蔡深文熊治廷劉晨徐仲瑞鄧松強(qiáng)

（1. 遵義師范學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，遵義 563002；2. 武漢大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，武漢 430079）

海州香薷Actin基因片段克隆及表達(dá)分析

蔡深文1熊治廷2劉晨2徐仲瑞2鄧松強(qiáng)2

（1. 遵義師范學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，遵義 563002；2. 武漢大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，武漢 430079）

通過克隆海州香薷Actin基因片段并分析其組織表達(dá)，為研究海州香薷重金屬抗性相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控奠定基礎(chǔ)。根據(jù)GenBank中其他植物Actin基因保守序列設(shè)計(jì)兼并引物，以海州香薷根總RNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)分離得到Actin基因片段。序列分析結(jié)果表明，海州香薷Actin基因片段長576 bp，編碼192個(gè)氨基酸，與其他植物同源基因的氨基酸序列相似性為84%-97%，所克隆的序列為Actin基因的同源片段，將其命名為EhACT，在GenBank中提交序列，獲得登錄號(hào)AGT37260。半定量RT-PCR分析結(jié)果表明，EhACT在海州香薷的根、莖和葉中表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，初步表明其可作為研究海州香薷基因表達(dá)的內(nèi)參基因。

海州香薷；Actin基因；克隆；表達(dá)

海州香薷（Elsholtzia haichowensis Sun）是一年生草本植物，屬唇形科，廣泛分布于長江中下游銅礦區(qū)和銅污染的土壤中，是一種銅礦指示植物，俗稱“銅草”［1，2］。海州香薷在非銅礦區(qū)也有發(fā)現(xiàn)［3］。銅礦區(qū)的海州香薷由于長期生活在高濃度Cu污染的環(huán)境脅迫條件下，可能已經(jīng)發(fā)生了與Cu污染相適應(yīng)的抗性進(jìn)化，形成了與非礦區(qū)種群不同的抗性生態(tài)型［4］，通常來自礦區(qū)種群的海州香薷對(duì)Cu具有較高的吸收富積能力和耐受能力［5］。海州香薷是植物重金屬抗性機(jī)理研究領(lǐng)域的理想植物材料，從抗性相關(guān)基因表達(dá)角度能夠更深入地理解海州香薷的銅抗性機(jī)理，對(duì)于基因表達(dá)量的研究通常需要穩(wěn)定的內(nèi)參基因作為標(biāo)準(zhǔn)來衡量，選擇合適的內(nèi)參基因至關(guān)重要。植物肌動(dòng)蛋白（Actin）在植物細(xì)胞形成和物質(zhì)運(yùn)輸方面起著重要作用［6］，是組成型表達(dá)蛋白，高度保守，在基因表達(dá)調(diào)控中被廣泛作為內(nèi)參基因［7］。而關(guān)于海州香薷Actin基因的研究還未見報(bào)道。因此，本研究通過同源克隆方法分離海州香薷Actin基因片段并進(jìn)行表達(dá)分析，以此基因?yàn)閮?nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，旨在為其他功能基因在海州香薷中的表達(dá)調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 海州香薷（E. haichowensis）種子采自湖北大冶銅綠山古銅礦遺址（11453’E，30 05’N，MP）。海州香薷種子用0.3% NaClO溶液浸泡消毒20 min，去離子水沖洗5遍后用去離子水浸泡過夜，使種子充分吸收水分。第2天，將種子轉(zhuǎn)移至底部鋪有濾紙的塑料碗中，加去離子水，水面浸沒種子的一半左右，置于HSR025型人工氣候箱中黑暗萌發(fā)，溫度設(shè)定為25℃，濕度75%。約96 h后種子基本全部萌發(fā)。隨后采用水培方法培養(yǎng)海州香薷幼苗，待長至4對(duì)真葉時(shí)剪取新鮮的根尖（約2 cm）用于RNA提取。

1.1.2 試劑 RNA提取使用的Trizol試劑購自Invitrogen公司；PCR反應(yīng)所用的Ex Taq，dNTPmixture，pMD18-T載體和RNase Inhibitor，均購自TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV RT購自Promega公司；DNA凝膠回收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品；大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技有限公司；其他生化試劑購自丁香園生物技術(shù)有限公司，引物由上海博道生物技術(shù)公司合成，序列測定由華大基因完成。

1.2 方法

1.2.1 海州香薷總RNA提取 采用Trizol法提取總RNA，結(jié)果用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外分光光度計(jì)測定總RNA濃度及純度，-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RT-PCR擴(kuò)增 首先以海州香薷根部總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄酶與引物Oligo（dT）18引導(dǎo)cDNA第一鏈的合成。0.2 mL離心管中依次加入12.5 μL總RNA，3 μL Oligo（dT）18，11 μL DEPC處理的水，70℃溫浴5 min，迅速置于冰上冷卻，微離心收集溶液至離心管底部，再依次加入5×M-MLV RT Buffer 10 μL，RNase Inhibitor 1.5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L each） 10 μL，M-MLV RT 2 μL，用移液槍吸打混勻，于PCR儀上42℃反應(yīng)60 min，70℃溫浴10 min失活反轉(zhuǎn)錄酶，冰上分裝后-20℃保存?zhèn)溆?。根?jù)其他物種Actin基因序列，設(shè)計(jì)其上游引物PrimerF 5'-TGTGGTCCTTTTGTGTCATT-3'和下游引物PrimerR：5'-CTCCTTGCTCATCCTGTCAGC-3'，以反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL：10× Ex Taq Buffer（Mg2+plus） 2 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L each） 1 μL，PrimerF 1 μL，PrimerR 1 μL，cDNA 1 μL，Ex Taq 0.2 μL，ddH2O 13.8 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 陽性克隆鑒定 目的片段按照DNA凝膠回收試劑盒操作說明進(jìn)行切膠回收純化，連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行PCR檢測，選取帶有目的片段的重組質(zhì)粒測序。

1.2.4 序列分析 使用NCBI網(wǎng)站的BLAST在線軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）進(jìn)行海州香薷Actin基因片段的同源性比對(duì)分析與相似性搜索。使用ClustalX軟件將海州香薷和其他物種Actin基因的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)［8］。

1.2.5 半定量RT-PCR分析Actin基因表達(dá) 根據(jù)已獲得的Actin基因片段序列，設(shè)計(jì)特異性引物Actin--F（5'-TTCTTTGGCAGGTATTGTTCTCG-3'）和ActinR（5'-TTC-CCGCTCGGCTGTAGTTGT-3'）用于半定量RT-PCR反應(yīng)。分別提取海州香薷的根、莖和葉的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，以該cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL：10×Ex Taq Buffer（Mg2+plus） 2 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L each）1 μL，PrimerF 1 μL，PrimerR 1 μL，cDNA 1 μL，Ex Taq 0.2 μL，ddH2O 13.8 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，28個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取

海州香薷根中的總RNA經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1）顯示，呈現(xiàn)3條清晰的條帶，其中28S rRNA的亮度約為18S rRNA的兩倍，5S rRNA亮度較低，無明顯降解，紫外分光光度計(jì)測定RNA樣品OD260/OD280的平均值為1.91，表明所提取的總RNA質(zhì)量較好，可用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

圖1 海州香薷根部總RNA提取

2.2 RT-PCR擴(kuò)增和克隆

以第一鏈cDNA為模板，用引物PrimerF和PrimerR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得一條約550 bp的條帶，與預(yù)期大小相似，將目的條帶進(jìn)行凝膠回收，隨后連接至pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10。從轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑取5個(gè)白斑進(jìn)行菌液PCR檢測，結(jié)果（圖2）表明5個(gè)均為陽性克隆。

圖2 陽性克隆的PCR鑒定

2.3 測序結(jié)果與序列分析

將5個(gè)克隆進(jìn)行測序，其測序結(jié)果完全一致，得到576 bp的序列，編碼192個(gè)氨基酸（圖3）。Blast結(jié)果表明，海州香薷與其他植物Actin基因的核苷酸序列相似性為78%-91%，氨基酸序列相似性為84%-97%，其中與唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza）（GenBank：ADK11998）的相似性最高，達(dá)97%。將EhACT與其他8種植物Actin基因的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)（圖4），EhACT具有153個(gè)保守氨基酸，非保守氨基酸為38個(gè)，表明所克隆的序列片段為Actin基因片段，將其命名為EhACT，在GenBank中提交序列，獲得登錄號(hào)AGT37260。

圖3 海州香薷Actin基因片段的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

2.4 Actin基因的組織表達(dá)分析

通過特異性引物ActinF和ActinR克隆海州香薷不同組織中的Actin基因片段，將目的片段進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果顯示其長度為184 bp，屬于EhACT基因序列。半定量RT-PCR分析結(jié)果（圖5）顯示，海州香薷Actin基因在根、莖和葉組織中的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，不具有組織表達(dá)特異性。

3 討論

本研究通過同源克隆方法分離得到海州香薷的Actin基因片段序列，序列分析結(jié)果表明EhACT與其他植物Actin基因的序列相似性較高，氨基酸序列高度保守，表明所克隆的序列為Actin基因片段序列。大量研究表明，Actin基因在核苷酸和氨基酸水平都具有高度的保守性和同源性［9-11］，這種高度保守性是由于植物肌動(dòng)蛋白起源于一個(gè)共同祖先，在進(jìn)化過程中通過復(fù)制和變異而被保留下來［12，13］。因此，Actin基因在植物生命活動(dòng)過程中起著十分重要的作用，克隆海州香薷的Actin基因?qū)τ谡J(rèn)識(shí)海州香薷在銅脅迫環(huán)境下的進(jìn)化過程也具有重要意義。Actin基因的重要性不僅表現(xiàn)在生命活動(dòng)過程中，且由于該基因的表達(dá)屬于組成型表達(dá)，在研究其他基因的表達(dá)調(diào)控過程中也起著重要作用。

圖4 海州香薷Actin基因氨基酸序列片段與其他植物Actin基因的氨基酸序列多重比對(duì)

圖5 海州香薷Actin基因的組織表達(dá)

植物基因表達(dá)分析研究中比較常用的內(nèi)參對(duì)照基因即管家基因主要有肌動(dòng)蛋白基因（ACT）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（G3PDH/GAPDH）、18S和 28S核糖體RNA基因（18S rRNA、28S rRNA）及肽鏈延伸因子（ef1-α）基因等［14-16］。其中肌動(dòng)蛋白是真核細(xì)胞中主要的胞質(zhì)微絲骨架組分之一，是植物基因表達(dá)研究中廣泛使用的內(nèi)參基因［17-19］。雖然上述管家基因一直被作為內(nèi)參基因來標(biāo)準(zhǔn)化目的基因，但最近許多研究表明，不同管家基因在不同細(xì)胞類型和不同生理狀態(tài)下的表達(dá)并不是恒定不變的，如Xu等［20］分析了GAPDH、ACT、TUA、TUB、18SrRNA、RPII、EF-1b和TEF2基因在蘿卜不同組織、品種和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)穩(wěn)定性，其中只有ACT、RPII 和TEF2基因的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，可作為內(nèi)參基因。Podevin等［21］通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了芭蕉（Musa）GAPDH等9個(gè)基因的表達(dá)，結(jié)果表明只有EF1、TUB 和ACT可以在不同組織穩(wěn)定表達(dá)。因此，在基因表達(dá)研究中需選擇合適的管家基因作為內(nèi)參基因，本試驗(yàn)克隆了一條576 bp長的海州香薷Actin基因片段，并通過半定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)其在不同組織部位的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，初步表明其可作為內(nèi)參基因，為研究其他基因特別是重金屬抗性相關(guān)基因在海州香薷體內(nèi)的表達(dá)和調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。本試驗(yàn)僅研究了EhACT基因的組織表達(dá)特異性，其他管家基因在不同條件下是否能夠穩(wěn)定表達(dá)，以及與EhACT基因相比是否更加穩(wěn)定，還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

4 結(jié)論

本研究通過同源克隆得到海州香薷Actin基因片段（EhACT，GenBank登錄號(hào)AGT37260），片段長576 bp，編碼192個(gè)氨基酸，與其他植物同源基因的氨基酸序列相似性為84%-97%。半定量RT-PCR分析結(jié)果表明EhACT在海州香薷的根、莖和葉中表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，可作為研究海州香薷基因表達(dá)的內(nèi)參基因。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning and Expression Analysis of Actin Gene Gragment from Elsholtzia haichowensis

Cai Shenwen1Xiong Zhiting2Liu Chen2Xu Zhongrui2Deng Songqiang2
（1. School of Resource and Environment，Zunyi Normal College，Zunyi 563002；2. School of Resource and Environmental Sciences，Wuhan University，Wuhan 430079）

Cloning and expression analysis of Actin gene fragment from Elsholtzia haichowensis would provide foundation for the study of gene expression and regulation of heavy metal resistance related genes. Degenerate primers were designed based on the conserved sequences of the Actin genes from other plants. Total RNA was extracted from the root of E. haichowensis. An Actin gene fragment was separated by reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）. The sequence analysis results revealed that Actin gene fragment from E. haichowensi contains 576 bp， encoding a protein of 192 amino acids. Homology comparison with other plants Actin gene sequences in the GenBank showed that it shared 84%-97% amino acid sequence homology with other plants. The cloned sequence was Actin gene fragment. It was named as EhACT and was registered into GenBank（accession number：AGT37260）. Semi-quantitative PCR assays indicated that the expression of EhACT in root， stem and leaf of E. haichowensis was relatively stable， suggesting that EhACT can be used as the reference to analyze the gene expression in E. haichowensis.

Elsholtzia haichowensis；Actin gene；cloning；expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.016

2014-07-17

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30870365，31270432）

蔡深文，男，博士，講師，研究方向：環(huán)境生物學(xué)；E-mail：caishenwen@163.com