)人體免疫功能以及防治心血管疾病方面具有良好的應(yīng)用前景［8-12］。

目前，生產(chǎn)天然類胡蘿卜素的主要菌種為三孢布拉氏霉（Blakeslea trispora）和紅酵母（Rhodotorular）。雖然與三孢布拉氏霉相比，紅酵母的單位產(chǎn)量比較低，但由于其具有營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)周期短、易于放大培養(yǎng)、菌體營(yíng)養(yǎng)豐富等許多優(yōu)點(diǎn)，具有很高的實(shí)用價(jià)值。

粘紅酵母發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素是好氧發(fā)酵過(guò)程，溶氧水平會(huì)影響細(xì)胞類胡蘿卜素的產(chǎn)率，為了保證發(fā)酵中氧的供應(yīng)，通常是采用大通氣量及高攪拌輸出功率相結(jié)合的方法，造成動(dòng)力成本上升，并因剪切力過(guò)大，泡沫增多，不易控制等從而不利于發(fā)酵生產(chǎn)。

近來(lái)年，新的強(qiáng)化傳氧技術(shù)的發(fā)展方向之一就是向發(fā)酵液中引入一種新的液相，以減少氣液傳氧阻力，從而提高傳氧效率［13］。這種液相一般具有比水更高的溶氧能力，且與發(fā)酵液互不相溶，稱為氧載體。有文獻(xiàn)報(bào)道［14］加入諸如煤油、正己烷、正十二烷等氧載體后，可提高同一反應(yīng)系統(tǒng)的Kla（傳氧系數(shù)）值30%-300%，或達(dá)到同一混合效果降低攪拌功率30%以上的優(yōu)點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)用液態(tài)烷烴作為氧載體發(fā)酵粘紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素鮮有報(bào)道，本研究主要研究不同液態(tài)烷烴氧載體對(duì)粘紅酵母液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素的影響，旨在探討氧載體在相應(yīng)發(fā)酵體系中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 本實(shí)驗(yàn)室保藏的粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）2.27，-80℃冷凍保存。

1.1.2 主要儀器和試劑 番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品（≥95%），上海融合科技發(fā)展有限公司；煙堿（95%），西安天則生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

SHP-450D型生化培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SKYB2112B型恒溫?fù)u床，廣州科橋?qū)嶒?yàn)技術(shù)設(shè)備有限公司；LD5-2A低速離心機(jī)，背景醫(yī)用離心機(jī)廠；2802S型紫外分光光度計(jì)，尤尼科（上海）儀器有限公司；Waters高效液相色譜儀1525、Waters紫外分光檢測(cè)器2487。

1.1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法 斜面活化培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，瓊脂20 g/L，pH自然。

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，pH自然。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，蛋白胨15 g/L，酵母粉10 g/L，核黃素0.5 mg/L，初始pH5。

種子斜面活化培養(yǎng)：挑取一環(huán)粘紅酵母接入斜面活化培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)48 h。

液體種子培養(yǎng)：從活化了的斜面種子中挑取兩環(huán)黏紅酵母接種于裝有30 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶?jī)?nèi)，28℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

液體發(fā)酵培養(yǎng)：以5%的接種量，將液體種子接入到裝有25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28℃下200 r/min振蕩培養(yǎng)96 h。

1.2 方法

1.2.1 氧載體試驗(yàn) 選擇正己烷、正十二烷、正十六烷作為待測(cè)氧載體，通過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌。篩選氧載體試驗(yàn)中，在接種的同時(shí)分別進(jìn)行添加濃度同為2%（V/V）的正己烷、正十二烷、正十六烷，在發(fā)酵24 h添加環(huán)化酶抑制劑煙堿，繼續(xù)發(fā)酵至96 h?？疾炀哂胁煌琇ogP值的氧載體對(duì)粘紅酵母產(chǎn)番茄紅素的影響。所有試驗(yàn)均做3個(gè)平行。

1.2.2 生物量的測(cè)定 發(fā)酵結(jié)束后，取10 mL液體發(fā)酵液轉(zhuǎn)入離心管中，以4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀水洗離心兩次，得到酵母泥，于60℃下過(guò)夜烘干，稱干重量。

1.2.3 番茄紅素的提取 發(fā)酵結(jié)束后，參照文獻(xiàn)［15］采用熱酸法破壁。

丙酮浸提：取發(fā)酵液10 mL轉(zhuǎn)入離心管中，以4 000 r/min離心10 min，沉淀水洗后得到酵母泥；加入3 mol/L的HCl溶液5 mL，混合均勻后浸泡90 min，然后沸水浴6 min，迅速冷卻，再4 000 r/min離心10 min，得沉淀水洗2次，離心后得到菌體殘片；加入丙酮9 mL，混合均勻，浸提60 min，4 000 r/min下離心10 min，得到色素丙酮浸提液。

1.2.4 番茄紅素含量測(cè)定方法 將色素提取液用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾后，以高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定提取液中番茄紅素的含量。同時(shí)配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在相同條件下測(cè)定，根據(jù)峰面積制備標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

Waters-1525高效液相色譜儀；色譜柱為：Agilent HCC18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；Binary高效泵；檢測(cè)器為：Waters-2487，Double Absorbance Detector；數(shù)據(jù)分析軟件：Breeze。

高效液相色譜條件：流動(dòng)相為V（乙腈）∶V（甲醇）∶V（二氯甲烷）=21∶21∶8，檢測(cè)波長(zhǎng)為472 nm，流速為1.5 mL/min，柱溫為28℃，進(jìn)樣量為10 μL。

2 結(jié)果

2.1 番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱量2.0 mg的番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品，用丙酮溶解，定容于10 mL的棕色容量瓶中，質(zhì)量濃度為200 μg/mL。再分別稀釋成150、100、50、25和12.5 μg/mL的質(zhì)量濃度梯度，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后HPLC檢測(cè)，數(shù)據(jù)處理，得到峰面積與質(zhì)量濃度的關(guān)系，如圖1所示。

圖1 番茄紅素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 對(duì)氧載體的篩選

有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響與其在辛醇-水系統(tǒng)中的分配系數(shù)LogP密切相關(guān)，即LogP越高，對(duì)細(xì)胞的刺激性或者毒性越小，生物相容性越好。Laane等［16］曾提出生物相容性較好的溶劑其LogP應(yīng)該大于4。參照表1中的相關(guān)數(shù)據(jù)，本試驗(yàn)考察了正己烷、正十二烷、正十六烷作為氧載體對(duì)粘紅酵母產(chǎn)番茄紅素的影響，結(jié)果如表2所示。

表1 有機(jī)溶劑的物理性質(zhì)

本試驗(yàn)考察的3種液態(tài)烷烴氧載體中，正十六烷對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)最有利，但正十二烷對(duì)粘紅酵母合成番茄紅素最有利（表2）。當(dāng)正十二烷的添加體積分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，生物量和番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到16.6 g/L和46.9 mg/L，分別比對(duì)照組增長(zhǎng)了25.37%和46.9%。正己烷對(duì)粘紅酵母生長(zhǎng)和番茄紅素合成也都有一定的促進(jìn)作用，但效果不顯著。綜合考慮，正十二烷是粘紅酵母生長(zhǎng)和番茄紅素合成的最佳氧載體。

表2 不同有機(jī)溶劑作為氧載體對(duì)粘紅酵母生長(zhǎng)和番茄紅素合成的影響

2.3 正十二烷不同添加濃度的影響

表2的結(jié)果已經(jīng)證實(shí)正十二烷是粘紅酵母生長(zhǎng)和番茄紅素合成的最佳氧載體，因此對(duì)其添加濃度和添加時(shí)間作了進(jìn)一步優(yōu)化考察。在發(fā)酵的初始，向發(fā)酵液中分別添加0%，1%、2%、4%、8%和12%不同濃度的正十二烷，發(fā)酵結(jié)束后使用高效液相色譜（HPLC）測(cè)定番茄紅素含量以確定氧載體的最優(yōu)加入時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示，添加正十二烷的試驗(yàn)組的生物量和番茄紅素產(chǎn)量都高于未添加的對(duì)照組，隨著正十二烷濃度的不斷增大，粘紅酵母的生物量和番茄紅素產(chǎn)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)正十二烷的濃度為2%時(shí)，生物量達(dá)到最大值16.9 g/L，比對(duì)照組增加29.4%，番茄紅素產(chǎn)量則在正十二烷的添加濃度為4%時(shí)達(dá)到最大值42.32 mg/L，比對(duì)照組提高了50.17%。從發(fā)酵液的表觀上可以看出，加入8%和12%的正十二烷時(shí)，搖瓶中存在顯著的較大油滴易于浮于表面，而正十二烷的加入量為2%和4%的搖瓶中則分散乳化效果較好，從而更有利于油-水兩相間的接觸與物質(zhì)傳遞。可見(jiàn)，正十二烷作為氧載體有利于菌體的生長(zhǎng)，并能提高單位細(xì)胞番茄紅素的合成能力，二者的共同作用使番茄紅素的產(chǎn)量顯著增加。究其原因可能是一方面液態(tài)烷烴起到了分散劑的作用，增加氧氣界面的傳遞面積，從而利于粘紅酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)，另一方面液態(tài)烷烴作為氧載體，可以刺激粘紅酵母合成積累番茄紅素。

圖2 不同濃度的正十二烷對(duì)粘紅酵母的生長(zhǎng)和產(chǎn)番茄紅素的影響

2.4 4%的正十二烷不同添加時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響

使用氧載體的時(shí)間應(yīng)該是發(fā)酵體系出現(xiàn)溶氧限制時(shí)，此時(shí)加入氧載體可以解決溶氧不足的限制，提高發(fā)酵生產(chǎn)能力。液體發(fā)酵粘紅酵母生產(chǎn)番茄紅素的過(guò)程中，分別在不同的時(shí)間點(diǎn)加入4% 的正十二烷，發(fā)酵結(jié)束后使用高效液相色譜（HPLC）測(cè)定番茄紅素含量以確定氧載體的最優(yōu)加入時(shí)間。試驗(yàn)結(jié)果（圖3）顯示，隨著添加4%的正十二烷的時(shí)間的推移，粘紅酵母的生物量和番茄紅素產(chǎn)量都呈一個(gè)下降的趨勢(shì)，在發(fā)酵開(kāi)始添加4%的正十二烷的生物量為17.015 g/L，比在發(fā)酵84 h時(shí)添加4%的正十二烷的生物量13.17 g/L提高了29.1%，番茄紅素的產(chǎn)量達(dá)到最大43 mg/L，比在84 h添加獲得的番茄紅素產(chǎn)量30.6 mg/L提高了40.52%。在發(fā)酵初期加入正十二烷作為氧載體對(duì)粘紅酵母的生長(zhǎng)效果明顯，可能因?yàn)樵缙诩尤氲恼椋梢约皶r(shí)緩解粘紅酵母培養(yǎng)過(guò)程中氧氣不足的問(wèn)題。

圖3 4%的正十二烷的不同添加時(shí)間對(duì)粘紅酵母的生長(zhǎng)和產(chǎn)番茄紅素的影響

2.5 添加氧載體對(duì)粘紅酵母發(fā)酵過(guò)程的影響

在液體發(fā)酵粘紅酵母生產(chǎn)番茄紅素的過(guò)程中的0 h時(shí)添加氧載體正十二烷4%，定時(shí)取樣測(cè)量相關(guān)參數(shù)，試驗(yàn)組與對(duì)照組中粘紅酵母的生物量、番茄紅素產(chǎn)量、pH、殘?zhí)呛康淖兓Y(jié)果如圖4所示。

從圖4中可以看出，添加氧載體有利于菌體生長(zhǎng)（圖4-A）并提高了單位細(xì)胞類胡蘿卜素的合成能力（圖4-E），兩者的共同作用促使番茄紅素產(chǎn)量顯著增加（圖4-B）。發(fā)酵液的pH的變化趨勢(shì)基本一致，但添加氧載體的發(fā)酵液稍低于對(duì)照組試驗(yàn)（圖4-C），這與劉元帥等［17］研究添加液態(tài)烷烴氧載體對(duì)法夫酵母發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素的影響中發(fā)現(xiàn)添加正十六烷的試驗(yàn)組的pH值稍微低于對(duì)照組的結(jié)果一致。基于試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)這可能是由于正十二烷的添加，促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)，從而加快對(duì)氮源的吸收利用。添加氧載體還增大了細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用率，葡萄糖消耗明顯加快（圖4-D），這可能也是氧載體促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和番茄紅素合成的一個(gè)重要原因。

3 討論

氧載體雙液相發(fā)酵，強(qiáng)化發(fā)酵過(guò)程中的氧傳遞，主要來(lái)自兩個(gè)方面：一是氧在氧載體中的溶解度大大高于氧在水中的溶解度，如據(jù)Wang等［14］報(bào)道的有機(jī)溶劑正十二烷，氧載體的添加實(shí)際是增大了氧傳遞的總推動(dòng)力（C*-C）；另一方面是由于氧載體在培養(yǎng)基中的分散、乳化，增大了氧傳遞的相面積，從而大大提高了氧的體積傳遞系數(shù)，有利于氧傳遞［13］。因此可將這些有機(jī)溶劑作為氧載體加入發(fā)酵液以提高溶氧濃度，對(duì)于某些對(duì)氧濃度要求高的發(fā)酵過(guò)程，添加適宜濃度的有機(jī)溶劑可大幅度提高目的產(chǎn)物的合成水平［18］。

雖然國(guó)內(nèi)外已有大量試驗(yàn)證明，向發(fā)酵液中添加液態(tài)烷烴作為氧載體確實(shí)能促進(jìn)代謝產(chǎn)物的合成。Da Silva、 Mendes等［19，20］研究正十二烷對(duì)隱甲藻發(fā)酵產(chǎn)DHA產(chǎn)量的影響中，發(fā)現(xiàn)正十二烷作為一種便宜的有機(jī)溶劑被添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中時(shí)，一方面可以作為氧載體來(lái)增強(qiáng)氧的傳遞；另一方面作為一種有機(jī)相，可以增加DHA產(chǎn)量和濃縮脂肪酸。Xu等［21］向培養(yǎng)基中添加氧載體正十二烷和正十六烷能提高三胞布拉氏霉菌合成番茄紅素的能力。

圖4 添加氧載體（4%，正十二烷 ）對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)（A）、番茄紅素合成（B）、pH值（C）、葡糖糖消耗的影響（D）和單位細(xì)胞番茄紅素的合成量（E）

但目前為止國(guó)內(nèi)對(duì)氧載體的研究較少，本研究利用正己烷、正十二烷、正十六烷3種液態(tài)烷烴作為氧載體，考察其對(duì)粘紅酵母生長(zhǎng)和番茄紅素合成的影響，發(fā)現(xiàn)氧載體正十二烷是一種經(jīng)濟(jì)的提高粘紅酵母生物量和番茄紅素產(chǎn)量的有機(jī)溶劑。但不同氧載體對(duì)菌體生長(zhǎng)促進(jìn)程度和對(duì)粘紅酵母合成積累番茄紅素促進(jìn)效果不同，一方面可以考慮把不同氧載體組合優(yōu)化，考察其對(duì)粘紅酵母產(chǎn)番茄紅素的影響；另一方面利用表面活性劑可以改變發(fā)酵液流體特性和菌體通透性，構(gòu)建氧載體偶聯(lián)表面活性劑體系研究其對(duì)粘紅酵母產(chǎn)番茄紅素的影響。

4 結(jié)論

本研究首次將液態(tài)烷烴氧載體應(yīng)用于粘紅酵母產(chǎn)番茄紅素的研究中，考察正己烷，正十二烷、正十六烷對(duì)粘紅酵母合成積累番茄紅素的影響，發(fā)現(xiàn)氧載體不僅使菌體生物量提高，同時(shí)使單位細(xì)胞的番茄紅素產(chǎn)率增大，從而提高粘紅酵母合成番茄紅素的能力。結(jié)果表明，3種液態(tài)烷烴中正十二烷作為氧載體效果較好，在發(fā)酵第0 h時(shí)添加4%的正十二烷，細(xì)胞生物量達(dá)到16.49 g/L，番茄紅素合成量達(dá)到42.32 mg/L分別比對(duì)照組提高了26.2%和50.17%。正十二烷價(jià)格低廉并且可重復(fù)利用，作為粘紅酵母發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素的氧載體具有較高的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值和潛力。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

A Effect of Liquid Alkane Oxygen-vectors on Rhodotorula Fermentations and Lycopene Production

Li Nana Wu Xiaoying Wu Zhenqiang
（School of Bioscience&Bioengineering，South China University of Techology，Guangzhou 510006）

Addition of oxygen-vectors（n-hexane， n-dodecane， hexadecane）to fermentation medium was recognized as a method of enhancing oxygen transfer and promoting lycopene yield by Rhodotorula fermentation. n-dodecane as an oxygen-vector is the best in three kinds of liquid alkane. Experimental results show that the biomass of Rhodotorula attained 16.49 g/L and the yield of lycopene biosynthetic reached 42.32 mg/L by adding 4% n-dodecane in the 0 h， which was 26.2% and 50.17% higher than the control group， respectively.

Rhodotorula；lycopene；liquid alkane；oxygen-vectors；oxygen transfer

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.029

2014-08-19

李娜娜，女，碩士研究生，研究方向：生物活性物質(zhì)的研究；E-mail：759365635@qq.com

吳曉英，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：生物制藥與生物資源的綜合利用；E-mail：xywu@scut. edu. cn