李田 孫景寬 劉京濤

（濱州學(xué)院 山東省黃河三角洲生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濱州 256603）

植物啟動(dòng)子研究進(jìn)展

李田 孫景寬 劉京濤

（濱州學(xué)院 山東省黃河三角洲生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濱州 256603）

植物啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，對其功能進(jìn)行研究不僅可以反映相應(yīng)基因的表達(dá)模式，還能為利用植物基因工程手段實(shí)現(xiàn)基因的高效特異性表達(dá)提供有效途徑。結(jié)合近年來的相關(guān)研究，綜述了植物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其功能研究進(jìn)展，重點(diǎn)對與生物和非生物脅迫有關(guān)的各類誘導(dǎo)型啟動(dòng)子進(jìn)行了闡述，并展望了植物啟動(dòng)子的未來研究方向。

植物啟動(dòng)子；誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；生物和非生物脅迫

基因工程在實(shí)現(xiàn)重要作物遺傳性狀的改良中較傳統(tǒng)植物育種具有較大的優(yōu)勢。特別是通過基因工程手段可同時(shí)引入兩個(gè)或多個(gè)基因以此實(shí)現(xiàn)植物多種性狀的改良，縮短育種時(shí)間，因此自該技術(shù)誕生以來一直被廣泛應(yīng)用于植物研究領(lǐng)域?；蚬こ碳夹g(shù)作為改良植物性狀的有效途徑，其中加強(qiáng)對植物轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控研究一直是該研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。

轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控在植物基因調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，涉及多種順式作用元件和反式作用因子。啟動(dòng)子（Promoter）是一類與啟動(dòng)基因表達(dá)相關(guān)的順式作用元件，通過與特定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，控制基因轉(zhuǎn)錄的起始與表達(dá)?；虻谋磉_(dá)可受轉(zhuǎn)錄、翻譯等不同水平上的調(diào)控，因此，啟動(dòng)子作為轉(zhuǎn)錄水平上重要的調(diào)控元件，在基因工程領(lǐng)域開發(fā)和利用高效特異的啟動(dòng)子具有重要的研究意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 植物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)特征

啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)可影響它與RNA聚合酶II的識(shí)別、結(jié)合，從而影響基因表達(dá)的水平。研究表明，正是由于啟動(dòng)子中包含的各種特征性元件保證了轉(zhuǎn)錄過程的有效進(jìn)行。對于一個(gè)典型啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)特征通常包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、TATA-box、 CAAT-box、GC-box，以及位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)較遠(yuǎn)位置的增強(qiáng)子、沉默子等元件。

植物中啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)通常位于-193--9 bp之間，其保守序列為CTCATCA，且前導(dǎo)序列富含A+T。研究發(fā)現(xiàn)水稻ZB8基因啟動(dòng)子中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的堿基改變會(huì)影響轉(zhuǎn)錄過程［1］。此外，高等植物的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的帽子結(jié)構(gòu)對于轉(zhuǎn)錄起始也具有關(guān)鍵作用［2］。植物啟動(dòng)子的核心元件TATA-box是絕大多數(shù)植物啟動(dòng)子正確表達(dá)所必需的，位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-30--25 bp處，主要控制轉(zhuǎn)錄的精確起始，不同基因的TATA-box不僅共有序列存在差異，而且所包含的數(shù)目也不相同。除了上述核心元件，植物啟動(dòng)子中包含的一般上游元件對于啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性也具有重要作用。CAAT-box和GC-box的作用主要是控制轉(zhuǎn)錄起始的頻率，但CAAT-box相比后者對轉(zhuǎn)錄起始頻率的影響更大。其中CAAT-box位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游約-100--80 bp處，除影響轉(zhuǎn)錄起始頻率外，該元件對兩個(gè)方向都有激活作用，且作用距離不定［3］。目前發(fā)現(xiàn)可與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子有CTFl、CTF2和CEBP等。對于少數(shù)無TATA-box的真核基因，其啟動(dòng)子序列通常富含GC-box。GC-box位于-110--80 bp處，其核心序列為GCCACACCC或GGGCGGG，且一般為多拷貝，其功能的發(fā)揮不受序列方向的影響，目前發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子SPl與之結(jié)合后才能發(fā)揮作用。此外，在真核基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游或下游，一般具有長度為100-200 bp的增強(qiáng)子序列，其核心組件10 bp左右，可增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的水平，如在35S啟動(dòng)子-393 bp和-90 bp之間就發(fā)現(xiàn)了具有增強(qiáng)基因表達(dá)的增強(qiáng)子序列［4］。沉默子是一段可以降低或關(guān)閉基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列，其作用的發(fā)揮不受序列方向及距離遠(yuǎn)近的影響，目前有關(guān)沉默子具體作用序列的研究還很少。

2 組成型啟動(dòng)子的研究

組成型啟動(dòng)子的基因表達(dá)不具組織和時(shí)間特異性，外界因素對組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)的外源基因表達(dá)幾乎沒有影響。目前常用的CaMV35S、水稻肌動(dòng)蛋白（ActinI）啟動(dòng)子、玉米泛素（Ubiquitin）啟動(dòng)子等均屬于這一類型。其中，CaMV35S啟動(dòng)子最早在煙草花葉病毒中發(fā)現(xiàn)，對它的研究已經(jīng)十分清楚，不僅指出其基本結(jié)構(gòu)包括TATA-BOX、CAATBOX、反向重復(fù)序列及增強(qiáng)子核心序列，還對啟動(dòng)子不同區(qū)段的具體功能進(jìn)行了詳細(xì)劃分［5］。目前為止，CaMV35S啟動(dòng)子已成為植物表達(dá)載體構(gòu)建中最常用的啟動(dòng)子之一，由于該啟動(dòng)子在雙子葉植物中具有高效表達(dá)的特點(diǎn)，且能在所有細(xì)胞和任何時(shí)候進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，因此對于獲得大量的外源蛋白來說具有很大的優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用于啟動(dòng)外源基因的表達(dá)。除了這一最為常用的CaMV35S啟動(dòng)子之外，從木爾坦棉花曲葉病毒（CLCuMV）中分離到CLCuMVC1基因啟動(dòng)子，其活性是CaMV35S啟動(dòng)子的3-5倍，且?guī)缀蹩稍谵D(zhuǎn)基因植株中的任何部位表達(dá)，因此是一類極具應(yīng)用潛能的組成型強(qiáng)啟動(dòng)子［6］。

但CaMV35S啟動(dòng)子在單子葉植物中的啟動(dòng)活性很低，因此人們又開發(fā)利用了適于單子葉植物高效表達(dá)的水稻ActinI啟動(dòng)子和玉米Ubiquitin啟動(dòng)子等，其中玉米中采用Ubiquitin啟動(dòng)子啟動(dòng)CAT基因的表達(dá)比采用35S啟動(dòng)的基因表達(dá)效率高出10倍［7，8］。此外，Lu等［9］還從水稻中分離到新的rubi3啟動(dòng)子，并對該啟動(dòng)子及其5'-UTR的內(nèi)含子序列的啟動(dòng)活性進(jìn)行了研究，該啟動(dòng)子使基因在各個(gè)組織中表達(dá)，且啟動(dòng)活性高于玉米中發(fā)現(xiàn)的Ubi-1啟動(dòng)子，因此是一類在單子葉植物中極具應(yīng)用價(jià)值的強(qiáng)效組成型啟動(dòng)子。

3 組織特異性啟動(dòng)子的研究

組織特異性啟動(dòng)子除包含應(yīng)有的一般啟動(dòng)子元件外，還具有增強(qiáng)子以及沉默子的特性，該類啟動(dòng)子的優(yōu)點(diǎn)在于可啟動(dòng)基因在植物組織特定部位的表達(dá)，避免外源基因的不必要表達(dá)，從而節(jié)約植物體的整體能量消耗。因此，通過采用不同的組織特異性啟動(dòng)子可實(shí)現(xiàn)外源基因在植物不同器官與組織中的表達(dá)。

目前已經(jīng)分離到許多可在植物營養(yǎng)器官中表達(dá)的啟動(dòng)子。例如，可在火炬松維管組織中特異性表達(dá)的啟動(dòng)子PAL，通過對特定區(qū)段的缺失突變發(fā)現(xiàn)PtaPAL啟動(dòng)子區(qū)的-897 bp--420 bp可在次生木質(zhì)部中特異表達(dá)，并通過EMSA技術(shù)證明位于-897--674 bp的順式作用元件AC可與火炬樹中來源于木質(zhì)部的蛋白發(fā)生特異性結(jié)合［10］。此外，還發(fā)現(xiàn)了許多可以在植物維管組織中的韌皮部特異性表達(dá)的啟動(dòng)子，如柑橘韌皮部蛋白基因（CsPP）啟動(dòng)子、擬南芥韌皮部基因（AtPP2）啟動(dòng)子、擬南芥蔗糖運(yùn)輸基因（AtSUC2）啟動(dòng)子［11］。Zhang等［12］通過將Athspr與GUS和GFP報(bào)告基因融合表明這一啟動(dòng)子主要啟動(dòng)基因在植物維管組織中的特異性表達(dá)，且通過與37個(gè)維管組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，這類啟動(dòng)子中均包括植物激素應(yīng)答元件、光反應(yīng)元件、生物和非生物脅迫響應(yīng)元件以及組織特異性表達(dá)元件。此外，研究表明單子葉植物水稻中的Ca2+-ATPase啟動(dòng)子全長具有維管組織表達(dá)特異性，其不同區(qū)段的缺失突變試驗(yàn)表明，該啟動(dòng)子還可對干旱、高鹽、病原菌等多種脅迫予以響應(yīng)［13］。

此外，分離獲得有效的可在植物繁殖器官特異表達(dá)的啟動(dòng)子對于以收獲果實(shí)和種子為主的作物來說具有重要意義，目前有關(guān)這類啟動(dòng)子的研究也較為廣泛。從大豆中分離得到的在果實(shí)和花組織特異性表達(dá)的Msg啟動(dòng)子主要啟動(dòng)基因在植物的蜜腺、長角果保衛(wèi)細(xì)胞以及花柄部位表達(dá)，在成熟葉片中未見表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)位于啟動(dòng)子區(qū)約650 bp的TATA區(qū)與其組織特異性表達(dá)無關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)與之前認(rèn)為組織特異性元件一般位于TATA框附近的研究結(jié)論存在差異［14］。單子葉植物中也存在大量組織特異性啟動(dòng)子，如從大麥中分離到的Lem1啟動(dòng)子，通過構(gòu)建該啟動(dòng)子的GFP融合蛋白表達(dá)載體，表明該啟動(dòng)子主要啟動(dòng)基因在大麥的外稃和內(nèi)稃中表達(dá)，而在其他營養(yǎng)組織或大麥成熟期則不表達(dá)。缺失試驗(yàn)表明，這種基因組織特異性表達(dá)是由距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)80 bp內(nèi)的一個(gè)順式作用元件決定的。除此之外，啟動(dòng)子上游還存在生長素、乙烯和赤霉素激素響應(yīng)元件［15］。近期發(fā)現(xiàn)的豇豆儲(chǔ)藏蛋白基因8SGα啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下的GUS酶活活性是CaMV35s啟動(dòng)子活性的2-4倍，且該啟動(dòng)子具有種子表達(dá)特異性，因此可作為種子生物反應(yīng)器的高效特異啟動(dòng)子來應(yīng)用［16］。

4 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的研究

植物為更好的適應(yīng)自然環(huán)境，保持正常生長，還形成了某些特異的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，這類啟動(dòng)子正常生長條件下啟動(dòng)活性很低甚至不啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，但受到外界脅迫時(shí)，又可高效的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。

目前發(fā)現(xiàn)的這類啟動(dòng)子有很多。其中有關(guān)鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子方面，擬南芥中的rd29A是較早發(fā)現(xiàn)的一個(gè)可被鹽等非生物脅迫誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，將該啟動(dòng)子與GFP融合表達(dá)，在高鹽和干旱脅迫條件下GFP蛋白較35S驅(qū)動(dòng)下的表達(dá)要強(qiáng)［17］。CAM基因被認(rèn)為與植物的耐鹽性相關(guān)，為此人們在不同物種中對這一基因的啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行了研究，如Schaeffer等［18］克隆了鹽生植物冰花中CAM基因的啟動(dòng)子序列，并對鹽脅迫下啟動(dòng)子區(qū)的增強(qiáng)區(qū)和沉默區(qū)進(jìn)行了研究。此外，從大豆中分離到GmCaM基因的啟動(dòng)子序列，缺失突變試驗(yàn)結(jié)果表明該啟動(dòng)子的鹽脅迫響應(yīng)順式作用元件位于-858--728 bp處，在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建不同缺失區(qū)段的GUS報(bào)告基因表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)基因煙草試驗(yàn)表明在NaCl（150 mmol/L）和病原菌脅迫后GUS酶活約為35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)活性的4倍，EMSA試驗(yàn)進(jìn)一步證明啟動(dòng)子區(qū)的A2（-1207--1128 bp）和 C1（-858--728 bp）可與鹽和病原脅迫后大豆中的核蛋白形成緊密復(fù)合物，從而發(fā)揮啟動(dòng)功能［19］。甜菜堿醛脫氫酶（BADH）基因啟動(dòng)子也是一類鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如從鹽生植物中亞濱藜（Atriplex centralasiatica）中分離到的BADH基因啟動(dòng)子，以及從遼東櫟中克隆到的BADH啟動(dòng)子均被證明是一類強(qiáng)效鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)表明隨著鹽濃度的增加啟動(dòng)子各區(qū)段的GUS染色也越深［20，21］。pib基因啟動(dòng)子也被認(rèn)為具有鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)活性，該類啟動(dòng)子含有鹽誘導(dǎo)GAAAAA元件，將其與GUS基因相連后，轉(zhuǎn)基因植株的GUS酶活在鹽脅迫后增加［22］。堿蓬和莧菜CMO基因啟動(dòng)子也可被鹽脅迫誘導(dǎo)，其中堿蓬CMO基因啟動(dòng)子中的鹽誘導(dǎo)GAAAAA元件在增強(qiáng)植物耐鹽性中具有重要作用［23］。而在全長約1 600 bp的AmCMO啟動(dòng)子中，發(fā)現(xiàn)其上游區(qū)段410 bp處的啟動(dòng)子在鹽脅迫下GUS活性最強(qiáng)，因此認(rèn)為AmCMO啟動(dòng)子的鹽誘導(dǎo)活性主要與該區(qū)段中的鹽響應(yīng)順式作用元件有關(guān)［24］。

在單子葉水稻中克隆到的鹽誘導(dǎo)啟動(dòng)子有Rab16A啟動(dòng)子和OsDREB1B啟動(dòng)子。其中Rab16A啟動(dòng)子只在鹽脅迫下才可被誘導(dǎo)表達(dá)，而OsDREB1B啟動(dòng)子則可受鹽、ABA、PEG非生物脅迫及其他生物脅迫的誘導(dǎo)［25］。此外，在小麥和大麥中也發(fā)現(xiàn)了部分耐鹽啟動(dòng)子，其中小麥中的Ttd1a啟動(dòng)子可受NaCl和光誘導(dǎo)，該啟動(dòng)子很可能通過CAAT元件與DNA結(jié)合蛋白相結(jié)合發(fā)揮作用［26］，而來源于大麥HAV22基因的ABRC1啟動(dòng)子則可顯著提高轉(zhuǎn)ABRC1-CBF1番茄的耐鹽性［27］。

近期從白骨壤中克隆到AmMYB1基因的啟動(dòng)子，通過轉(zhuǎn)基因植株GUS染色證明其啟動(dòng)活性與鹽誘導(dǎo)相關(guān)，序列分析發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子區(qū)不僅含有脅迫響應(yīng)順式元件ABRE，還具有一個(gè)包含AtRD22-Like順式作用元件的MYB識(shí)別位點(diǎn)（MRS）。上述啟動(dòng)子序列分析表明，鹽脅迫過程中，AmMYB1轉(zhuǎn)錄因子可能通過與自身的順式作用元件結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用，也有可能通過植物自身的其他不同類型的MYB蛋白與MRS位點(diǎn)結(jié)合調(diào)控AmMYB1基因的表達(dá)。此外，該啟動(dòng)子區(qū)還包含一個(gè)與AtRD22相似的MYC位點(diǎn)，其中MRS和MYC均可對外界脅迫刺激予以反應(yīng)［28］。結(jié)合有關(guān)AmMYB1轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證試驗(yàn)，表明該基因在鹽脅迫條件下主要通過調(diào)控與光合作用有關(guān)的基因表達(dá)來增強(qiáng)耐鹽性［29］。

表1 植物中的各類誘導(dǎo)型啟動(dòng)子

除上述鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子外，目前發(fā)現(xiàn)的其他各類誘導(dǎo)型啟動(dòng)子具體見表1。這些轉(zhuǎn)錄因子分別在植物應(yīng)對不同環(huán)境條件（光、干旱、高溫、低溫和激素）等方面發(fā)揮著極其重要的作用。

5 展望

植物中存在多個(gè)水平的基因表達(dá)調(diào)控，其中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控主要受順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子兩方面的協(xié)同調(diào)控。因此加強(qiáng)對高效啟動(dòng)子的開發(fā)利用是目前基因工程領(lǐng)域興起的又一熱點(diǎn)［76］。目前人們得到的各類啟動(dòng)子中，由于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子較組成型啟動(dòng)子而言，其具有在特異環(huán)境條件下表達(dá)的獨(dú)特優(yōu)勢，因此在利用基因工程手段提高植物耐逆性中具有很大的應(yīng)用前景。此外，人們還通過不斷篩選新的具有重要應(yīng)用價(jià)值的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子以滿足某些基因的特異性表達(dá)，而且通過基因改造手段，對已獲得各類型啟動(dòng)子進(jìn)行改造與組合，構(gòu)建出兼有高效表達(dá)和特異性表達(dá)的復(fù)合啟動(dòng)子，如通過將擬南芥組織特異型啟動(dòng)子p85和脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子p87聯(lián)合構(gòu)建的雙向啟動(dòng)子可顯著增加轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草的組織表達(dá)特異性和鹽脅迫誘導(dǎo)特異性［77］。總之，加強(qiáng)對新型啟動(dòng)子的克隆與研究不僅對了解基因的表達(dá)調(diào)控模式具有重要意義，而且對利用基因工程手段提高植物耐逆性同樣具有重要意義。且伴隨著各類啟動(dòng)子克隆方法的發(fā)展，人們克隆得到的各類啟動(dòng)子數(shù)目將會(huì)不斷增加。因此，進(jìn)一步的研究在于深入分析啟動(dòng)子中的重要作用元件的具體序列，以及明確與這些順式作用元件相作用的具體轉(zhuǎn)錄因子，從而為揭示植物耐逆等方面的調(diào)控機(jī)制以及提高外源基因的表達(dá)提供更有效的技術(shù)手段。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Advances on Plant Promoter

Li Tian Sun Jingkuan Liu Jingtao
（Shandong Provincial Key Laboratory of Eco-Environmental Science for Yellow River Delta，Binzhou University，Binzhou 256603）

Plant promoters play important regulatory roles at the transcription level， to study their functions can not only reflect the expression patterns of corresponding genes， but also provide an effective way for the use of plant genetic engineering to achieve efficient expression of specific genes. In this paper， recent studies were reviewed about their structural characteristics and functions， the various types of inducible promoters related to biotic and abiotic stress were mainly introduced， and the future research directions for plant promoters were prospected.

plant promoters；inducible promoters；biotic and abiotic stress

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.02.003

2014-07-19

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31400525），山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2014CQ028），濱州學(xué)院博士基金項(xiàng)目（2014Y06），濱州學(xué)院科研基金項(xiàng)目（BZXYL1306）

李田，女，博士，講師，研究方向：分子生物學(xué)；E-mail：912litian@163.com