袁彩君　朱天新

（1 駐馬店市中心醫(yī)院藥劑科，河南 駐馬店 463000；2 河南欣泰藥業(yè)有限公司，河南 駐馬店 463000）

氣相色譜法測定降纖酶中磷酸三丁酯殘留量

袁彩君1朱天新2

（1 駐馬店市中心醫(yī)院藥劑科，河南 駐馬店 463000；2 河南欣泰藥業(yè)有限公司，河南 駐馬店 463000）

目的 建立毛細(xì)管氣相色譜法測定降纖酶原液中磷酸三丁酯殘留量。方法以磷酸三丙酯作內(nèi)標(biāo)，采用AT-FFAP色譜柱（30 m×0.32 μm× 0.25 mm）；氣化室溫度190 ℃；檢測器溫度210 ℃；柱溫140 ℃；載氣為氮?dú)?。結(jié)果磷酸三丁酯在質(zhì)量濃度2～16 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好；r為0.9973；質(zhì)控樣品在低、中、高3個(gè)濃度下加樣回收率分別為98%、101.3%、100.6%，RSD分別為：1.8%、1.08%、2.51% （n=3）。結(jié)論該方法快速、準(zhǔn)確，適用于降纖酶原液中磷酸三丁酯殘留量的測定。

降纖酶；磷酸三丁酯；殘留量；氣相色譜法；測定

降纖酶是從尖吻蝮蛇毒中提取的蛋白水解酶，能溶解血栓，抑制血栓形成，改善微循環(huán)，臨床用于急性腦梗死、心肌梗死、肺栓塞、突發(fā)性耳聾、血液高凝狀態(tài)、四肢血管病包括股動脈栓塞，血栓閉塞性脈管炎，雷諾氏病的治療［1］。注射用降纖酶屬多組分生化藥注射劑，根據(jù)中國藥典（2010年版）［2］和國家食品藥品監(jiān)督管理局的相關(guān)規(guī)定［3］，河南欣泰藥業(yè)有限公司對其注射用降纖酶采用國際公認(rèn)的S/D滅活法對原料蛇毒中潛在的病毒進(jìn)行滅活，該工藝中所加入的磷酸三丁酯［Tri（nbutyl）phosphate，TNBP］對包膜病毒有顯著的滅活效果［4-5］。但對小鼠的LD50為602 mg/kg［6］，對人體有害，為保證臨床用藥安全，根據(jù)ICH Q3C《雜質(zhì)殘留溶劑指南》［7］，其殘留量應(yīng)控制在10 μg/10單位（注射用降纖酶裝量為1毫升/瓶，規(guī)格為10單位、5單位）以下。本研究利用毛細(xì)管氣相色譜法對注射用降纖酶生產(chǎn)用降纖酶原液TNBP的殘留量進(jìn)行測定，方法準(zhǔn)確可靠。

1　儀器與試藥

GC-122型氣相色譜儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；BHW-2型電熱恒溫水浴箱（上海醫(yī)療器械廠）；80-2B型臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；XW-80A型旋渦混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；注射用降纖酶及其原液（河南欣泰藥業(yè)有限公司，批號20120301、20120302、20120303）；TNBP：Sigma公司，批號Q0662，純度＞99.0%；磷酸三丙酯內(nèi)標(biāo)物（tripropylphasphate，TPP），Dr Ehrenstorfer公司，批號01222，純度99.5%；正己烷，分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20100308；高氯酸，分析純，北京南尚樂化工廠，批號：20100401。注射用水：由河南欣泰藥業(yè)有限公司制備。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件。色譜柱：AT.FFAP型毛細(xì)管色譜柱，30 m×0.32 μm× 0.25 mm；檢測器：氫火焰檢測器。柱溫：140 ℃；氣化室溫度190 ℃；檢測器溫度210 ℃；氮?dú)饬魉伲?0 mL/min。

2.2溶液制備

2.2.1TNBP標(biāo)準(zhǔn)工作液：精密稱取TNBP 100 mg，用正己烷定容至10 mL，得到10 mg/mL TNBP標(biāo)準(zhǔn)儲備液，精密量取TNBP標(biāo)準(zhǔn)儲備液600 μL，用正己烷定容至10 mL。

2.2.2內(nèi)標(biāo)工作液：精密稱取TPP 100 mg，用正己烷定容至10 mL，得到10 mg/mL內(nèi)標(biāo)儲備液，精密量取內(nèi)標(biāo)儲備液400 μL，用正己烷定容至10 mL。

2.2.31.5mol/L高氯酸溶液：吸取高氯酸（71%）12 mL用蒸餾水定容至l00 mL。

2.3樣品、對照品處理方法

2.3.1樣品處理方法：精密量取降纖酶原液或未經(jīng)病毒滅活工序處理的降纖酶溶液，用注射用水稀釋至每毫升約含降纖酶10單位的溶液作為樣品溶液。精密量取樣品溶液3.0 mL，置具塞玻璃離心管中，精密加內(nèi)標(biāo)工作液50 μL與1.5 moL/L高氯酸溶液0.75 mL，振蕩1 min，置37 ℃水浴保溫10 min后，再加正己烷4 mL，振蕩2 min，離心（3000 rpm）20 min，小心吸取上層正己烷，按2.1項(xiàng)下的色譜條件，取1 μL注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。

2.3.2對照品處理方法：取TNBP標(biāo)準(zhǔn)工作液10 μL，置于已精密加入3 mL水的具塞玻璃離心管中，精密加內(nèi)標(biāo)物工作液50 μL，按2.3.1項(xiàng)下自“振蕩1 min”起同法操作。

2.4干擾試驗(yàn)

2.4.1取未經(jīng)病毒滅活處理的降纖酶溶液，用注射用水稀釋至每毫升約含降纖酶10單位的溶液作為樣品溶液，精密量取3.0 mL置具塞玻璃離心管中，精密加1.5 moL/L高氯酸溶液0.75 mL，按2.3.1項(xiàng)下自“振蕩1 min”起同法操作。

2.4.2精密量取2.4.1項(xiàng)制備的樣品溶液3.0 mL置具塞玻璃離心管中，按2.3.1項(xiàng)下自“精密加內(nèi)標(biāo)溶液50 μL與1.5 moL/L高氯酸溶液0.75 mL”起同法操作。

圖1　磷酸三丁酯測定干擾試驗(yàn)色譜圖［①未經(jīng)病毒滅活處理的降纖酶樣品溶液（處理過程中不加TPP和TNBP）；②未經(jīng)病毒滅活處理的降纖酶樣品溶液（處理過程中加入規(guī)定量的TPP，不加TNBP）；③TNBP標(biāo)準(zhǔn)品溶液（每毫升含TNBP 2 μg）；④TNBP與未經(jīng)病毒滅活處理的降纖酶的混合樣品（每毫升含降纖酶10單位、TNBP 2 μg］

圖2　降纖酶原液（經(jīng)病毒滅活處理）的磷酸三丁酯檢測氣相色譜圖

2.4.3精密吸取TNBP標(biāo)準(zhǔn)工作液10 μL，置于已精密加入3 mL水的具塞玻璃離心管中，精密加內(nèi)標(biāo)工作液50 μL，按2.3.1項(xiàng)下自“振蕩1 min”起同法操作。

2.4.4精密量取2.4.1項(xiàng)制備的樣品溶液3.0 mL置具塞玻璃離心管中，另取TNBP標(biāo)準(zhǔn)工作液10 μL置于該管中，按2.3.1項(xiàng)下自“精密加內(nèi)標(biāo)工作液50 μL與1.5 moL/L高氯酸溶液0.75 mL”起同法操作。

結(jié)果見圖1，未經(jīng)病毒滅活處理的降纖酶及樣品處理所用試劑在TPP、TNBP保留時(shí)間范圍內(nèi)無雜質(zhì)峰；TNBP和TPP達(dá)基線分離，分離度達(dá)3.0以上，TNBP峰理論板數(shù)在9000以上。

2.5線性關(guān)系考察：分別精密吸取TNBP標(biāo)準(zhǔn)工作液10、20、40、60、80 μL，分別置已精密加入3 mL水的5支具塞玻璃離心管中，然后分別精密加內(nèi)標(biāo)工作液50 μL，按2.3.1項(xiàng)下自“振蕩1 min”起同法操作.以各TNBP對照品峰面積與TPP內(nèi)標(biāo)峰面積比（Y）對TNBP對照品溶液濃度（X）作直線回歸，得直線回歸方程：Y=0.1474X+0.067，R=0.9973。線性范圍為2～16 μg/mL。

2.6精密度試驗(yàn)：精密吸取TNBP標(biāo)準(zhǔn)工作液10 μL置加有3 mL蒸餾水的具塞玻璃離心管中，然后分別加入內(nèi)標(biāo)工作液50 μL，按2.3.1項(xiàng)下自“振蕩1 min”起同法操作，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算磷酸三丁酯峰面積與磷酸三丙酯峰面積之比值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果RSD為2.6%（n=6）。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.6項(xiàng)下制作的溶液，分別在0、4、8 h測定。三次測定值基本不變，RSD為1.03%（n=3）。

2.8加樣回收試驗(yàn)：精密量取沒有經(jīng)S/D法進(jìn)行病毒滅活的降纖酶溶液適量，用注射用水稀釋至每毫升約含降纖酶10單位的溶液，精密量取該溶液3.0 mL，置3支具塞玻璃離心管中，分別加入TNBP標(biāo)準(zhǔn)工作液20 μL、40 μL、60 μL，然后各管加入內(nèi)標(biāo)工作液50 μL和1.5 mol/L高氯酸溶液0.75 mL，按照2.3.1項(xiàng)中自“振蕩1 min”起同法處理，低、中、高3個(gè)濃度的溶液分別連續(xù)進(jìn)樣3次，計(jì)算加樣回收率，分別為：98%、101.3%、100.6%，RSD分別為：1.8%、1.08%、2.51%。

2.9降纖酶原液，中磷酸三丁酯殘留量測定：精密量取經(jīng)病毒滅活處理的降纖酶原液，用注射用水稀釋成每毫升約含降纖酶10單位的溶液，按2.3.1項(xiàng)下自“精密量取樣品溶液3.0 mL”起同法操作。記錄TNBP和TPP的峰面積，用回歸方程計(jì)算TNBP的殘留量，結(jié)果在經(jīng)病毒滅活處理的降纖酶原液中沒有檢出磷酸三丁酯的殘留。經(jīng)病毒滅活處理的降纖酶原液的色譜圖見圖2。

3　討　論

柱層析純化得到的降纖酶溶液經(jīng)S/D病毒滅活、超濾去除有機(jī)溶劑工序得到降纖酶原液，每毫升降纖酶原液降纖酶含量在200單位以上，蛋白濃度在0.15 mg/mL以上；在2.4項(xiàng)樣品溶液的制備過程中，加入正己烷4 mL，振蕩2 min后乳化嚴(yán)重，乳化程度隨供試品溶液濃度的增加而增加，離心（3000 rpm） 20 min后乳化仍未完全破除，在振蕩器上振搖、再離心效果甚微，僅能吸取少量的上層正己烷溶液，不易按藥典［8］方法將上層正己烷溶液全部取出并用空氣流濃縮至0.2mL。本研究對樣品溶液的前處理工序進(jìn)行簡化，沒有用空氣流將正己烷濃縮，而是吸取上層乳化破除的正己烷溶液直接進(jìn)樣，并適當(dāng)增大進(jìn)樣量（進(jìn)樣量由藥典［8］方法中的0.1 μL提高到1 μL），同樣取得良好的測定結(jié)果。

［1］湯圣希，舒雨雁.蛇毒降纖酶的主要藥理作用［J］.蛇志，1999，11（3）: 1-3.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010版二部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，凡例XIV.

［3］國家食品藥品監(jiān)督管理局.多組分生化藥注射劑基本技術(shù)要求（試行）［S］.國食藥監(jiān)注［2008］7號發(fā)布.

［4］王劍鋒，英志芳，李長貴，等.S/D法滅活血液制劑中脂包膜病毒效果驗(yàn)證的研究［J］.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2008，36（3）:38-41.

［5］趙宜為，常婭莉，王巍，等.S/D滅活血漿內(nèi)脂包膜病毒及病毒滅活血漿的研究［J］.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2004，32（l） :17-19.

［6］Pi?t MP1，Chin S，Prince AM，et al.The use of tri（n-butyl）phosphate detergent mixtures to inactivate hepatitis viruses and human immunodeficiency virus in plasma and plasma's subsequent fractionation［J］.Transfusion，1990，30（7）:591-598.

［7］國家食品藥品監(jiān)督管理局藥品認(rèn)證中心.ICH質(zhì)量管理文件匯編［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:81-95.

［8］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010版三部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，附錄38.

Determination of Residue tri（n-butyl） Phosphate in the Original Solution of Defibrase

YUAN Cai-jun1，ZHU Tian-xin2
（1 Department of Pharmacy，Zhumadian Central Hospital，Zhumadian 463000，China；2 Xintai Pharmaceutical Co.ltd，Zhumadian 463000，China）

Objective To establish a capillary gas chromatography （GC） for the determination of residue tri（n-butyl） phosphate （TNBP） in the original solution of defibrase. Methods Using tripropyl phosphate （TPP） as internal standard，a simple capillary GC method was developed with a AT-FFAP capillary column （30 m×0.32 μm×0.25 mm）；the injection port temperature was 190 ℃；the detector temperature was 210 ℃；column temperature was 140 ℃；the carries gas was high purity nitrogen. Results The linear range of TNBP was 2-16 μg/mL（r=0.9973）. At low，medium and high concentrations，the recovery of TNBP was 98%，101.3%，100.6% respectively，and the RSD was 1.8%，1.08% and 2.51% （n=3） respectively. Conclusion The methods is simple，precise and accurate，and can be used to determine residue of TNBP in the original solution of defibrase.

Defibrase；Tri（n-butyl） phosphate（TNBP）；Residue；Gas chromatography；Assay

R9

B

1671-8194（2015）22-0056-02